Materials and MethodsREF and SRPP C

Materials and Methods

REF and SRPP Cloning, Expression and Purification

The SRPP gene (GenBank accession no. AJ223388) and the REF gene (GenBank accession no. X56535) were synthesized by GenScript (Piscataway, USA) after codon optimization and addition of a 6-histidine tag at the N-ter. Then they were cloned, respectively, in the NdeI–XhoI site of pET24a (Novagen Inc., WI, USA) to construct pET24a-6His-SRPP and pET24a-6His-REF. Each plasmid was introduced in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Gold cells. Bacteria were grown to 0.7 OD in 2×YT medium (16 g/L tryptone, 10 g/L yeast extract, and 5.0 g/L NaCl), and expression was induced by addition of 1 mM isopropyl-D-thiogalactoside (Euromedex, Souffelweyersheim, France). After 4 h induction, cells were harvested by centrifugation and frozen at −20°C. Overexpression of SRPP and REF caused inclusion body formation. Cells were sonicated 5×1 min in buffer A (150 mM NaCl and 100 mM Tris-HCl, pH 8.0). The lysate was centrifuged for 30 min at 20,000 g. The pellet was washed in the buffer A and resuspended in denaturing buffer (8 M urea in buffer A). The lysate was incubated with 2 mL Ni-NTA resin (InVitrogen, ThermoScientifique, Illkirch, France) for 1 h at room temperature. The resin was then washed twice with 35 mL of 8 M urea/buffer A, by centrifuging 10 min at 900 g. The proteins were eluted from the resin in the same buffer containing 250 mM imidazole (Euromedex). Protein samples were pooled and dialyzed against buffer A ±10% glycerol and kept aliquoted at −80°C. This yields ∼2–4 mg of peptide per liter of culture. The peptide was pure as judged by analysis on 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis followed by Coomassie Blue staining. Protein concentrations were determined by quantitative amino-acid analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการอ้างอิง และโคลน SRPP นิพจน์ และบริสุทธิ์ยีน SRPP (GenBank เข้าไม่ AJ223388) และยีน REF (GenBank เข้าไม่ 56535 X) ถูกสังเคราะห์ โดย GenScript (เวย์ สหรัฐอเมริกา) หลังจากรหัสพันธุกรรมในการเพิ่มประสิทธิภาพและเพิ่มแท็ก 6 histidine ที่ N-เธอ แล้วจะมีโคลน ตามลำดับ ในเว็บไซต์ NdeI-XhoI ของ pET24a (Novagen Inc., WI สหรัฐอเมริกา) เพื่อสร้าง SRPP/6His/pET24a และ pET24a-6His-REF แนะนำแต่ละ plasmid ใน Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS เซลล์ทอง แบคทีเรียถูกปลูกไป OD 0.7 ใน 2 × YT (tryptone 16 บัญชี สารสกัดจากยีสต์ 10 g/L และ 5.0 g/L NaCl), และนิพจน์ถูกเหนี่ยวนำ โดยเพิ่ม 1 มม. isopropyl-D-thiogalactoside (Euromedex, Souffelweyersheim ฝรั่งเศส) หลังจาก 4 ชั่วโมงเหนี่ยวนำ เซลล์เก็บเกี่ยว โดยการหมุนเหวี่ยง และแช่แข็งที่ −20 องศาเซลเซียส Overexpression SRPP และ REF เกิดก่อตัวรวมร่าง เซลล์ถูก sonicated 5 × 1 นาทีในบัฟเฟอร์ A (NaCl 150 มม.และ 100 มม.ทริ HCl ค่า pH 8.0) การ lysate ของถูกเหวี่ยง 30 นาทีที่ 20,000 กรัม เม็ดถูกล้างในบัฟเฟอร์ A และ resuspended ใน denaturing บัฟเฟอร์ (8 เมตรผสมในบัฟเฟอร์ A) การ lysate ของถูกได้รับการกกกับ 2 มล.มูลค่า Ni เรซิน (InVitrogen, ThermoScientifique ได้ ฝรั่งเศส) ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง ถูกแล้วซักสองเท่ากับ 8 เมตรยูเรีย/บัฟเฟอร์ A, 35 mL โดยเหวี่ยง 10 นาทีที่ 900 กรัม โปรตีนถูก eluted จากเรซิ่นในบัฟเฟอร์เดียวกันที่ประกอบด้วยอิมิดาโซล 250 มม. (Euromedex) ตัวอย่างโปรตีนถูกพู dialyzed กับบัฟเฟอร์เป็น± 10% กลีเซอรอล และเก็บไว้ที่ aliquoted ที่ −80 องศาเซลเซียส นี้ทำให้ ∼2 – 4 มิลลิกรัมของเปปไทด์ต่อลิตรของวัฒนธรรม เปปไทด์ไม่บริสุทธิ์เป็นตัดสินวิเคราะห์ 15% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต polyacrylamide เจอิตาม ด้วย Coomassie Blue ย้อมสี ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนด โดยการวิเคราะห์เชิงปริมาณกรดอะมิโน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการREF และ SRPP โคลนการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์SRPP ยีน (GenBank ภาคยานุวัติไม่มี. AJ223388) และยีนอ้างอิง (GenBank ภาคยานุวัติไม่มี. X56535) ถูกสังเคราะห์โดยเจนสคริปต์ (พิสแคต, สหรัฐอเมริกา) หลังจากการเพิ่มประสิทธิภาพ codon และนอกเหนือจาก 6- แท็กฮิสติดีนที่ N-ตรี แล้วพวกเขาก็ถูกโคลนตามลำดับในเว็บไซต์ NdeI-XhoI ของ pET24a (Novagen อิงค์, WI, USA) เพื่อสร้าง pET24a-6His-SRPP และ pET24a-6His-REF แต่ละพลาสมิดเป็นที่รู้จักใน Escherichia coli BL21 เซลล์ (DE3) pLysS ทอง แบคทีเรียเติบโตขึ้น 0.7 OD ใน 2 × YT ขนาดกลาง (16 กรัม / ลิตร Tryptone 10 กรัม / ลิตรสารสกัดจากยีสต์และ 5.0 กรัม / ลิตรโซเดียมคลอไรด์) และการแสดงออกถูกชักนำโดยนอกเหนือจาก 1 มิลลิ isopropyl-D-thiogalactoside (Euromedex, Souffelweyersheim ฝรั่งเศส) หลังจาก 4 ชั่วโมงการเหนี่ยวนำเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส แสดงออกของ SRPP และ REF ที่เกิดจากการก่อตัวของร่างกายรวม เซลล์ที่ถูก sonicated 5 × 1 นาทีในบัฟเฟอร์ A (โซเดียมคลอไรด์ 150 มิลลิเมตรและ 100 มิลลิเมตร Tris-HCl ค่า pH 8.0) lysate ถูกปั่นเป็นเวลา 30 นาทีที่ 20,000 กรัม เม็ดถูกล้างในบัฟเฟอร์ A และ resuspended ใน denaturing บัฟเฟอร์ (8 M ยูเรียในบัฟเฟอร์ A) lysate ถูกบ่มมี 2 มล Ni-NTA เรซิน (Invitrogen, ThermoScientifique, Illkirch ฝรั่งเศส) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เรซินถูกล้างแล้วสองครั้งกับ 35 มล 8 เมตรยูเรีย / บัฟเฟอร์โดยเหวี่ยง 10 นาทีที่ 900 กรัม โปรตีนที่ถูกชะจากเรซินในบัฟเฟอร์เดียวกันที่มี 250 มิลลิ imidazole นี้ (Euromedex) ตัวอย่างโปรตีนถูกรวบรวมและ dialyzed กับบัฟเฟอร์± 10% กลีเซอรอลและเก็บไว้ aliquoted ที่ -80 องศาเซลเซียส ซึ่งช่วยทำให้ ~2-4 มิลลิกรัมต่อลิตรเปปไทด์ของวัฒนธรรม เปปไทด์บริสุทธิ์เป็นตัดสินโดยการวิเคราะห์เกี่ยวกับ 15% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตอิเลคเจลอะคริเลตตามด้วย Coomassie สีฟ้าย้อมสี ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์กรดอะมิโนในเชิงปริมาณ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการอ้างอิง และ srpp การโคลนยีนและการทำให้บริสุทธิ์การ srpp ยีน ( ขนาดหนังสือไม่ aj223388 ) และ Ref ยีน ( ขนาดเข้าไม่ x56535 ) ถูกสังเคราะห์โดย genscript ( Piscataway , USA ) หลังจากการเพิ่มประสิทธิภาพและส่งเสริมการเพิ่มของ 6-histidine แท็กที่ n-ter . แล้วพวกเขาก็ถูกโคลน ตามลำดับ ใน ndei – xhoi เว็บไซต์ของ pet24a ( novagen อิงค์ , WI , USA ) เพื่อสร้างและ pet24a-6his-srpp pet24a-6his-ref. แต่ละสายพันธุ์เป็นที่รู้จักใน Escherichia coli BL21 ( DE3 ) plyss ทองเซลล์ แบคทีเรียเติบโต 0.7 OD 2 × YT ขนาดกลาง ( 16 กรัมต่อลิตร ทริพโทน , 10 กรัม / ลิตรและสารสกัดจากยีสต์ , 5.0 กรัม / ลิตรโซเดียมคลอไรด์ ( NaCl ) และการแสดงออกที่เกิดจากการเพิ่มของ 1 มิลลิเมตร isopropyl-d-thiogalactoside ( euromedex Souffelweyersheim , ฝรั่งเศส ) หลังจาก 4 ชั่วโมง นำเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยปั่นแช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 องศา และบริษัท เวสเทิร์น overexpression ของ srpp Ref ทำให้ร่างกายและการรวม เซลล์มี sonicated 5 × 1 นาทีในบัฟเฟอร์ ( 150 มม. และ 100 มม. หรือเกลือ hcl , pH 8.0 ) การ lysate คือระดับ 30 นาทีที่ 20 , 000 กรัม เม็ดล้างบัฟเฟอร์ และ resuspended ในสี่บัฟเฟอร์ ( 8 M ยูเรียในบัฟเฟอร์ ) การ lysate ถูกบ่มด้วย 2 ml ผมค้าขาย เรซิน ( Invitrogen thermoscientifique illkirch , , , ฝรั่งเศส ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง เรซินก็ล้างสองครั้งกับ 35 มิลลิลิตร / 8 M ยูเรียเป็นสารบัฟเฟอร์โดย 10 นาที 900 กรัม โปรตีนมีตัวอย่างจากเรซินในเดียวกันบัฟเฟอร์ที่มี 250 มม. อิมิดาโซล ( euromedex ) ตัวอย่างโปรตีนรวมกับบัฟเฟอร์ผ่านและเป็น± 10% กลีเซอรอลและเก็บไว้ aliquoted ที่− 80 องศา นี้ผลผลิต∼ 2 – 4 มิลลิกรัมต่อลิตร เปปไทด์ ของวัฒนธรรม เปปไทด์บริสุทธิ์เป็นตัดสินโดยการวิเคราะห์ 15 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide gel electrophoresis ตามด้วยเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้า staining ความเข้มข้นของกรดอะมิโนโปรตีนถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์เชิงปริมาณ