Measurement of melting temperatures

Measurement of melting temperatures of optimized PCSK9- specific มิวทีน

[00223] To determine melting temperatures of PCSK.9-specificมิวทีน, samples at a protein concentration of lrng/ml in PBS (Gibco) were scanned (25-100°C) at IC/min using a capillary nanoDSC instrument (Q2000, TA Instruments). The integrated software calculated the melting temperature ™ from the displayed thermogram.

[00224] The resulting melting temperatures for the two ไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO:

22 and SEQ ID NO: 13) together with the optimized derivatives therefrom (SEQ ID NO: 62-

71) are summarized in Table 9 below. For example, the data shows that Tms of SEQ ID NO:

63, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65 were significantly higher compared to SEQ ID NO:

13 and the onset of melting was shifted by up to 13°C (รูป 12).


[00225] Table 9:


+++

[00226] Example 17: แอฟฟินิตี้ of optimized ไลโปคาลิน derivatives to PCSK9


[00227] To measure the binding แอฟฟินิตี้ to biotinylated human PCSK9 of a representative group of ไลโปคาลิน มิวทีน, a Surface Plasmon Resonance (SPR) based assay was employed utilizing a Biacore T200 instrument (GE Healthcare). For the SPR แอฟฟินิตี้ assay, the Biotin CAPture ชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) was used.

[00228] In each measurement cycle, Biotin CAPture Reagent (GE Healthcare) was applied to the reference and measurement channels of Sensor Chip CAP (GE Healthcare) for
5 min at a flow rate of 2 ul/min, Biotinylated PCSK9 at a concentration of 4 ug/ml was
injected on the measurement channel for 2 min at a :flow rate of 10 µ1/min. To determine the แอฟฟินิตี้, three to four dilutions of SEQ ID NO: 62-71 were prepared in HBS-EP+ (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 MNaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) buffer and applied to the chip surface, using final concentrations of 128 nM, 32 nM, 8 nM and 4 nM. The binding assay was carried out with a contact time of 3 min, dissociation time of 20 min and applying a :flow
rate of 30 µ1/min. All measurements were performed at 25°C. Regeneration of the Sensor

Chip CAP surface was achieved with an injection of 6 M กัวนิดีน-HCl with 0.25 M NaOH (2 min) followed by an extra wash with running buffer and a stabilization period of 2 min. Prior to the measurements, one conditioning cycle consisting of three consecutive regeneration steps was performed. Data were evaluated with Biacore T200 Evaluation software (V 1.0). Double referencing was used. The 1: 1 binding แบบจำลอง was used to fit the raw data.

[00229] The resulting fit curves for ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 62-71 are shown in Figure 13 (A-J), respectively. The data shows that แอฟฟินิตี้ of thermo-stabilized ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 62-71) are fully retained compared to ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 22. Association rate constants k, หรือ kon while dissociation rate constants kd หรือ koff• The resulting dissociation constants Kn for said ไลโปคาลิน มิวทีน are summarized in Table 10 below.

[00230] Table 10:



+++
[00231] Example 18: Production of PCSK9-specific Tic มิวทีน in E. coli


[00232] PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 62, 82, 83 and 84) were expressed in E. coli. DNA encoding each ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 86, 87, 88 and 89, respectively) was inserted into a likewise-cut เวกเตอร์ which allowed bacterial production of the มิวทีน under the control of a TS โปรโมเตอร์ (in case of SEQ ID NO: 62, 82 and 84) หรือ a T7A3 โปรโมเตอร์ (in case of SEQ ID NO: 83). The มิวทีน were purified from cell lysates by combination of column chromatography methods using anion exchange column, phenyl sepharose column, gel filtration column and chelating column (in the case of SEQ ID NO: 82 and 84). The purified มิวทีน were finally solubilized in PBS.

[00233] Example 19: Biacore analysis


[00234] All procedures were performed with Biacore T200 (GE Healthcare) at 25 °C. A HBS-EP+ buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% surfactant P20) was used as running buffer. A biotinylation of PCSK9 protein was performed in a general manner using a labeling reagent, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Scientific), and the unreacted reagents were removed by desalting spin columns. A Biotin CAPture ชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) was used to immobilize the biotinylated PCSK9 ลิแกนด์ to sensor chips. Flowcells on the CAP sensor chips, pre-immobilized with a ss-DNA oligo, were hybridized with a complementary ss-DNA oligo conjugated with สเตรปทาวิดิน, and followed by a biotinylated ลิแกนด์ injection.

[00235] For capture experiments, สเตรปทาวิดิน-DNA conjugates were injected to two flowcells for 20 sec; and the biotinylated PCSK9 samples were diluted to 1 ng/µl in the running buffer and then injected to one flowcell for 1 min at 10 µ1/min, whereas another flowcell was left without captured samples to provide a reference surface. The capture protocol was designed to yield capture levels of ลิแกนด์ samples that resulted in Rm.axvalues no greater than 20 RU.

[00236] For each kinetic experiment, varying concentrations of purified PCSK9- specific ไลโปคาลิน มิวทีน ranging from 0.03 nM to 100 nM were prepared as the analytes, and injected for 300 sec at 30 µ1/minfollowed by 30 min of dissociation. Captured and reference surfaces were regenerated with a 2 min pulse of 6 M กัวนิดีน hydrochloride in 0.25 M sodium hydroxide.
[00237] The dissociation constants (K.Ds) were calculated using a 1:1 Langmuir binding แบบจำลอง. The raw data sets were analyzed using Biacore T200 Evaluation Software (version 1.0, GE Healthcare), and the sensorgrams of the reference flowcells were subtracted
from the sensorgrams of the sample-captured flowcells.


[00238]


[00239]

Example 20: Cell free PCSK9-LDLR TR-FRET assay


Secreted PCSK9 facilitates the degradation of hepatic LDLR, leading to

increase in serum LDL-C level. Thus the PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน which interfere with the interaction between PCSK9 and LDLR, result in enhancement of the recycling of LDLR to plasma membrane, which activates LDL-C intake and eventually lower the circulating LDL-C levels.

[00240] Cell free TR-FRET assay was used to determine the inhibitory effect of the ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84) on the binding between PCSK9 and LDLR. Biotin-labeled hPCSK9 (biotin-hPCSK9) used in the assay was prepared by incubation with a 5 times molar excess of EZ-Link NHSChromogenic Biotin reagent (Thermo Scientific) for 1 hr at room temperature and excess of biotin was removed by illustra NAP column (GE Healthcare Life Science). Europium-labeled LDLR (Eu-LDLR) was prepared as described in the previous report (Fisher TS, et al., J. Biol. Chem. (2007) 282(28), 20502-20512).

[00241] Cell free PCSK9-LDLR TR-FRET assay was performed in 384 well format. A final concentration of 20 nM of Biotin-hPCSK9 was incubated with several concentrations of test ไลโปคาลิน มิวทีน in binding buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCh, and 0.05% (w/v) BSA) for two hours at room temperature in the presence หรือ absence of 34 mg/ml of human serum albumin. Then ten microliter of above biotin-hPCSK9-ไลโปคาลิน สารละลาย and ten microliter of Eu-LDLR/Alexa-SA สารละลาย (1.0 nM of Eu-LDLR, 80 nM of สเตรปทาวิดิน/Alexa Fluor 647 conjugate (lnvitrogen), 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl,
0.1 mM CaCh, and 0.05% (w/v) BSA) was mixed in the well and incubated for two hours at room temperature in the dark followed by incubation overnight in the refrigerator. Samples were read using a BMG Lab Systems Rubystar Reader set to read 20 flashes/well with a 50-µs integration delay and a 200-µs integration time for a total read time of 1100 ms/well. FRET was quantified by measurement of the emission ratio at 665/620 nm. TR-FRET ratio was calculated as following formulation.

[00242] TR-FRET Ratio= (counts at 665 nm/counts at 620 nm) x 10,000 [00243] To obtain the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration at which การประกอบขึ้น of the PCSK9/LDLR complex• was blocked by 50% (IC50), the curves were fitted by nonlinear regression with a single-ตำแหน่ง binding แบบจำลอง. Curve fitting was performed using Kaleida Graph
ver 4.1.1 software. (Synergy Software)


. [00244]

Example 21.

The resulting calculated IC50 values are summarized in Table 11 below


[00245] Example 21: In vivo plasma half-life of PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน


[00246] The conjugation of ไลโปคาลิน มิวทีน with a moiety that can target a specific body บริเวณ, organism, tissue, organ หรือ cell may extend the half-life of the ไลโปคาลิน มิวทีน in the body. For example, half-life of human serum albumin (HSA) was reported to be ~19 days (Biochimica et Biophysica Acta 1830; 5526-5534, 2013) and therefore PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 82) were conjugated to an albumin binding protein (such as Gl48 and SEQ ID NO: 85) that ยึดเกาะ to HSA, and therefore, may exhibit long half-life in the body for the ไลโปคาลิน มิวทีน.

[00247] To observe the effect of conjugation with albumin binding protein and to determine plasma long half-life of PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัดอุณหภูมิของมิวทีน PCSK9 เฉพาะเพิ่มประสิทธิภาพการละลาย[00223] เพื่อกำหนดอุณหภูมิละลายของ PCSK.9-specificมิวทีน ตัวอย่างที่เข้มข้นโปรตีนของ lrng/ml ใน PBS (Gibco) สแกน (25-100° C) ที่ IC/min ใช้เครื่องมือ nanoDSC เส้นเลือดฝอย (Q2000 เครื่องมือ TA) ซอฟต์แวร์รวมคำนวณอุณหภูมิละลาย™จาก thermogram แสดง[00224] งบละลายอุณหภูมิสำหรับไลโปคาลินมิวทีนสอง (ลำดับ ID ไม่:22 และลำดับ ID ไม่: 13) กับตราสารอนุพันธ์เพิ่มประสิทธิภาพ therefrom (ลำดับ ID ไม่: 62 -71) ได้สรุปไว้ในตาราง 9 ด้านล่าง ตัวอย่าง ข้อมูลแสดงว่า Tms ของลำดับรหัสไม่มี:63 เลขลำดับ ID: 64 และเลขลำดับ ID: 65 ได้อย่างมีนัยสำคัญสูงกว่าเมื่อเทียบกับลำดับ ID ไม่:13 และของละลายถูกเปลี่ยน โดยถึง 13° C (รูป 12)[00225] ตาราง 9:+++ตัวอย่าง [00226] 17: แอฟฟินิตี้ไลโปคาลินเพิ่มประสิทธิภาพอนุพันธ์เพื่อ PCSK9[00227] วัดแอฟฟินิตี้ผูกกับ biotinylated PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีน วิเคราะห์ผิว Plasmon การสั่นพ้อง (คอฟฟี่ช็อป/) โดยกลุ่มตัวแทนมนุษย์ถูกลูกจ้างใช้เครื่องมือ Biacore T200 (GE สุขภาพ) สำหรับทดสอบแอฟฟินิตี้คอฟฟี่ช็อป/ มีใช้ชุดอุปกรณ์จับไบโอติน (GE สุขภาพ)[00228] ในแต่ละรอบการประเมิน รีเอเจนต์ในการจับภาพไบโอติน (GE สุขภาพ) ใช้เพื่ออ้างอิงและประเมินช่องของเซ็นเซอร์ชิหมวก (GE สุขภาพ) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหลของ ul 2 min, Biotinylated PCSK9 ที่ความเข้มข้นของมล 4 ยูจีถูกฉีดบนสถานีวัดใน 2 นาทีในการ: อัตราการไหลของ µ1 10 นาที กำหนดแอฟฟินิตี้ dilutions 3-4 ของลำดับ ID ไม่: 62-71 ถูกเตรียมใน HBS-EP + (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 MNaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) บัฟเฟอร์ และการนำไปใช้กับพื้นผิว ชิใช้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 128 nM, 32 nM, 8 nM และ 4 nM วิเคราะห์ผูกถูกดำเนินการ ด้วยเวลาติดต่อนาที 3, dissociation เวลา 20 นาทีและใช้การ: ขั้นตอนอัตรานาทีละ 30 µ1 ดำเนินการประเมินทั้งหมดที่ 25 องศาเซลเซียส ฟื้นฟูของการเซ็นเซอร์ชิปหมวกผิวสำเร็จกับฉีดของ HCl กัวนิดีน 6 M กับ 0.25 M NaOH (2 นาที) ตาม ด้วยการซักเพิ่มเติมบัฟเฟอร์และเป็นเวลา 2 นาทีก่อนการวัดเสถียรภาพ ทำการปรับวงจรหนึ่งที่ประกอบด้วยสามขั้นตอนฟื้นฟูต่อเนื่อง มีประเมินข้อมูล ด้วยซอฟแวร์ Biacore ประเมิน T200 (V 1.0) การอ้างอิงคู่ใช้ แบบจำลอง 1:1 ผูกใช้ให้พอดีกับข้อมูลดิบ[00229] งบพอโค้งสำหรับมิวทีนไลโปคาลินของเลขลำดับ ID: 62-71 แสดงในรูปที่ 13 (A-J), ตามลำดับ ข้อมูลแสดงที่แอฟฟินิตี้มิวทีนไลโปคาลินเสถียรเทอร์โม (ลำดับ ID ไม่: 62-71) ทั้งหมดได้ถูกเก็บไว้เปรียบเทียบกับมิวทีนไลโปคาลินของเลขรหัสลำดับ: 13 และเลขลำดับ ID: 22 ความสัมพันธ์อัตราค่าคงที่ k คอนหรือขณะ dissociation อันดับ koff• หรือ kd ค่าคงผลลัพธ์ dissociation คงช็อปปิ้งสำหรับมิวทีนไลโปคาลินกล่าวว่าได้สรุปไว้ใน 10 ตารางด้านล่าง[00230] ตาราง 10:+++ ตัวอย่าง [00231] 18: รับผลิตกระป๋องผลิตเฉพาะ PCSK9 มิวทีนใน E. coliมิวทีนไลโปคาลิน PCSK9 เฉพาะ [00232] (ลำดับ ID ไม่: 62, 82, 83 และ 84) ถูกแสดงใน E. coli ดีเอ็นเอที่ต้องการเข้ารหัสแต่ละมิวทีนไลโปคาลิน (ลำดับ ID ไม่: 86, 87, 88 และ 89 ตามลำดับ) ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ในทำนองเดียวกันตัดซึ่งอนุญาตให้แบคทีเรียผลิตมิวทีนภายใต้การควบคุมของ TS โปรโมเตอร์ (ในกรณีไม่มีรหัสลำดับ: 62, 82 และ 84) โปรโมเตอร์หรือ T7A3 การ (ในกรณีไม่มีรหัสลำดับ: 83) มิวทีนมีบริสุทธิ์จาก lysates เซลล์ โดยวิธี chromatography คอลัมน์โดยใช้คอลัมน์ anion exchange, phenyl sepharose คอลัมน์ คอลัมน์กรองเจ และ chelating คอลัมน์ (ในกรณีที่เลขลำดับ ID: 82 และ 84) มิวทีนบริสุทธิ์ถูกสุด solubilized ใน PBSตัวอย่าง [00233] 19: การวิเคราะห์ Biacore[00234] ดำเนินกระบวนงานทั้งหมดกับ Biacore T200 (GE สุขภาพ) ที่ 25 องศาเซลเซียส มี HBS-EP + บัฟเฟอร์ (10 มม. HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, EDTA 3 มม. และ 0.05% surfactant P20) ถูกใช้เรียกใช้บัฟเฟอร์ Biotinylation ของโปรตีน PCSK9 ทำในลักษณะทั่วไปที่ใช้รีเอเจนต์ติดฉลาก อีซี่ลิงค์ Sulfo-NHS-LC-LC-ไบโอติน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์), และ unreacted reagents ถูกลบ โดยการ desalting คอลัมน์หมุน การจับภาพไบโอตินชุดอุปกรณ์ (GE สุขภาพ) ถูกใช้เพื่อ immobilize ลิแกนด์ biotinylated PCSK9 กับเซนเซอร์ชิ Flowcells บนชิพเซ็นเซอร์ หมวกก่อนตรึง ด้วย oligo เป็น ss DNA ได้เป็น ด้วย oligo เสริม ss-DNA กลวงกับสเตรปทาวิดิน และตาม ด้วยการฉีดลิแกนด์ biotinylated[00235] สำหรับการทดลองจับ conjugates สเตรปทาวิดิน-ดีเอ็นเอถูกฉีดไป flowcells สองสำหรับ 20 วินาที และตัวอย่าง PCSK9 biotinylated ผสมกับ ng 1 µl ในบัฟเฟอร์ทำแล้ว ฉีดไป flowcell หนึ่งใน 1 นาทีที่ 10 µ1/min ในขณะที่เหลืออีก flowcell โดยตัวอย่างจับให้ผิวอ้างอิง โพรโทคอลจับถูกออกแบบมาให้จับระดับของลิแกนด์ตัวอย่างที่ส่งผลให้ไม่มากกว่า 20 Rm.axvalues RU[00236] ในการทดลองแต่ละเดิม ๆ แตกต่างกันที่ความเข้มข้นของมิวทีนไลโปคาลิน PCSK9 เฉพาะบริสุทธิ์ตั้งแต่ 0.03 nM 100 nM ได้เตรียมไว้เป็น analytes และหัวฉีดสำหรับ 300 วินาทีที่ 30 µ1 minfollowed 30 นาทีของ dissociation โดย จับ และมีสร้างผิวอ้างอิงกับชีพจรนาทีที่ 2 ของ 6 M กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์ใน 0.25 M โซเดียมไฮดรอกไซด์ [00237] คง dissociation (K.Ds) ถูกคำนวณโดยใช้แบบ 1:1 Langmuir ผูกแบบจำลอง ชุดข้อมูลดิบได้วิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ประเมิน T200 Biacore (เวอร์ชัน 1.0 สุขอนามัยการ GE), และ sensorgrams ของ flowcells อ้างอิงถูกลบจาก sensorgrams ของ flowcells จับตัวอย่าง [00238][00239] ตัวอย่างที่ 20: เซลล์วิเคราะห์ PCSK9 LDLR TR-ไม่สบายใจฟรีSecreted PCSK9 ช่วยย่อยสลายของตับ LDLR นำไป เพิ่มขึ้นระดับ LDL-C serum ดังนี้เฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีนซึ่งรบกวนการโต้ตอบระหว่าง PCSK9 และ LDLR ผลของการรีไซเคิลของ LDLR การพลาสมาเมมเบรน ที่เปิดใช้งานปริมาณ LDL-C และลดระดับ LDL-C หมุนเวียนในที่สุดเซลล์ [00240] วิเคราะห์ TR-ไม่สบายใจฟรีถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะพิเศษของไลโปคาลินมิวทีนลิปกลอสไข (ลำดับ ID ไม่: 62 เลขรหัสลำดับ: 82 เลขลำดับ ID: 83 และเลขรหัสลำดับ: 84) บนผูกระหว่าง PCSK9 และ LDLR ชื่อไบโอติน hPCSK9 (ไบโอติน-hPCSK9) ใช้ในการวิเคราะห์ถูกเตรียม โดยบ่มเวลา 5 ที่เกินสบของรีเอเจนต์ EZ-ลิงค์ NHSChromogenic ไบโอติน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและส่วนที่เกินของไบโอตินถูกเอาออก โดยคอลัมน์แน็ป illustra (GE สุขภาพวิทยาศาสตร์) LDLR ป้ายยูโรเพียม (Eu-LDLR) เตรียมไว้ตามที่อธิบายไว้ในรายการก่อนหน้านี้ (Fisher TS, et al., J. Biol. Chem. (2007) 282(28), 20502 20512)[00241] เซลล์ฟรี PCSK9 LDLR TR-ไม่สบายใจทดสอบที่ดำเนินการในรูปแบบดี 384 เข้มข้นสุดท้ายของ 20 nM ของไบโอติน hPCSK9 ได้ incubated มีหลายความเข้มข้นของมิวทีนไลโปคาลินทดสอบในบัฟเฟอร์รวม (10 มม. HEPES, pH 7.4, 150 มม. NaCl, 0.1 มม. CaCh และ 0.05% (w/v) บีเอสเอ) สองชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในการขาดงานหรือสถานะของ 34 mg/ml ของมนุษย์ serum albumin แล้ว 10 ไมโครลิตรของเหนือสารละลายไบโอติน-hPCSK9-ไลโปคาลินและ 10 ไมโครลิตรของ Eu LDLR/Alexa-ซาสารละลาย (1.0 nM Eu LDLR การ 80 nM สเตรปทาวิดิน/Alexa Fluor 647 ค่าสังยุค (lnvitrogen), 10 มม. HEPES, pH 7.4, NaCl, 150 มม.0.1 mM CaCh, and 0.05% (w/v) BSA) was mixed in the well and incubated for two hours at room temperature in the dark followed by incubation overnight in the refrigerator. Samples were read using a BMG Lab Systems Rubystar Reader set to read 20 flashes/well with a 50-µs integration delay and a 200-µs integration time for a total read time of 1100 ms/well. FRET was quantified by measurement of the emission ratio at 665/620 nm. TR-FRET ratio was calculated as following formulation.[00242] TR-FRET Ratio= (counts at 665 nm/counts at 620 nm) x 10,000 [00243] To obtain the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration at which การประกอบขึ้น of the PCSK9/LDLR complex• was blocked by 50% (IC50), the curves were fitted by nonlinear regression with a single-ตำแหน่ง binding แบบจำลอง. Curve fitting was performed using Kaleida Graphver 4.1.1 software. (Synergy Software) . [00244]Example 21. The resulting calculated IC50 values are summarized in Table 11 below [00245] Example 21: In vivo plasma half-life of PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน[00246] conjugation ของมิวทีนไลโปคาลินกับ moiety ที่สามารถกำหนดเป้าหมายเฉพาะร่างกายบริเวณ สิ่งมีชีวิต เนื้อเยื่อ อวัยวะหรือเซลล์ อาจขยาย half-life ของมิวทีนไลโปคาลินในร่างกายได้ เช่น half-life ของมนุษย์ serum albumin (HSA) เป็นรายงานที่จะ ~ 19 วัน (Biochimica et Biophysica คตา 1830; 5526-5534, 2013) และดังนั้นเฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีน (ลำดับ ID ไม่: 62 และเลขรหัสลำดับ: 82) ได้กลวงจะมี albumin ผูกโปรตีน (Gl48 และเลขรหัสลำดับ: 85) ที่ยึดเกาะกับ HSA อาจจัดดังนั้น half-life ยาวในตัวสำหรับไลโปคาลินมิวทีน[00247] สังเกตผลของการ conjugation ด้วยโปรตีน albumin ผูก และกำหนด half-life ยาวพลาสม่าของเฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวัดการละลายอุณหภูมิ PCSK9- เพิ่มประสิทธิภาพเฉพาะมิวทีน[00223] การตรวจสอบละลายอุณหภูมิ PCSK.9 เฉพาะมิวทีนตัวอย่างที่มีความเข้มข้นของโปรตีน lrng / ml ในพีบีเอส (Gibco) ถูกสแกน (25 100 ° C) ที่ IC / นาทีโดยใช้เครื่องมือของเส้นเลือดฝอย nanoDSC (ที่โมเด็ม Q2000, TA Instruments) ซอฟแวร์แบบบูรณาการคำนวณอุณหภูมิหลอมละลาย™จาก thermogram แสดง. [00224] อุณหภูมิละลายส่งผลให้ทั้งสองไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 13) พร้อมกับการซื้อขายสัญญาซื้อขายล่วงหน้าที่ดีที่สุด นั้น (SEQ ID NO: 62- 71) ได้สรุปไว้ในตารางที่ 9 ด้านล่าง ตัวอย่างเช่นข้อมูลที่แสดงให้เห็นว่า Tms ของ SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 และ SEQ ID NO: 65 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับที่สูงขึ้นเพื่อ SEQ ID NO: 13 และเริ่มมีอาการของการละลายที่ถูกขยับขึ้นถึง 13 ° C ( รูปที่ 12). [00225] ตารางที่ 9: +++ [00,226] ตัวอย่าง 17: แอฟฟินิตี้ที่ดีที่สุดของไลโปคาลินสัญญาซื้อขายล่วงหน้าเพื่อ PCSK9 [00227] เพื่อตรวจจับแอฟฟินิตี้ที่จะ PCSK9 มนุษย์ biotinylated ของกลุ่มตัวแทนของไลโปคาลินมิวทีนซึ่งเป็นพื้นผิว Plasmon Resonance (SPR) ทดสอบตามถูกจ้างมาใช้เป็นเครื่องมือ Biacore T200 (GE Healthcare) สำหรับ SPR แอฟฟินิตี้ทดสอบที่ไบโอตินจับภาพชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) ถูกนำมาใช้. [00,228] ในวงจรการวัดแต่ละไบโอตินจับภาพ Reagent (GE Healthcare) ถูกนำไปใช้อ้างอิงและช่องทางวัดของเซนเซอร์ CAP ชิป ( GE Healthcare) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหล 2 ยู / นาที, biotinylated PCSK9 ที่ความเข้มข้น 4 ไมโครกรัม / การมิลลิลิตรฉีดในช่องทางวัดเป็นเวลา2 นาทีในอัตราการไหลของ 10 μ1 / นาที เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้, 03:57 เจือจางของ SEQ ID NO: 62-71 ได้จัดทำขึ้น HBS-EP + (0.01 M HEPES ค่า pH 7.4 0.15 MNaCl, EDTA 3 มิลลิ, 0.005% ลดแรงตึงผิว P20) บัฟเฟอร์และนำไปใช้ พื้นผิวชิปโดยใช้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 128 นาโนเมตร 32 นาโนเมตร, 8 นาโนเมตรและ 4 นาโนเมตร การวิเคราะห์ผลผูกพันได้รับการดำเนินการที่มีเวลาเป็นเพื่อนกับ 3 นาทีเวลาของการแยกตัวออก 20 นาทีและใช้: การไหลอัตรา30 μ1 / นาที วัดทั้งหมดได้ดำเนินการที่ 25 ° C การฟื้นฟูของเซนเซอร์ผิว CAP ชิปก็ประสบความสำเร็จด้วยการฉีด 6 M กัวนิดีน -HCl 0.25 M NaOH (2 นาที) ตามด้วยการล้างเป็นพิเศษกับการทำงานบัฟเฟอร์และระยะเวลาการรักษาเสถียรภาพของ 2 นาที ก่อนที่จะมีการตรวจวัดที่หนึ่งรอบเครื่องประกอบด้วยสามขั้นตอนการฟื้นฟูได้ดำเนินการติดต่อกัน ข้อมูลการประเมินด้วยซอฟแวร์ Biacore T200 ประเมินผล (V 1.0) อ้างอิงคู่ถูกนำมาใช้ 1: 1 ที่มีผลผูกพันแบบจำลองถูกนำมาใช้เพื่อให้พอดีกับข้อมูลดิบ. [00229] ผลโค้งเหมาะสำหรับไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 62-71 จะแสดงในรูปที่ 13 (AJ) ตามลำดับ . ข้อมูลที่แสดงให้เห็นว่าแอฟฟินิตี้ของเทอร์โมมีความเสถียรไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 62-71) จะถูกเก็บไว้อย่างเต็มที่เมื่อเทียบกับไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 13 และ SEQ ID NO: 22 อัตราคงที่สมาคม k, หรือคนนี้ขณะที่ค่าคงที่อัตราการแยกตัวออก KD หรือ Koff •ค่าคงที่แยกออกจากกันส่งผลให้ Kn กล่าวว่าสำหรับไลโปคาลินมิวทีนได้สรุปไว้ในตารางที่ 10 ด้านล่าง. [00230] ตาราง 10: +++ [00,231] ตัวอย่างที่ 18: การผลิต PCSK9 เฉพาะ Tic มิวทีนในเชื้อ E. coli [00232] PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 62, 82, 83 84) ได้รับการแสดงในเชื้อ E. coli การเข้ารหัสดีเอ็นเอแต่ละไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 86, 87, 88 และ 89 ตามลำดับ) ถูกแทรกลงในทำนองเดียวกันตัดเวกเตอร์ที่ได้รับอนุญาตการผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของ TS โปรโมเตอร์ (ในกรณีของ SEQ ID NO: 62, 82 และ 84) หรือ T7A3 โปรโมเตอร์ (ในกรณีของ SEQ ID NO: 83) มิวทีนถูกบริสุทธิ์จาก lysates เซลล์ด้วยการผสมผสานวิธีการใช้คอลัมน์คอลัมน์แลกเปลี่ยนประจุลบ phenyl Sepharose คอลัมน์คอลัมน์กรองคอลัมน์เจลและคีเลต (ในกรณีของ SEQ ID NO นี้: 82 และ 84) บริสุทธิ์มิวทีนถูกละลายในที่สุดพีบีเอส. [00233] ตัวอย่างที่ 19: การวิเคราะห์ Biacore [00234] ขั้นตอนทั้งหมดถูกดำเนินการกับ Biacore T200 (GE Healthcare) ที่ 25 ° C บัฟเฟอร์ HBS-EP + (10 มิลลิ HEPES ค่า pH 7.4 0.15 M NaCl, EDTA 3 มิลลิและ 0.05% ลดแรงตึงผิว P20) ถูกใช้เป็นที่ทำงานบัฟเฟอร์ biotinylation ของโปรตีน PCSK9 ได้ดำเนินการในลักษณะทั่วไปใช้น้ำยาติดฉลากที่ EZ-Link Sulfo-พลุกพล่าน-LC-LC-ไบโอติน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) และน้ำยา unreacted ถูกถอดออกจากคอลัมน์หมุน desalting จับไบโอตินชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) ถูกใช้ในการคลื่อน biotinylated PCSK9 ลิแกนด์ชิปเซ็นเซอร์ Flowcells ใน CAP ชิปเซ็นเซอร์ก่อนการตรึงกับ Oligo ss ดีเอ็นเอถูกไฮบริดที่มี Oligo ss-DNA ประกอบผันกับสเตรปทาวิดินและตามด้วย biotinylated ลิแกนด์ฉีด. [00235] สำหรับ ทดลองจับสเตรปทาวิดิน conjugates -DNA ถูกฉีดสอง flowcells 20 วินาที; และตัวอย่าง PCSK9 biotinylated ถูกลดลงเหลือ 1 ng / ไมโครลิตรในบัฟเฟอร์ทำงานแล้วฉีดให้เป็นหนึ่ง Flowcell 1 นาทีที่ 10 μ1 / นาทีขณะที่ Flowcell อีกเหลือโดยไม่ต้องจับตัวอย่างเพื่อให้พื้นผิวที่อ้างอิง โปรโตคอลการจับภาพได้รับการออกแบบเพื่อให้ระดับการจับตัวของลิแกนด์ตัวอย่างที่ทำให้เกิดการ Rm.axvalues ​​ไม่เกิน 20 RU. [00236] สำหรับการทดสอบการเคลื่อนไหวแต่ละความเข้มข้นที่แตกต่างของ PCSK9- บริสุทธิ์เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน ตั้งแต่ 0.03 นาโนเมตรถึง 100 นาโนเมตรได้จัดทำขึ้นเป็นวิเคราะห์และฉีด 300 วินาทีวันที่ 30 μ1 / minfollowed 30 นาทีของการแยกตัวออก . จับและพื้นผิวการอ้างอิงที่ถูกสร้างใหม่มี 2 นาทีชีพจรของ 6 M กัวนิดีนไฮโดรคลอไรใน 0.25 M โซดาไฟ[00237] ค่าคงที่แยกออกจากกัน (K.Ds) ได้รับการคำนวณโดยใช้ 1: 1 Langmuir ผูกพันแบบจำลอง ชุดข้อมูลดิบที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้ Biacore T200 ประเมินซอฟต์แวร์ (รุ่น 1.0 GE Healthcare) และ sensorgrams ของ flowcells อ้างอิงถูกหักออกจากsensorgrams ของกลุ่มตัวอย่างจับ flowcells ได้. [00238] [00239] ตัวอย่าง 20: มือถือฟรี PCSK9 -LDLR ทดสอบ TR-ฉลุหลั่งPCSK9 อำนวยความสะดวกในการย่อยสลายของ LDLR ตับที่นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของระดับLDL-C เซรั่ม ดังนั้นไล PCSK9 เฉพาะโปคาลินมิวทีนที่ยุ่งเกี่ยวกับการทำงานร่วมกันระหว่าง PCSK9 และ LDLR ที่มีผลในการเพิ่มประสิทธิภาพของการรีไซเคิลของ LDLR ไปเยื่อหุ้มซึ่งเปิดใช้งานไอดี LDL-C และในที่สุดก็ลดระดับ LDL-C หมุนเวียน . ระดับ[00240] มือถือฟรีทดสอบ TR-ฉลุถูกใช้ในการตรวจสอบผลการยับยั้งของไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 และ SEQ ID NO: 84) ในวันที่มีผลผูกพันระหว่าง PCSK9 และ LDLR ไบโอตินที่มีข้อความ hPCSK9 (ไบโอติน-hPCSK9) ที่ใช้ในการทดสอบที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการบ่มด้วย 5 ครั้งส่วนที่เกินโมลของ EZ-Link NHSChromogenic ไบโอตินสาร (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและส่วนที่เกินจากไบโอตินถูกลบออกโดยคอลัมน์ NAP ภาพประกอบ (GE Healthcare วิทยาศาสตร์ชีวภาพ) LDLR ยูโรเพียมติดฉลาก (Eu-LDLR) ถูกจัดทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ในรายงานก่อนหน้า (ฟิชเชอร์ TS, et al., เจ Biol. Chem. (2007) 282 (28) 20,502-20,512). [00241] มือถือฟรี PCSK9 -LDLR ทดสอบ TR-ฉลุได้ดำเนินการในรูปแบบเดียวกับ 384 ความเข้มข้นสุดท้ายของ 20 นาโนเมตรของไบโอติน-hPCSK9 ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นหลายของการทดสอบไลโปคาลินมิวทีนในผลผูกพันบัฟเฟอร์ (10 มิลลิ HEPES พีเอช 7.4, 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 0.1 มิลลิ Cach และ 0.05% (w / v) BSA) สำหรับสองชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่ที่มีการขาดหรือ 34 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรซีรั่มอัลบูมิมนุษย์ จากนั้นสิบไมโครลิตรข้างต้นไบโอติน-hPCSK9- ไลโปคาลินสารละลายสิบไมโครลิตรของ Eu-LDLR / Alexa-SA สารละลาย (1.0 นาโนเมตรของ Eu-LDLR 80 นาโนเมตรของสเตรปทาวิดิน / Alexa Fluor 647 คอนจูเกต (lnvitrogen), 10 มิลลิ HEPES พีเอช 7.4, 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.1 มิลลิ Cach และ 0.05% (w / v) บีเอสเอ) ได้รับการผสมได้ดีและบ่มเป็นเวลาสองชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืดตามด้วยการบ่มค้างคืนใน ตู้เย็น. ตัวอย่างถูกอ่านโดยใช้ BMG Lab ระบบ Rubystar อ่านตั้งอ่าน 20 กะพริบ / ดีที่มีความล่าช้าบูรณาการ 50 ไมโครวินาทีและเวลาการรวม 200 ไมโครวินาทีเป็นเวลารวมของการอ่าน 1100 มิลลิวินาที / ดี ฉลุถูกวัดโดยการวัดอัตราการปล่อยก๊าซเรือนกระจกที่ 665/620 นาโนเมตร อัตราส่วน TR-ฉลุที่คำนวณได้ดังต่อไปนี้สูตร. [00242] อัตราส่วน TR-ฉลุ = (นับที่ 665 นาโนเมตร / นับที่ 620 นาโนเมตร) x 10,000 [00243] การขอรับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นที่การ ประกอบขึ้นของ PCSK9 / LDLR ซับซ้อน•ถูกบล็อกโดย 50% (IC50) เส้นโค้งพอดีโดยการถดถอยเชิงเส้นเดียวกับตำแหน่งที่มีผลผูกพันแบบจำลอง ปรับเส้นโค้งได้รับการดำเนินการโดยใช้กราฟ Kaleida เวอร์ชั่น 4.1.1 ซอฟแวร์ (Synergy Software) [00244] ตัวอย่าง 21. คำนวณค่า IC50 ได้สรุปไว้ในตารางด้านล่าง 11 ผล[00245] ตัวอย่าง 21: พลาสม่าในร่างกายครึ่งชีวิตของ PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน[00246] ผันของไลโป คาลินมิวทีนที่มีครึ่งหนึ่งที่สามารถกำหนดเป้าหมายของร่างกายโดยเฉพาะบริเวณที่มีชีวิตเนื้อเยื่ออวัยวะหรือเซลล์อาจขยายครึ่งชีวิตของไลโปคาลินมิวทีนในร่างกาย ยกตัวอย่างเช่นครึ่งชีวิตของซีรั่มอัลบูมิมนุษย์ (HSA) มีรายงานว่าจะเป็น ~ 19 วัน (Biochimica et Biophysica Acta 1830; 5526-5534, 2013) และดังนั้นจึง PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน (ID SEQ NO: 62 SEQ ID NO: 82) ได้รับการผันไปยังอัลบูมิโปรตีน (เช่น Gl48 และ SEQ ID NO: 85) ที่ยึดเกาะเพื่อ HSA และดังนั้นจึงอาจมีครึ่งชีวิตยาวในร่างกายสำหรับไลโป คาลินมิวทีน. [00247] เพื่อสังเกตผลของการผันกับโปรตีนชนิดหนึ่งที่มีผลผูกพันโปรตีนและเพื่อตรวจสอบพลาสม่ายาวครึ่งชีวิตของ PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวัดอุณหภูมิละลายเพิ่มประสิทธิภาพ pcsk9 - เฉพาะมิวทีน

[ เป็นตัวแทน ] เพื่อตรวจสอบอุณหภูมิละลายของ pcsk . 9-specific มิวทีน ตัวอย่าง ที่ความเข้มข้นของสารละลายโปรตีน lrng / ml ใน PBS ( gibco ) สแกน ( ตั้งแต่ 25 ° C ) ที่ IC / นาที ใช้ปลายนิ้ว nanodsc เครื่องดนตรี ( q2000 TA เครื่องมือ )รวมซอฟต์แวร์คำนวณอุณหภูมิหลอมเหลว™จากแสดงเทอร์โมแกรม

[ 00224 ] ส่งผลให้อุณหภูมิละลายสำหรับสองไลโปคาลินมิวทีน ( seq id :

ที่ 22 และ seq id : 13 ) พร้อมกับปรับจากอนุพันธ์ ( seq ไม่มี ID : 62 -

71 ) สรุปตารางด้านล่าง . ตัวอย่างเช่น ข้อมูลแสดงให้เห็นว่างานของ seq ไม่มี ID :

63 , seq id ไม่ :64 และ seq ไม่มี ID : 65 มีค่าสูงกว่าเมื่อเทียบกับ seq id :

13 และเริ่มละลายก็ขยับได้ถึง 13 ° C ( รูป 12 )


[ 00225 ] ตารางที่ 9 :




[ 00226 ] ตัวอย่าง 17 : แอฟฟินิตี้ไลโปคาลินที่มีอนุพันธ์ pcsk9


[ 00227 ] วัดแอฟฟินิตี้ผูกพันกับไล pcsk9 มนุษย์ของตัวแทนกลุ่มไลโปคาลินมิวทีน พื้นผิว PLASMON เรโซแนนซ์ ( SPR ) ตามวิธีใช้ ใช้ biacore t200 เครื่องดนตรี ( GE Healthcare ) สำหรับกลยุทธ์แอฟฟินิตี้ assay , biotin จับชุดอุปกรณ์ ( GE Healthcare ) คือใช้

[ 00228 ] ในแต่ละวัดรอบbiotin จับรีเอเจนต์ ( GE Healthcare ) มาใช้ในการอ้างอิงและช่องทางการวัดฝาครอบชิปเซ็นเซอร์ ( GE Healthcare )
5 นาที ที่อัตราการไหล 2 UL / มิน ไล pcsk9 ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรคือ
ฉีดบนวัดช่องสำหรับ 2 นาทีที่ 10 : อัตราการไหล µ 1 / นาที เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้ สามถึงสี่วิธีการ seq id ไม่ :62-71 เตรียมใน hbs-ep ( 0.01 M ฮีเปส pH 7.4 0.15 mnacl 3 mM EDTA , 0.005 % สารลดแรงตึงผิว p20 ) บัฟเฟอร์ และใช้กับพื้นผิวชิปโดยใช้ความเข้มข้นสุดท้าย 128 นาโนเมตร 32 nm , 8 nm และ 4 นาโนเมตร ( รวมครั้งนี้ด้วย ติดต่อ เวลา 3 นาที เวลา 20 นาที และการใช้อัตราการไหล
30 µ 1 / นาที วัดทั้งหมดจำนวน 25 ° Cใหม่ของชิปเซ็นเซอร์

หมวกพื้นผิวสําเร็จด้วยการฉีดยา 6 M HCl กับ NaOH กัวนิดีน - 0.25 เมตร ( 2 นาที ) ตามด้วยการล้างพิเศษกับวิ่งบัฟเฟอร์และเสถียรภาพเวลา 2 นาที ก่อนการวัด หนึ่งวงจรเครื่องปรับอากาศประกอบด้วยสามขั้นตอนการฟื้นฟูต่อเนื่องกำหนด ประมวลผลข้อมูลด้วยซอฟต์แวร์ประเมิน t200 biacore ( V 1.0 )คู่อ้างอิงที่ใช้ 1 : 1 แบบจำลองผูกใช้กับข้อมูลดิบ

[ : ] ผลทางเศรษฐกิจของไลโปคาลินพอดีมิวทีน seq ไม่มี ID : 62-71 แสดงในรูปที่ 13 ( a-j ) ตามลำดับ จากข้อมูลพบว่า แอฟฟินิตี้ของเทอร์โมไลโปคาลินมิวทีน seq id ไม่เสถียร ( :62-71 ) พร้อมสะสมเมื่อเทียบกับไลโปคาลินมิวทีน seq ของหมายเลข 13 และ seq id : 22 สมาคมค่าคงที่ K ค็อคคน ในขณะที่อัตราค่าคงที่การแตกตัวให้ KD ค็อค คอฟฟ์ - ค่าคงที่การแตกตัวในเพื่อบอกว่าไลโปคาลินมิวทีนสรุปได้ในตารางที่ 10 ข้างล่าง

[ 00230 ] ตารางที่ 10 :




[ 00231 ] ตัวอย่าง 18 :การผลิต pcsk9 เฉพาะ TIC มิวทีนใน E . coli


[ ] pcsk9 00232 เฉพาะไลโปคาลินมิวทีน ( seq id : 62 , 82 , 83 และ 84 ) ถูกแสดงออกใน E . coli ดีเอ็นเอเข้ารหัสแต่ละไลโปคาลินมิวทีน ( seq id : 86 , 87 , 88 และ 89ตามลำดับ ) คือแทรก เช่นเดียวกันตัดเวกเตอร์ซึ่งได้รับอนุญาตการผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ TS ( กรณีที่ seq id : 62 , 82 และ 84 ) ค็อคเป็น t7a3 โปรโมเตอร์ ( กรณีที่ seq id : 83 ) การมิวทีนมีความบริสุทธิ์จากเซลล์ lysates โดยการรวมกันของวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีโดยใช้คอลัมน์แลกเปลี่ยนแอนไอออน