1376 Manuel Martínez-Estévez, Victo

1376 Manuel Martínez-Estévez, Victor M. Loyola-Vargas, S. M. Teresa Hernández-Sotomayor

1997) cells or tissues cultured in vitro. In these reports, chang- utes the reaction was stopped with Laemmli buffer (Laemmli 1970). The
es in kinase activity or in protein phosphorylation pattern (Kuo in vitro phosphorylation reaction was performed with aliquots of crude
et al. 1995) were observed during growth or differentiation. In extract from cells not treated with AlCl3 or from cells treated with dif-
ferent concentrations of AlCl3 for 1 hour at 30˚C. In all experiments, af-
recent years, plant biologists have become more aware of the
ter the phosphorylated proteins were separated by SDS-PAGE, the
importance of environmental issues in agriculture, and a sig-
proteins were electroblotted on nylon membrane for 5 hours at 50
nificant part of research in this area has focused on the mech-
volts. Phosphoprotein bands were visualized by autoradiography on
anisms of aluminum phytotoxicity at the cellular level. The KODAK Ektagraphic film for 3 days. In other set of experiments the
aspect that has been most intensely studied to date involves reaction mixture was incubated with increasing concentratios of AlCl3.
phosphoinositide turnover (Jones and Kochian 1995), and it The enzymatic reaction was then initiated as described above. In ex-
is well known that protein phosphorylation is one of the post- periments where Ca2+ -dependent phosphorylation was explored, and

transductional modifications that regulates at the cellular level since the real concentration of calcium in the extract is not known, we
physiological events (Sopory and Munshi 1998). Genetic, bio- used a calcium chelator, EGTA (1mmol/L), to establish a defined cal-
chemical and pharmacological analyses have shown that cium concentration of 25 µmol/L. This concentration was achieved
using 1 mmol/L EGTA plus 1 mmol/L CaCl2, as calculated by EqCal
protein kinases and protein phosphatases play important
program.
roles in environmental stress response. Studies on the effect
of aluminum on protein phosphorylation are not available.
In our investigation we use Coffea arabica suspension
cells to study this aspect of aluminum toxicity. Results

In vitro phosphorylation pattern
Materials and Methods As previously shown (Martínez-Estevéz et al. 2001), we mod-

ified the composition of the culture medium of a C. arabica
Cell Culture cell line to produce aluminum toxicity. Under these conditions

An embryogenic suspension culture of Coffea arabica L. was ob- the LD50 of aluminum was 25 µmol/L. We also measured the
tained by desegregation of callus (Martínez-Estévez et al. 2001) and free concentrations of Al in the culture media using the fluo-
maintained in MS medium (Murashige and Skoog 1962) at pH 4.3 and rescent compound morin which fluoresces only when forming
half ionic strength (Martínez-Estévez et al. 2001) supplemented with a complex with free Al (Browne et al. 1990, Larsen et al.
100 mg/L myo-inositol, 10 mg/L thiamine, 25 mg/L cysteine, 3 % su- 1998). At pH 4.3 and with half ionic strength media, the free
crose, 3 mg/L 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2,4-D), and 1 mg/L aluminum concentrations were close to the theoretical Al con-
6-benzylamino purine (6-BAP). The embryogenic suspension culture
centrations (Martínez-Estevéz et al. 2001). For example, the
was subcultured every 14 days.
free Al concentration in a 100 µmol/L medium was 77µmol/L.
The general patterns of total proteins and after in vitro protein
phosphorylation during a culture cycle of C. arabica cells is
Protein assay
presented in Figure 1. Although there are some intensity
Cells were treated or not treated with different concentrations of AlCl3 changes in proteins visible, there were no dramatic variations
after which they were immediately frozen in liquid nitrogen and ho- throughout the culture period (Fig.1A).
mogenized with a politron in buffer A (1g of tissue in 2.5mL; 50mmol/L The in vitro phosphorylation assay detected several la-
NaCl, 1mmol/L EGTA, 50mmol/L Tris HCl pH 7.4, 250mmol/L sucrose,
beled phosphoproteins (Fig. 1B). The high molecular weight
10 % glycerol, 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mmol/L so-
phosphoproteins did not change. However, low molecular
dium pyrophosphate and 0.2 mmol/L sodium orthovanadate). Extracts
were centrifuged at 1000 ×g for 30 minutes at 4 ˚C to remove debris. weight phosphoproteins showed considerable variation, par-
The supernatant (protein: 3–5 mg/mL) was used for the in vitro phos- ticularly when compared to day zero. A 41kDa phosphopro-
phorylation experiments. All steps during the extraction were per- tein appeared at day two.

formed at 4 ˚C. Cell extracts were frozen in liquid nitrogen and stored
at –80 ˚C. Protein concentrations of samples were measured with the
bicinchoninic acid protein assay reagent (Smith et al. 1985) using bo- Protein and in vitro phosphorylation patterns of cells
vine serum albumin as standard. The total protein pattern was ana- treated with aluminium
lyzed by SDS-PAGE in 12 % acrylamide gels according to Laemmli
(1970) using a Mini Protean II Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, We chose day 14 of the culture cycle to analyse the effect of
CA). Gels were stained with silver nitrate (Bloom et al. 1987). Al on the protein pattern and in vitro phosphorylation. On day

14, we had previously found changes in other enzymatic ac-
tivities, such as phospholipase C (unpublished). The expo-
In vitro phosphorylation assay nential phase of cell growth also started on day 14 (Martínez-

Aliquots of crude extract were incubated with phosphorylation buffer Estévez et al. 2001)
containing 20 mmol/L HEPES pH 7.4, 10 mmol/L MgCl2, 0.1mmol/L so- Cells were treated with increasing concentrations of Al for 1
dium orthovanadate, 50 µmol/L [32P]γATP (10 µCi/nmol). After 30 min- hour. Figure 2 shows total protein of the cell suspension in-

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1376 มานูเอล Martínez Estévez, Victor M. โลโยลา-Vargas, S. M. เทเรซ่า Hernández-Sotomayor 1997) เซลล์หรือเนื้อเยื่ออ่างเพาะเลี้ยง ในรายงานเหล่านี้ ช้าง-utes หยุดปฏิกิริยา ด้วย Laemmli บัฟเฟอร์ (Laemmli 1970) ที่ es kinase กิจกรรม หรือโปรตีน phosphorylation ลาย (Kuo ในหลอดปฏิกิริยา phosphorylation ทำกับ aliquots ของดิบ ร้อยเอ็ด al. 1995) ที่พบในระหว่างการเจริญเติบโตหรือสร้างความแตกต่าง ในสารสกัด จากเซลล์ไม่รับ AlCl3 หรือ จากเซลล์รับ dif- ความเข้มข้น ferent ของ AlCl3 1 ชั่วโมงที่ 30˚C ในการทดลองทั้งหมด af- ปี พืช biologists เป็นตระหนักถึงการ เธอโปรตีน phosphorylated ถูกคั่น ด้วย SDS-หน้า การ ความสำคัญของปัญหาสิ่งแวดล้อมในการเกษตร และ sig แบบ โปรตีนมี electroblotted บนเยื่อไนล่อนเวลา 5 ชั่วโมงที่ 50 nificant เป็นส่วนหนึ่งของงานวิจัยในพื้นที่นี้ได้เน้นการต่อสู้- โวลต์ วง phosphoprotein มี visualized โดย autoradiography บน anisms ของ phytotoxicity อลูมิเนียมในระดับเซล ฟิล์มโกดัก Ektagraphic สำหรับ 3 วัน ในชุดทดลองอื่น ๆ ปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับด้านที่ได้รับการศึกษาสุดเจี๊ยบวันผสมคือ incubated กับ concentratios ของ AlCl3 เพิ่ม หมุนเวียน phosphoinositide (โจนส์และ Kochian 1995), และเริ่มปฏิกิริยาเอนไซม์ในระบบแล้วที่อธิบายข้างต้น ในอดีต- เป็นที่รู้จักว่าโปรตีน phosphorylation เป็นหนึ่งใน periments หลังที่ Ca2 + -phosphorylation ขึ้นมีอุดม และ แก้ไข transductional ที่กำหนดระดับโทรศัพท์มือถือเนื่องจากไม่ทราบความเข้มข้นของแคลเซียมในการดึงข้อมูลจริง เรา เหตุการณ์สรีรวิทยา (Sopory และ Munshi 1998) พันธุกรรม ไบโอใช้เป็นแคลเซียม chelator, EGTA (1mmol/L), การสร้างการกำหนด cal- วิเคราะห์เคมี และ pharmacological ได้แสดงที่เข้มข้น cium 25 µmol L. ความเข้มข้นนี้สำเร็จ ใช้ 1 mmol/L EGTA บวก 1 mmol/L CaCl2 ตามที่คำนวณโดย EqCal kinases โปรตีนและโปรตีน phosphatases เล่นสำคัญ โปรแกรม บทบาทในการตอบสนองความเครียดสิ่งแวดล้อม ผลการศึกษา ลูมิเนียมบนโปรตีน phosphorylation ใช้ไม่ได้ ในการตรวจสอบของเรา เราใช้ระงับ Coffea อาราบิก้า เซลล์เพื่อศึกษาด้านนี้ของความเป็นพิษของอะลูมิเนียม ผลลัพธ์ Phosphorylation ในรูปแบบ วัสดุและวิธีการแสดงก่อนหน้านี้ (Martínez Estevéz et al. 2001), เรา mod- องค์ประกอบของสื่อวัฒนธรรมของอาราบิก้า C. ified เซลล์วัฒนธรรมเซลล์บรรทัดการผลิตความเป็นพิษของอะลูมิเนียม ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ วัฒนธรรมการระงับเยื่อของอาราบิก้า Coffea L. มี ob-LD50 ลูมิเนียมถูก 25 µmol/L. เราวัด tained desegregation ของแคลลัส (Martínez Estévez et al. 2001) และความเข้มข้นของอัลที่สื่อวัฒนธรรมใช้ fluo - ฟรี รักษาใน MS ปานกลาง (Murashige และ Skoog 1962) ที่ pH 4.3 และ rescent ผสมโมรินซึ่ง fluoresces เฉพาะเมื่อขึ้นรูป ครึ่ง ionic แรง (Martínez Estévez et al. 2001) เสริม ด้วยที่ซับซ้อนกับอัลฟรี (Browne et al. 1990, Larsen et al 100 mg/L myo-inositol ไทอามีน 10 mg/L, 25 mg/L cysteine, 3% su-1998) ที่ค่า pH 4.3 และมื้อ ionic แรงสื่อ ฟรี crose, 3 mg/L 2, 4-dichlorophenoxiacetic กรด (2, 4-D), และ 1 mg/L อลูมิเนียมความเข้มข้นได้ใกล้กับทฤษฎีอัลคอน- purine 6-benzylamino (6-BAP) วัฒนธรรมเยื่อระงับ centrations (Martínez Estevéz et al. 2001) ตัวอย่าง การ มี subcultured ทุก 14 วัน ความเข้มข้นอัลฟรีในสื่อ µmol/L 100 ถูก 77µmol/L. รูปแบบทั่วไป ของโปรตีนทั้งหมด และโปรตีนใน phosphorylation ระหว่างวงจรวัฒนธรรมเซลล์ซีอาราบิก้าคือ ทดสอบโปรตีน แสดงในรูปที่ 1 แม้ว่าจะมีบางความเข้ม เซลล์ได้รับ หรือไม่ถือว่า มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ AlCl3 โปรตีนสามารถมองเห็นได้ มีรูปแบบอย่างไม่เปลี่ยนแปลง หลัง จากที่ พวกเขาได้ทันทีแช่แข็ง ในไนโตรเจนเหลว และโฮ- ตลอดระยะเวลาของวัฒนธรรม (Fig.1A) mogenized กับ politron ในบัฟเฟอร์ A (1 กรัมของเนื้อเยื่อใน 2.5 mL; 50mmol/L วิเคราะห์ phosphorylation ในพบหลายลา - NaCl, 1mmol EGTA, 50mmol/L ทริสเรทติ้ง HCl pH 7.4 ซูโครส 250mmol/L, L beled phosphoproteins (Fig. 1B) น้ำหนักโมเลกุลสูง 10% กลีเซอร 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 10 mmol/L ดังนั้น- ไม่ได้เปลี่ยน phosphoproteins อย่างไรก็ตาม ต่ำระดับโมเลกุล dium pyrophosphate ก 0.2 orthovanadate โซเดียม mmol/L) สารสกัดจาก มี centrifuged ที่ 1000 × g 30 นาทีที่ 4 ˚ c เอาเศษ แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงมาก พาร์ - phosphoproteins น้ำหนัก Supernatant (โปรตีน: 3 – 5 mg/mL) ใช้สำหรับการเพาะเลี้ยง phos ticularly เมื่อเทียบกับวันศูนย์การ Phosphopro 41kDa เป็น- phorylation ทดลอง ขั้นตอนทั้งหมดในระหว่างการสกัดได้ต่อนี้ปรากฏในสองวัน รูปที่ 4 ˚ c สารสกัดจากเซลล์แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บ ที่ –80 ˚ c มีวัดความเข้มข้นของโปรตีนตัวอย่างด้วยการ รีเอเจนต์ทดสอบโปรตีนกรด bicinchoninic (Smith et al. 1985) ใช้บ่อโปรตีน phosphorylation ในรูปแบบของเซลล์ เถาวัลย์ serum albumin เป็นมาตรฐาน รูปแบบโปรตีนรวมเอเอ็นเอ-รักษา ด้วยอะลูมิเนียม lyzed โดยหน้า SDS ใน 12% อะคริลาไมด์เจตาม Laemmli ใช้เซลล์มินิ Protean II (1970) (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส เราเลือกวันที่ 14 ของวงจรวัฒนธรรมเพื่อวิเคราะห์ผลของการ CA) เจมีสีกับซิลเวอร์ไนเตรต (บลูม et al. 1987) อัลในรูปโปรตีน phosphorylation ใน ในวัน 14 เราได้เคยพบการเปลี่ยนแปลงในอื่น ๆ เอนไซม์ในระบบ ac- tivities เช่น phospholipase C (ยกเลิกประกาศ) เอ็กซ์โป- Phosphorylation ในหลอดทดสอบ nential ระยะเจริญเติบโตของเซลล์เริ่มต้นในวันที่ 14 (Martínez-ยัง Aliquots ของสารสกัดหยาบที่ incubated กับบัฟเฟอร์ phosphorylation Estévez et al. 2001) ประกอบด้วย 20 mmol/L HEPES pH 7.4, 10 mmol/L MgCl2, 0.1mmol / L ดังนั้น - เซลล์ได้รับการรักษา ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของอัล 1 orthovanadate dium, 50 µmol/L [32P] γATP (10 µCi/nmol) หลังจาก 30 นาที - ชั่วโมง รูปที่ 2 แสดงโปรตีนรวมของระงับเซลล์ใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1376 มานูเอลมาร์ติเนEstévezวิคเตอร์เอ็ม Loyola-วาร์กัส, เอสเอ็มเทเรซาHernández-Sotomayor 1997) เซลล์หรือเนื้อเยื่อที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง ในรายงานเหล่านี้ดินเขาช้างปฏิกิริยาก็หยุดด้วยบัฟเฟอร์ Laemmli (Laemmli 1970) es ในกิจกรรมไคเนสหรือในรูปแบบโปรตีน phosphorylation (คุโอในการทำปฏิกิริยา phosphorylation หลอดทดลองได้ดำเนินการกับส่วนลงตัวน้ำมันดิบet al. 1995) ถูกตั้งข้อสังเกตในระหว่างการเจริญเติบโตหรือความแตกต่าง ในสารสกัดจากเซลล์ไม่ได้รับการรักษาด้วย AlCl3 หรือจากการรักษาด้วยเซลล์ต่างมีความเข้มข้นแตกของ AlCl3 1 ชั่วโมงที่ 30C ในการทดลองทั้งหมด af- ปีที่ผ่านมานักชีววิทยาพืชได้มากขึ้นตระหนักถึงเธอโปรตีน phosphorylated ถูกแยกออกโดยวิธี SDS-PAGE, ความสำคัญของปัญหาสิ่งแวดล้อมในการเกษตรและลายมือชื่อโปรตีนถูก electroblotted บนเยื่อไนลอน 5 ชั่วโมงที่ 50 ส่วนที่สำาของการวิจัยในพื้นที่นี้มีความสำคัญกับกลไกโวลต์ วง phosphoprotein ถูกมองเห็นโดยเอ๊กบนanisms ของอลูมิเนียมเป็นพิษในระดับเซลล์ ฟิล์ม KODAK Ektagraphic 3 วัน ในชุดการทดลองอื่น ๆแง่มุมที่ได้รับการศึกษามากที่สุดอย่างเข้มข้นถึงวันที่เกี่ยวข้องกับการผสมปฏิกิริยาถูกบ่มกับการเพิ่มขึ้นของ concentratios AlCl3. มูลค่าการซื้อขาย phosphoinositide (โจนส์และ Kochian 1995) และจะเกิดปฏิกิริยาได้ริเริ่มขึ้นแล้วตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในอดีตเป็นที่รู้จักกันดีว่า phosphorylation โปรตีนเป็นหนึ่งใน periments หลังที่ Ca2 + phosphorylation -dependent มีการสำรวจและการปรับเปลี่ยน transductional ที่ควบคุมในระดับเซลล์ตั้งแต่ความเข้มข้นที่แท้จริงของแคลเซียมในสารสกัดไม่เป็นที่รู้จักเราเหตุการณ์ทางสรีรวิทยา ( Sopory และ Munshi 1998) พันธุกรรมชีวภาพใช้ chelator แคลเซียม EGTA (1mmol / ลิตร) เพื่อสร้างการกำหนดแคสารเคมีและการวิเคราะห์ทางเภสัชวิทยาได้แสดงให้เห็นว่ามีความเข้มข้น Cium 25 ไมโครโมล / ลิตร ความเข้มข้นนี่คือความสำเร็จโดยใช้ 1 mmol / L EGTA บวก 1 mmol / L CaCl2 คำนวณตาม EqCal ไคเนสส์โปรตีนและ phosphatases โปรตีนเล่นที่สำคัญโปรแกรม. บทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดสิ่งแวดล้อม การศึกษาเกี่ยวกับผลกระทบของอลูมิเนียมฟอสโฟโปรตีนไม่สามารถใช้ได้. ในการตรวจสอบของเราเราจะใช้กาแฟอาราบิก้าระงับเซลล์เพื่อการศึกษาด้านความเป็นพิษของอลูมิเนียมนี้ ผลในรูปแบบ phosphorylation หลอดทดลองวัสดุและวิธีการตามที่ปรากฏก่อนหน้านี้ (Martínez-Estevez et al. 2001) เราเรียบร้อยified องค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อของอาราบิก้า C. เซลล์วัฒนธรรมเซลล์ในการผลิตอลูมิเนียมเป็นพิษ ภายใต้เงื่อนไขเหล่าวัฒนธรรมระงับเพาะของกาแฟอาราบิก้าลิตรก็สังเกตการ LD50 ของอลูมิเนียม 25 ไมโครโมล / ลิตร นอกจากนี้เรายังวัดtained โดย desegregation ของแคลลัส (Martínez-Estévez et al. 2001) และความเข้มข้นของอัลฟรีในสื่อวัฒนธรรมโดยใช้ fluo- เก็บรักษาไว้ในสูตร MS (Murashige และ Skoog 1962) ที่ pH 4.3 และโมสารประกอบ rescent ซึ่ง fluoresces เฉพาะเมื่อการสร้างความแข็งแรงของอิออนครึ่งหนึ่ง (Martínez-Estévez et al. 2001) เสริมด้วยที่ซับซ้อนที่มีฟรีอัล (บราวน์ et al. 1990 เสน et al. 100 มิลลิกรัม / ลิตร Myo-ทอ, 10 mg / L วิตามินบี 25 mg / cysteine ​​L, 3% ซู 1998) ที่ pH 4.3 และมีการสื่อความแข็งแรงครึ่งอิออน, ฟรีCrose 3 มิลลิกรัม / ลิตรกรด 2,4-dichlorophenoxiacetic (2,4-D) และ 1 มิลลิกรัม / ลิตรความเข้มข้นของอลูมิเนียมได้ใกล้เคียงกับทฤษฎีอัจึงดู6 benzylamino purine (6-BAP) วัฒนธรรมระงับเพาะcentrations (Martínez-Estevez et al. 2001) ยกตัวอย่างเช่นการได้รับเชื้อทุก 14 วัน. ฟรีเข้มข้นของอัลในกลาง 100 ไมโครโมล / ลิตรเป็น77μmol / ลิตร. รูปแบบทั่วไปของโปรตีนทั้งหมดและหลังการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโปรตีนphosphorylation ในระหว่างรอบวัฒนธรรมของซีอาราบิก้าเซลล์คือการตรวจสอบปริมาณโปรตีนนำเสนอ ในรูปที่ 1 แม้ว่าจะมีบางความเข้มเซลล์ได้รับการรักษาหรือไม่ได้รับการรักษาที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของการเปลี่ยนแปลง AlCl3 ในโปรตีนที่มองเห็นไม่พบว่ามีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากหลังจากที่พวกเขาถูกแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลวและ Ho- ตลอดระยะเวลาการเลี้ยง (Fig.1A ). mogenized กับ Politron ในบัฟเฟอร์ (1 กรัมของเนื้อเยื่อใน 2.5ml; 50mmol / ลิตรในการทดสอบในหลอดทดลอง phosphorylation ตรวจพบหลาย La- โซเดียมคลอไรด์, 1mmol / L EGTA, 50mmol / L Tris HCl ค่า pH 7.4 ซูโครส 250mmol / L Beled phosphoproteins (รูป. 1B). น้ำหนักโมเลกุลสูงกลีเซอรอล 10%, 1 mmol / L ฟลูออไร phenylmethylsulfonyl, 10 mmol / L ทางสังคมphosphoproteins ไม่เปลี่ยนแปลง. แต่โมเลกุลต่ำpyrophosphate dium และ 0.2 mmol / L โซเดียม orthovanadate) สารสกัดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 C เพื่อเอาเศษ น้ำหนัก phosphoproteins แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงมาก, มารดาใส (โปรตีน: 3-5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ที่ใช้สำหรับในหลอดทดลอง phos- ticularly เมื่อเทียบกับวันที่ศูนย์ 41kDa phosphopro- ทดลอง phorylation ขั้นตอนทั้งหมดในระหว่างการสกัดโปรตีนเป็นลำดับปรากฏในวันที่สอง. เกิดขึ้นที่ 4 องศาเซลเซียส สารสกัดจากเซลล์ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของโปรตีนของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวัดที่มีโปรตีนกรด bicinchoninic น้ำยาทดสอบ (สมิ ธ et al. 1985) โดยใช้โปรตีนบ่อและในรูปแบบ phosphorylation การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของเซลล์โปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มเถาเป็นมาตรฐาน รูปแบบปริมาณโปรตีนรวมแบบตั้งรับการรักษาด้วยอลูมิเนียมlyzed โดยวิธี SDS-PAGE ใน 12% เจลริลาไมด์ตาม Laemmli (1970) โดยใช้ Protean II Mini เซลล์ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, ดาวเราเลือกวันที่ 14 ของรอบวัฒนธรรมในการวิเคราะห์ ผลกระทบของCA) เจลถูกย้อมด้วยสีซิลเวอร์ไนเตรท (บลูม et al. 1987) อัลในรูปแบบโปรตีนและใน phosphorylation หลอดทดลอง ในวันที่14 เราเคยพบการเปลี่ยนแปลงในอื่น ๆ AC- เอนไซม์tivities เช่น phospholipase C (ที่ไม่ได้เผยแพร่) เปิดรับแสงในหลอดทดลองทดสอบ phosphorylation เฟส nential การเจริญเติบโตของเซลล์ก็เริ่มในวันที่ 14 (Martínez- ส่วนลงตัวของสารสกัดหยาบถูกบ่มกับบัฟเฟอร์ phosphorylation Estévez et al. 2001) ที่มี 20 mmol / L HEPES พีเอช 7.4, 10 mmol / L MgCl2, 0.1mmol / L ทางสังคมเซลล์ได้รับการรักษาที่มีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของอัล 1 dium orthovanadate 50 ไมโครโมล / ลิตร [32P] γATP (10? Ci / นาโนโมล) หลังจาก 30 ชั่วโมง min- รูปที่ 2 แสดงโปรตีนรวมของเซลล์แขวนลอยในร่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1376 มานูเอล มาร์ตีเนซ เอสเตเวซ วิคเตอร์ เอ็ม โลโยลา วาร์กัส เอส เอ็ม เทเรซ่า เอร์นันเดซ . kgm ndez sotomayor

1997 ) เซลล์หรือเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง . ในรายงานนี้ ชาง - utes ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดด้วย laemmli บัฟเฟอร์ ( laemmli 1970 )
es ในกิจกรรมไคเนสโปรตีนฟอสโฟริเลชันหรือในรูปแบบปฏิกิริยาฟอสโฟรีเลชัน ( กัวในหลอดทดลองมีการปฏิบัติกับเฉยๆของดิบ
et al .1995 ) พบว่าในช่วงการเจริญเติบโตหรือการเปลี่ยนแปลง . สกัดจากเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาด้วย alcl3 หรือจากเซลล์รักษาที่มี -
ferent ความเข้มข้นของ alcl3 1 ชั่วโมง 30 ˚ C . ในการทดลองทั้งหมด AF -
ปีล่าสุด นักชีววิทยาพืชมีมากขึ้นตระหนักถึง
เธอและฟอสฟอรีเลเตตโปรตีนแยกจากกันโดย SDS-PAGE ,
ความสำคัญของปัญหาสิ่งแวดล้อม ด้านการเกษตรและ Sig -
โปรตีนเป็น electroblotted ผ้าไนลอนเมมเบรนสำหรับ 5 ชั่วโมง 50
nificant ส่วนหนึ่งของการวิจัยในพื้นที่นี้ ได้มุ่งเน้นใน Mech -
โวลต์ ฟอสโฟโปรตีนแถบถูกมองเห็นโดยเก้าอี้รับแขกบน
anisms อลูมิเนียมมีความเป็นพิษในระดับเซลล์ ฟิล์ม Kodak ektagraphic เป็นเวลา 3 วัน ในการตั้งค่าอื่น ๆของการทดลอง
ลักษณะที่ได้รับมากที่สุดจ้านเรียนวันที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาที่ถูกบ่มด้วยการเพิ่มส่วนผสมของ concentratios alcl3 .
การหมุนเวียน phosphoinositide ( โจนส์และ kochian 1995 ) , และปฏิกิริยาเอนไซม์ จึงริเริ่มตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในอดีต -
เป็นที่รู้จักกันดีว่าโปรตีนฟอสโฟริเลชันเป็นหนึ่งในโพสต์ - periments ที่แคลเซียมฟอสโฟริเลชันชนิดที่สำรวจและ

transductional ปรับเปลี่ยนที่ควบคุมในระดับเซลล์ เนื่องจากความเข้มข้นของแคลเซียมในน้ำจริงไม่เป็นที่รู้จักเรา
กิจกรรมทางสรีรวิทยาและ sopory munshi 1998 ) พันธุกรรม , ไบโอ - ใช้แคลเซียมคีเลเตอร์หน่วย ( , 1mmol ลิตร ) เพื่อสร้างกำหนด Cal -
เคมีและเภสัชวิทยา การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่า cium ความเข้มข้น 25 µโมลต่อลิตรความเข้มข้นเท่ากับ
นี้ใช้ 1 มิลลิโมล / ลิตรหน่วยบวก 1 มิลลิโมล / ลิตร คำนวณโดยผลิตเป็นยาโปรตีนและโปรตีน eqcal ดิเล่นโปรแกรมสำคัญ


บทบาทในการตอบสนองต่อความเครียดทางสิ่งแวดล้อม การศึกษาผลของโปรตีนฟอสโฟริเลชัน
อลูมิเนียมจะไม่สามารถใช้ได้
ในการสืบสวนของเรา เราใช้กาแฟอาราบิก้า coffea ระงับ
เซลล์เพื่อศึกษาด้านนี้ของอลูมิเนียมเป็นพิษ ผล

ในหลอดทดลอง ฟอสโฟริเลชันแบบ
วัสดุและวิธีการที่แสดงก่อนหน้านี้ ( มาร์ตีเนซ estev é z et al . 2544 ) เรา mod -

ified องค์ประกอบของสื่อวัฒนธรรมของ C . อาราบิก้า
วัฒนธรรมเซลล์เส้น ผลิตอลูมิเนียมเป็นพิษ ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้

ตรงช่วงล่างเป็นวัฒนธรรมของอาราบิก้าคือ โอบี - coffea L ld50 อลูมิเนียม 25 µ mol / L . เรายังวัด
tained โดย desegregation ของแคลลัส ( มาร์ตีเนซ เอสเตเวซ et al . 2544 ) และความเข้มข้นของอัลฟรีในวัฒนธรรมสื่อโดยใช้ฟลู -
รักษาในอาหาร MS ( อาหารสูตร Murashige and Skoog 1962 ) ที่ pH 4.3 และ rescent สารประกอบโมรินซึ่งเรืองแสงเมื่อสร้าง
ครึ่งความแรงไอออน ( มาร์ตีเนซ เอสเตเวซ et al . 2001 ) เสริมด้วยซับซ้อนกับฟรีล ( บราวน์ และคณะ 1990 Larsen et al .
100 มิลลิกรัม / ลิตร เมียว อินโนซิทอล , 10 มิลลิกรัมไนอาซิน , 25 มก. / ล. ซีสเตอีน 3 เปอร์เซ็นต์ ซู - 1998 ) ที่ pH 4.3 และครึ่งความแรงของไอออนต่าง crose ฟรี
3 mg / l 2,4-dichlorophenoxiacetic acid ( 2 , 4-D ) และ 1 มิลลิกรัมต่อลิตร ปริมาณใกล้เคียงกับทฤษฎีอลูมิเนียมอัลคอน -
ต่ออายุ ( 6-bap ) ส่วนตรงช่วงล่างวัฒนธรรม
centrations ( มาร์ตีเนซ estev é z et al . 2001 ) ตัวอย่างเช่น
คือ subcultured ทุกๆ 14 วัน
ฟรีล ความเข้มข้นใน 100 µ mol / L ) 77 µ mol / L .
ทั่วไปรูปแบบของโปรตีนรวมและโปรตีนในร่างกาย หลังจากกรุงเทพมหานครระหว่างวัฒนธรรมรอบ
C . อาราบิก้าเซลล์มีโปรตีน (

แสดงในรูปที่ 1 แม้ว่าจะมีบางความเข้ม
เซลล์จะถูก หรือ ไม่ถือว่ามีความเข้มข้นต่าง ๆ ของการเปลี่ยนแปลง alcl3 โปรตีนที่มองเห็น ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมาก
หลังจากที่พวกเขาถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที โฮ - ตลอดระยะเวลาการเลี้ยง ( fig.1a )
mogenized กับ politron ในบัฟเฟอร์ ( 1G เนื้อเยื่อ 2.5 มิลลิลิตร ; 50mmol / L ในหลอดทดลองพบว่า กรุงเทพมหานครหลายลา -
NaCl 1mmol หน่วย / ลิตร ,50mmol / L โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 7.4 250mmol ลิตรน้ำตาลซูโครส
beled phosphoproteins ( รูปที่ 1A ) โมเลกุล
สูง 10% กลีเซอรอล 1 มิลลิโมล / ลิตร phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 10 มิลลิโมล / ลิตรแล้ว -
phosphoproteins เปลี่ยนไม่ อย่างไรก็ตาม พบ dium โมเลกุล
ต่ำและ 0.2 มิลลิโมล / ลิตรโซเดียม orthovanadate ) เป็นสารสกัดที่ระดับ 1000 ×
G สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ˚ C เอาเศษ .น้ำหนัก phosphoproteins พบการเปลี่ยนแปลงมาก , ตราไว้หุ้นละ -
สูง ( โปรตีน : 3 – 5 mg / ml ) ใช้ในหลอดทดลอง phos - ticularly เมื่อเทียบกับวัน ที่ศูนย์ เป็น 41kda phosphopro -
phorylation การทดลอง ทุกขั้นตอนในการสกัดได้ต่อเทียนที่ปรากฏอยู่สองวัน

รูปที่ 4 ˚ C เซลล์สารสกัดถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บที่˚
– 80 Cโปรตีนความเข้มข้นของตัวอย่างถูกวัดด้วย
bicinchoninic กรดโปรตีนโดยรีเอเจนต์ ( Smith et al . 1985 ) ใช้ โบ โปรตีนและสารฟอสโฟริเลชันรูปแบบของเซลล์
เถาซีรัมอัลบูมิน เป็นมาตรฐาน แบบแผนโปรตีนทั้งหมด อนา - รักษาด้วยอลูมิเนียม
lyzed โดย SDS-PAGE ใน 12 % เจลอะคริลาไมด์ตาม laemmli
( 1970 ) ใช้ Mini ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก 2 เซลล์ ( ห้องปฏิบัติการราดทางชีวภาพดาวเราเลือกวันที่ 14 ของรอบวัฒนธรรมเพื่อวิเคราะห์ผลกระทบของ
CA ) เจลถูกย้อมด้วยสีซิลเวอร์ไนเทรต ( บลูม et al . 1987 ) ลในรูปแบบโปรตีนและในหลอดทดลอง กรุงเทพมหานคร . ในวัน

14 เราเคยพบการเปลี่ยนแปลงใน AC - เอนไซม์อื่น ๆ
tivities เช่น phospholipase C ( พิมพ์ ) งานแสดงสินค้า -
ในหลอดทดลอง กรุงเทพมหานคร ( nential ระยะของการเจริญเติบโตของเซลล์ ยังได้เริ่มในวันที่ 14 ( มาร์ตีเนซ -

เฉยๆของสกัดถูกบ่มกับฟอสโฟริเลชัน บัฟเฟอร์ เอสเตเวซ et al . 2001 )
ที่ 20 มิลลิโมล / ลิตรฮีเปส pH 7.4 10 mmol / L ชุด 0.1mmol/l , - เซลล์ได้รับการรักษาด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของ Al 1
dium orthovanadate 50 µ mol / l ] [ 32p γเอทีพี ( 10 µ CI / ? ) หลังจาก 30 นาที - 1 ชั่วโมงรูปที่ 2 แสดงรวมโปรตีนของเซลล์แขวนลอยใน - -