Exon 8 analysisGenomic DNA samples

Exon 8 analysis
Genomic DNA samples were isolated from peripheral blood samples by standard techniques. PCR-based screening of the exon 8 of the ATP7B gene was conducted as previously described(2). Automated direct sequencing of both forward and reverse strands of the PCR products was performed using a Bigdye Terminator sequencing kit (Applied Biosystems) and an ABI 3100 DNA sequencer. All sequence data were compared to the normal gene sequence (NCBI reference mRNA sequence; NM_00053) using Bioedit Sequence Alignment Editor program(11).
A PCR-RFLP was designed to screen for the new C2297G mutation, in which a restriction site for the endonuclease HaeIII recognized the presence of the mutant nucleotide and three other restriction sites including nucleotide position 2153, 2207 and 2332. In the presence of the mutant nucleotide at position 2297, the 296-bp product is cleaved into five fragments of 53, 54, 92, 32 and 65 bp while the wild-type PCR products is cleaved into four fragments of 53, 54, 124, and 65 bp (Fig. 1b).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ exon 8แยกต่างหากจากตัวอย่างเลือดที่ต่อพ่วงจากมาตรฐานเทคนิค genomic DNA ตัวอย่างได้ ผลการคัดกรองของ exon 8 ของยีน ATP7B ได้ดำเนินการเป็น described(2) ก่อนหน้านี้ ลำดับโดยตรงอัตโนมัติของ strands ไปข้างหน้า และย้อนกลับของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกดำเนินการโดยใช้ชุดลำดับ Bigdye เทอร์มิเนเตอร์ (Biosystems ใช้) และการลักชัวรี่ 3100 DNA sequencer ลำดับข้อมูลทั้งหมดถูกเปรียบเทียบกับลำดับยีนปกติ (อ้างอิง NCBI mRNA ลำดับ NM_00053) ใช้ program(11) Bioedit ลำดับตำแหน่งแก้ไขPCR-RFLP ถูกออกแบบให้หน้าจอสำหรับการใหม่ C2297G กลายพันธุ์ ไซต์จำกัดสำหรับ endonuclease HaeIII รับรู้สถานะของนิวคลีโอไทด์กลายพันธุ์และสามจำกัดเว็บไซต์อื่น ๆ รวมถึงตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ 2153, 2207 และ 2332 ในต่อหน้าของการกลายพันธุ์นิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง 2297 ผลิตภัณฑ์ 296-bp จะแหวกเป็นชิ้น ๆ 5 ของ bp 53, 54, 92, 32 และ 65 ในขณะที่ผลิตภัณฑ์ชนิดป่า PCR จะแหวกเป็นชิ้น ๆ 4 53, 54, 124, 65 และ bp (Fig. 1b)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เอกซ์ซอน 8
การวิเคราะห์ตัวอย่างดีเอ็นเอจีโนมที่แยกได้จากตัวอย่างเลือดโดยใช้เทคนิคมาตรฐาน การตรวจคัดกรอง PCR-based ของเอกซ์ซอน 8 ยีน ATP7B ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2) อัตโนมัติลำดับโดยตรงของเส้นทั้งสองไปข้างหน้าและย้อนกลับของผลิตภัณฑ์ PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ชุดลำดับ Terminator Bigdye (Applied Biosystems) และซีเควนดีเอ็นเอ ABI 3100 ลำดับข้อมูลทั้งหมดถูกเมื่อเทียบกับยีนปกติ (NCBI ลำดับ mRNA อ้างอิง NM_00053). ใช้โปรแกรม Bioedit ลำดับการจัด Editor (11)
PCR-RFLP ถูกออกแบบมาเพื่อหน้าจอสำหรับการกลายพันธุ์ C2297G ใหม่ซึ่งในไซต์ข้อ จำกัด สำหรับ endonuclease HaeIII ได้รับการยอมรับการปรากฏตัวของเบสที่กลายพันธุ์และสามเว็บไซต์ข้อ จำกัด อื่น ๆ รวมทั้งตำแหน่งที่เบื่อหน่าย 2153, 2207 และ 2332. ในการปรากฏตัวของมนุษย์กลายพันธุ์ที่เบื่อหน่าย 2,297 ตำแหน่งผลิตภัณฑ์ 296 bp ถูกแยกออกเป็นห้าชิ้นส่วนของ 53, 54, 92, 32 และ 65 bp ในขณะที่ป่าประเภทผลิตภัณฑ์ PCR จะแยกออกเป็นสี่ชิ้นส่วนของ 53, 54, 124, 65 bp (รูป. 1b)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

8
8 การวิเคราะห์ดีเอ็นเอที่แยกได้จากตัวอย่างเลือด จำนวนอุปกรณ์ต่อพ่วงด้วยเทคนิคมาตรฐาน PCR ใช้คัดกรองของ exon 8 ของ atp7b ยีนดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 2 ) อัตโนมัติโดยตรงทั้งข้างหน้าและย้อนกลับลำดับของเส้นของผลิตภัณฑ์โดยการใช้ลำดับ bigdye Terminator Kit ( Applied Biosystems ) และ ABI 3100 DNA sequencer ได้ลำดับข้อมูลทั้งหมดถูกเปรียบเทียบกับลำดับยีนปกติ ( ncbi อ้างอิง mRNA ลำดับ ; nm_00053 ) โดยใช้โปรแกรม bioedit ลำดับตำแหน่ง ( 11 ) .
เป็นว่าถูกออกแบบมาเพื่อจอสำหรับการกลายพันธุ์ c2297g ใหม่ซึ่งในข้อ จำกัด เว็บไซต์สำหรับเอนโดนิวคลีเอส haeiii ยอมรับสถานะของยีนกลายพันธุ์ และสามอื่น ๆรวมทั้งเบสจำกัดเว็บไซต์ ของตำแหน่ง ,และ 2555 1 . ในการแสดงตนของยีนกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 2297 ผลิตภัณฑ์ , 296 BP จะแหวกออกเป็น 5 ชิ้นส่วนของ 53 , 54 , 92 , 32 และ 65 BP ในขณะที่ของ PCR ของผลิตภัณฑ์ออกเป็น 4 ชิ้นส่วนของ 53 , 54 , 124 และ 65 /
( รูป 1B )