2.2. Determination of GTE constitue

2.2. Determination of GTE constituents

2.2.1. Determination of total polyphenols

The total phenolic content of extract was estimated using the Folin–Ciocalteu colorimetric procedure [18]. Quantification was done on the basis of a standard curve with (+)-catechin (concentration span 1–10 μg/ml) and result was expressed as catechin equivalents (mg CE/g extract) per g of sample (average value of 5 probes ± standard error).

2.2.2. Determination of total tannins

Total tannins content was determined by the same Folin–Ciocalteu procedure after addition of insoluble matrix — polyvinylpolypyrrolidone [18]. Tannins content was measured as the reduction in phenolics that occur when a binding agent (polyvinyl polypyrrolidone, PVPP) is added to the extract. The assay was carried out with clear supernatant and result was also expressed as mg CE/g of sample (average value of 5 probes ± standard error).

2.2.3. Determination of total flavonoids

The content of total flavonoids was determined spectrophotometrically in GTE according to aluminum chloride method described by Lamaison and Carnat [15]. Quantification was performed using a standard curve with rutin (concentration span 1–5 μg/ml). The result was expressed as mg rutin equivalents (mg Ru/g extract) per g of sample as average value of 5 probes ± standard error.

2.3. Animals

Wistar albino rats of either sex, weighting 200–250 g were selected for this study. The animals were obtained from vivarium of Medical faculty, University of Niš. They were kept inside a well-ventilated room under environmentally controlled conditions. Room temperature was 20 ± 2 °C and the light/dark cycle was 12/12 h. Rodent chew diet and water were available to them ad libitum. Experimental protocols were done in accordance with the declaration of Helsinki and European Community guidelines for the ethical handling of laboratory animals (EEC Directive of 1986; 86/609/EEC) and approved by the Animal Ethics Board of the Medical Faculty in Nis. It was documented under number 01-2625-8.

2.4. Experimental procedure

The animals were divided into four groups of 8 animals each. The first 8 animals served as control (C group) and received 1 ml of saline solution per day intraperitoneally for 8 days. The green tea (GT) group orally received 300 mg/kg/day of GTE for 15 days using an intragastric enteral feeding protocol [20]. Nephrotoxicity in GM group was induced by intraperitoneal administration of GM (Actavis company, Leskovac, Serbia) 100 mg/kg/day for the last 8 days of experiment. The green tea and gentamicin group (GT + GM) was treated orally with green tea 300 mg/kg/day for 15 days. For the last 8 days of experiment simultaneously with green tea, intraperitoneal injection of GM (100 mg/kg/day) was given. At the end of the experiment, all animals were anesthetized using 80 mg/kg ketamine (Ketamidor 10%, Richter Pharma AG, Wels, Austria) and sacrificed. Blood samples for biochemical analysis were taken from the aorta (2 ml) and analyzed as markers of the acute renal failure. The kidney was subsequently removed and separated into two parts for biochemical analysis and light microscopic examination.

2.5. Homogenates preparation

Removed kidneys were cut into small pieces and homogenized in ice cold water using homogenizer (IKA® Works do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, Brasil). A 10% (w/v) homogenate was centrifuged at 1500 g for 10 min at 4 °C to remove cell debris. The supernatant was saved and stored at − 20 °C for the biochemical analysis.

2.6. Histological analysis

Kidney tissue was fixed in 10% paraformaldehyde, dehydrated in ascending graded series of alcohol and embedded in paraffin. Tissue samples were cut into slices of 5 μm thickness using a Histo Range microtome (model: LKB 2218, LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden) and stained with hematoxylin and eosin (HE) and Periodic Acid Schiff (PAS) for light microscopic examination. Histological sections were examined and photographed on a light microscope Leica DMR (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany).

2.7. Determination of protein oxidation

The concentration of advanced oxidation protein products (AOPP), as a marker of oxidative modified proteins and also inflammation, was determined. The concentration of proteins was measured according to Lowry's method [17], using bovine serum as standard. Spectrophotometric method based on the reaction of AOPP with potassium iodide in an acidic medium was used to measure the levels of AOPP. The intensity of color was recorded instantly at 340 nm. The values were expressed in μmol/mg of protein.

2.8. Determination of catalase activity

Tissue catalase (CAT) activity was determined according to Goth [12]. The method is based on the ability of catalase to dissolve the substrate (H2O2), whereby enzymatic reaction is stopped by the addition of ammonium molybdate. Yellow complex of molybdate and H2O2 was measured at 405 nm and enzyme activity was expressed in catalytic units per gram of protein (kU/g).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. การกำหนดองค์ประกอบ GTE2.2.1. กำหนดรวมโพลีฟีนเนื้อหาฟีนอรวมของสารสกัดได้ประมาณตอนท่อง – Ciocalteu เคียง [18] นับเสร็จตามรูปแบบกราฟมาตรฐาน (+) -คาเตคินใน (ความเข้มข้นช่วง 1 – 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นรายการเทียบเท่าคาเตคินใน (มก.สารสกัดจาก CE/g) ต่อกรัมของตัวอย่าง (ค่าเฉลี่ยของข้อผิดพลาดมาตรฐาน± 5 หัว)2.2.2. กำหนดชิมทั้งหมดกำหนดเนื้อหารวมชิม โดยท่อง – Ciocalteu กระบวนการเดียวกันจากเมทริกซ์ที่ไม่ละลายน้ำ — polyvinylpolypyrrolidone [18] มีวัดเนื้อหาชิมเป็นการลดใน phenolics ที่เกิดขึ้นเมื่อตัวแทนรวม (โพลีไวนิล polypyrrolidone, PVPP) เพิ่มสารสกัด ทดสอบการดำเนินการกับ supernatant ชัดเจน และยังถูกแสดงผลเป็น mg CE/กรัม ของตัวอย่าง (ค่าเฉลี่ยของข้อผิดพลาดมาตรฐาน± 5 หัว)2.2.3 การกำหนดรวมฟลาเนื้อหาของฟลารวมพิจารณา spectrophotometrically ใน GTE ตามอลูมิเนียมคลอไรด์วิธีอธิบาย โดย Lamaison และ Carnat [15] นับถูกดำเนินการโดยใช้กราฟมาตรฐาน มี rutin (ความเข้มข้นช่วง 1-5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นเทียบเท่า rutin มิลลิกรัม (Ru/g แยกมิลลิกรัม) ต่อกรัมของตัวอย่างเป็นค่าเฉลี่ยของข้อผิดพลาดมาตรฐาน± 5 หัว2.3. สัตว์หนูเผือก Wistar ทั้งเพศ น้ำหนัก 200 – 250 กรัมถูกเลือกสำหรับการศึกษานี้ สัตว์ได้รับจากสิเดนส์ของคณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัย Niš พวกเขาถูกเก็บไว้ภายในห้องมีอากาศถ่ายเทภายใต้เงื่อนไขการควบคุมสิ่งแวดล้อม เป็นอุณหภูมิ 20 ± 2 ° C และวงจรแสงสว่าง/มืดถูก h. 12/12 หนูเคี้ยวอาหาร และน้ำได้จะได้ ad libitum โปรโตคอลการทดลองทำตามปฏิญญาเฮลซิงกิและประชาคมยุโรปแนวทางการจัดการจริยธรรมของห้องปฏิบัติการสัตว์ (1986 คณะ EEC, 86/609/EEC) และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ของคณะแพทย์ศาสตร์ใน Nis มีบันทึกภายใต้หมายเลข 01-2625-82.4 การขั้นตอนที่ทดลองสัตว์ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม 8 สัตว์ สัตว์ 8 ก่อนเป็นควบคุม (กลุ่ม C) และรับ 1 มิลลิลิตรของเกลือต่อวันสำหรับ 8 วัน intraperitoneally กลุ่มชาเขียว (GT) วาจารับ 300 มิลลิกรัม/กิโลกรัม/วัน GTE 15 วันโดยใช้การให้อาหาร enteral intragastric โพรโทคอล [20] Nephrotoxicity ในกลุ่ม GM ถูกเหนี่ยวนำ โดยจัดการ intraperitoneal กรัม (บริษัท Actavis, Leskovac เซอร์เบีย) 100 มิลลิกรัม/กิโลกรัม/วันสำหรับ 8 วันสุดท้ายของการทดลอง สีเขียวชาและ gentamicin กลุ่ม (GT + GM) ได้รับการรักษารับประทานกับชาเขียว 300 มิลลิกรัมกิโลกรัมวัน 15 วัน สำหรับ 8 วันสุดท้ายของการทดลองพร้อมกับชาเขียว ฉีด intraperitoneal กรัม (100 มิลลิกรัมกิโลกรัมวัน) ให้ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง สัตว์ทั้งหมดถูกด้วยใช้คีตามีน 80 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม (Ketamidor 10% เอ จี Richter เวลส์ ออสเตรีย) และเสียสละ เลือดตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมีถูกนำมาจากโลหิต (2 ml) และวิเคราะห์เป็นเครื่องหมายของภาวะไตวายเฉียบพลัน ไตออกมา และแยกออกเป็นสองส่วนสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมีและตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง2.5 เตรียม Homogenatesเอาไตถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ แล้ว homogenized ในน้ำแข็งน้ำใช้ homogenizer (ทำงาน®สควิด Brasil Ltda ริโอเดอจาเนโร บราซิล) Homogenate 10% (w/v) ถูกเหวี่ยงที่ 1500 กรัมสำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 ° C เพื่อเอาเศษเซลล์ Supernatant ถูกบันทึก และเก็บไว้ที่− 20 ° C สำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมี2.6 ลักษณะวิเคราะห์เนื้อเยื่อไตถูกแก้ไขใน 10% paraformaldehyde อบแห้งในชุดน้อยจัดระดับของแอลกอฮอล์ และฝังตัวในพาราฟิน ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกตัดเป็นชิ้นความหนาμ m 5 ใช้ microtome ช่วง Histo (รุ่น: LKB 2218, LKB Produkter AB บร็อมมา สวีเดน) และการย้อมสี hematoxylin eosin (เขา) และธาตุกรดเตอรองท์ชิฟฟ์ (PAS) สำหรับตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง ส่วนลักษณะการตรวจสอบ และถ่ายภาพในกล้องจุลทรรศน์แสง DMR ไลก้า (ไลก้า Microsystems AG, Wetzlar เยอรมนี)2.7 การกำหนดออกซิเดชั่นของโปรตีนพิจารณาความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์โปรตีนออกซิเดชันขั้นสูง (AOPP), เป็นเครื่องหมายช่วยเปลี่ยนโปรตีนและอักเสบ มีวัดความเข้มข้นของโปรตีนตามวิธีการของของประเทศ [17], การใช้ซีรั่มวัวเป็นมาตรฐาน วิธี spectrophotometric ตามปฏิกิริยาของ AOPP กับโพแทสเซียมไอโอไดด์ในสื่อเป็นกรดถูกใช้เพื่อวัดระดับของ AOPP ความเข้มของสีถูกบันทึกทันทีที่ 340 nm ค่าถูกแสดงในไมโครโมลและมิลลิกรัมโปรตีน2.8. กำหนดกิจกรรม catalaseกิจกรรม catalase (CAT) เนื้อเยื่อที่ถูกกำหนดตามชาวเยอรมัน [12] วิธีการเป็นไปตามความสามารถของ catalase การละลายพื้น (H2O2), โดยหยุดปฏิกิริยาเอนไซม์ โดยการเพิ่มของแอมโมเนีย molybdate มีวัดเชิงเหลือง molybdate และ H2O2 ที่ 405 nm และเอนไซม์ถูกแสดงในหน่วยเร่งต่อกรัมของโปรตีน (เขต g)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 ความมุ่งมั่นขององค์ประกอบ GTE 2.2.1 ความมุ่งมั่นของโพลีฟีรวมเนื้อหาฟีนอลรวมของสารสกัดเป็นที่คาดกันใช้ Folin-Ciocalteu ขั้นตอนการสี [18] ปริมาณที่ได้กระทำบนพื้นฐานของเส้นโค้งกับมาตรฐาน (+) - catechin (ช่วงความเข้มข้น 1-10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) และผลที่ได้รับแสดงเป็นเทียบเท่า catechin (MG CE / สารสกัดกรัม) ต่อกรัม (ค่าเฉลี่ยของ 5 ฟิวส์ ±ข้อผิดพลาดมาตรฐาน). 2.2.2 ความมุ่งมั่นของแทนนินที่รวมเนื้อหาแทนนินทั้งหมดถูกกำหนดโดยขั้นตอนเดียว Folin-Ciocalteu หลังจากที่นอกเหนือจากเมทริกซ์ที่ไม่ละลายน้ำ - polyvinylpolypyrrolidone [18] เนื้อหาแทนนินที่วัดเป็นการลดลงของฟีนอลที่เกิดขึ้นเมื่อผูกพัน (polypyrrolidone โพลีไวนิล, PVPP) ตัวแทนจะถูกเพิ่มสารสกัด การทดสอบได้ดำเนินการกับสารละลายที่ชัดเจนและผลก็ยังแสดงเป็น CE มิลลิกรัม / กรัม (ค่าเฉลี่ยของ 5 probes ±ข้อผิดพลาดมาตรฐาน). 2.2.3 ความมุ่งมั่นของ flavonoids รวมเนื้อหาของ flavonoids ทั้งหมดถูกกำหนด spectrophotometrically ใน GTE ตามวิธีคลอไรด์อลูมิเนียมอธิบายโดย Lamaison และ Carnat [15] ปริมาณที่ได้ดำเนินการโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานที่มีรูติน (ช่วงความเข้มข้น 1-5 ไมโครกรัม / มล.) ผลที่ได้แสดงเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่ารูติน (MG Ru / g Extract) ต่อกรัมของกลุ่มตัวอย่างเป็นค่าเฉลี่ย 5 probes ±ข้อผิดพลาดมาตรฐาน. 2.3 สัตว์วิสตาร์หนูเผือกของทั้งสองเพศ, น้ำหนัก 200-250 กรัมได้รับการคัดเลือกในการศึกษานี้ สัตว์ที่ได้รับจากสวนสัตว์ป่าคณะแพทย์มหาวิทยาลัยNiš พวกเขาจะถูกเก็บไว้ภายในห้องที่ระบายอากาศได้ดีภายใต้สภาวะควบคุมสิ่งแวดล้อม อุณหภูมิห้อง 20 ± 2 องศาเซลเซียสและแสง / รอบมืด 12/12 ชั่วโมง หนูเคี้ยวอาหารและน้ำที่มีอยู่ให้พวกเขากินอย่างเต็มที่ โปรโตคอลทดลองทำในสอดคล้องกับประกาศของเฮลซิงกิและประชาคมยุโรปแนวทางในการจัดการทางจริยธรรมของสัตว์ทดลอง (EEC Directive 1986; 86/609 / EEC) และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในสัตว์ของคณะแพทย์ใน Nis มันเป็นเอกสารภายใต้หมายเลข 01-2625-8. 2.4 ขั้นตอนการทดลองสัตว์ที่ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม 8 สัตว์แต่ละ ครั้งแรกที่ 8 สัตว์ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุม (กลุ่ม C) และได้รับ 1 มิลลิลิตรของสารละลายน้ำเกลือต่อวัน intraperitoneally 8 วัน ชาเขียว (GT) กลุ่มที่ได้รับการรับประทาน 300 มิลลิกรัม / กิโลกรัม / วันของ GTE เป็นเวลา 15 วันโดยใช้โพรโทคอกระเพาะอาหารให้สารอาหาร [20] พิษต่อไตในกลุ่มจีเอ็มถูกชักนำโดยการบริหารของจีเอ็มเยื่อบุช่องท้อง ( บริษัท Actavis, Leskovac, เซอร์เบีย) 100 มิลลิกรัม / กิโลกรัม / วันเป็นเวลา 8 วันสุดท้ายของการทดลอง ชาเขียวและกลุ่ม gentamicin (GT + จีเอ็ม) ได้รับการรักษาด้วยการรับประทานชาเขียว 300 มก. / กก. / วันเป็นเวลา 15 วัน สำหรับ 8 วันสุดท้ายของการทดสอบพร้อมกันกับชาเขียวฉีดเข้าช่องท้องของจีเอ็ม (100 มิลลิกรัม / กิโลกรัม / วัน) ได้รับ ในตอนท้ายของการทดลองสัตว์ทั้งหมดถูกอสัญญีใช้ 80 มก. / กก. คีตา (Ketamidor 10% ริกเตอร์ฟาร์มาเอจี Wels, ออสเตรีย) และเสียสละ ตัวอย่างเลือดสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมีที่ถูกนำมาจากหลอดเลือดแดงใหญ่ (2 มล.) และวิเคราะห์เป็นเครื่องหมายของภาวะไตวายเฉียบพลัน ไตจะถูกลบออกในภายหลังและแยกออกเป็นสองส่วนสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมีและการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง. 2.5 homogenates เตรียมนำออกไตถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และปั่นในน้ำเย็นน้ำแข็งใช้ homogenizer (IKA®ธิ do Brasil Ltda ริโอเดอจาเนโร, บราซิล) 10% (w / v) homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1,500 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 ° C เพื่อเอาเศษเซลล์ ใสถูกบันทึกไว้และเก็บไว้ที่. - 20 ° C สำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมี2.6 การวิเคราะห์ทางจุลกายวิภาคของเนื้อเยื่อไตได้รับการแก้ไขใน 10% paraformaldehyde แห้งจากน้อยไปมากอย่างช้า ๆ ชุดของเครื่องดื่มแอลกอฮอล์และฝังตัวอยู่ในพาราฟิน ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกตัดเป็นชิ้น 5 ไมครอนหนาใช้ microtome Histo ช่วง (Model: LKB 2218, LKB-Produkter AB, Bromma, สวีเดน) และย้อมด้วยสี hematoxylin และ Eosin (เขา) และธาตุกรดชิฟฟ์ (PAS) สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง . ส่วน histological มีการตรวจสอบและถ่ายภาพในแสงกล้องจุลทรรศน์ Leica DMR (Leica Microsystems แบงก์เวทซลาร์, เยอรมนี). 2.7 ความมุ่งมั่นของโปรตีนออกซิเดชันความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์โปรตีนออกซิเดชันขั้นสูง (AOPP) เป็นเครื่องหมายของการเกิดออกซิเดชันปรับเปลี่ยนโปรตีนและยังเกิดการอักเสบที่ถูกกำหนด ความเข้มข้นของโปรตีนวัดตามวิธีการของโลว์รีย์ [17] โดยใช้ซีรั่มวัวเป็นมาตรฐาน วิธีสเปกขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาของ AOPP กับโพแทสเซียมไอโอไดด์ในสื่อที่เป็นกรดที่ใช้ในการวัดระดับของ AOPP ความเข้มของสีที่ได้รับการบันทึกทันทีที่ 340 นาโนเมตร ค่าที่ถูกแสดงในไมโครโมล / มก. โปรตีน. 2.8 การกำหนดกิจกรรม catalase เนื้อเยื่อ catalase (CAT) กิจกรรมที่ถูกกำหนดตามชาวเยอรมัน [12] วิธีการที่จะขึ้นอยู่กับความสามารถของ catalase ละลายสารตั้งต้น (H2O2) โดยเอนไซม์จะหยุดการทำงานโดยการเติมแอมโมเนียมโมลิบ ความซับซ้อนของสีเหลืองและโมลิบ H2O2 วัดที่ 405 นาโนเมตรและเอนไซม์กิจกรรมได้รับการแสดงในหน่วยเร่งปฏิกิริยาต่อกรัมของโปรตีน (KU / g)