2.4. 16S rDNA gene amplification an

2.4. 16S rDNA gene amplification and pyrosequencing
The primers 515F (50-GTGCCAGCMGCCGCGG-30) and 907R (50-
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-30) with a unique 6 bp tag sequence at
the 50-end of each were used to amplify theV4-V5 hypervariable
regions of the 16S rDNA gene (Xiong et al., 2012). The PCR reaction
mixture (25 mL) contained 1 mL of the purified template DNA,
2.5 mL of 10

PCR Mg2+ free buffer, 2.0 mL of 25 mM dNTP, 2.5 mL of
2.5 mM Mg2+, 0.5 mL (10 mM) of each primer, and 0.5 mL (1.25 U) of
Taq polymerase, which were then maintained by sterilized
ultrapure water. The thermal cycling conditions were as follows:
an initial denaturation at 94
C for 5 min; 15 cycles of 94
C for 60 s,
54
C for 30 s, and 72
C for 90 s; and a
final extension step at 72
C
for 10 min.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. 16S rDNA ขยายยีนและ pyrosequencingไพรเมอร์ที่ 515F (50-GTGCCAGCMGCCGCGG-30) และ 907R (50-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-30) กับเอกลักษณ์ 6 bp ป้ายลำดับที่ใช้ขยาย hypervariable theV4 V5 50-สิ้นสุดของแต่ละแคว้น 16S rDNA ยีน (หยง et al., 2012) ปฏิกิริยา PCRส่วนผสม (25 mL) อยู่ 1 mL ของแม่บริสุทธิ์ DNA2.5 mL 10PCR Mg2 + ฟรีบัฟเฟอร์ 2.0 mL ของ dNTP 25 mM, 2.5 mL ของ2.5 mM Mg2 + 0.5 mL (10 mM) แต่ละพื้น และ 0.5 mL (1.25 U) ของTaq พอลิเมอเรส ซึ่งได้รักษาแล้วโดย sterilizedน้ำ ultrapure ความร้อนขี่เงื่อนไขมีดังนี้:denaturation เป็นเริ่มที่ C 94 สำหรับ 5 นาที รอบ 15 ของ 94 C 60 s54 C 30 s และ 72 C สำหรับ 90 s และขั้นตอนสุดท้ายขยายที่ 72 Cสำหรับ 10 นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การเพิ่มปริมาณยีน 16S rDNA และไพรเมอร์ 515f ไพโรซีเควนซิง
( 50-gtgccagcmgccgcgg-30 ) และ 907r ( 50 -
ccgtcaattcmtttragttt-30 ) ้ 6 BP แท็กลำดับที่ 50
ตอนท้ายของแต่ละถูกใช้เพื่อขยาย thev4-v5 ออก
ภูมิภาคของยีน 16S rDNA ( Xiong et al . , 2012 ) การตรวจปฏิกิริยา
ผสม ( 25 ml ) ที่มีอยู่ 1 มิลลิลิตร และแม่แบบดีเอ็นเอ
2.5 มล. 10

 PCR mg2 ฟรีบัฟเฟอร์ 20 กรัม dntp 25 มม. , 2.5 มล.
mg2 2.5 มม. 0.5 มล. ( 10 มม. ) ของแต่ละสี และ 0.5 ml ( 1.25 u )
แทค polymerase ซึ่งเป็นรักษาโดยฆ่าเชื้อ
บริสุทธิ์มากน้ำ เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนมีดังนี้ :
( เริ่มต้นที่ 94
C เป็นเวลา 5 นาที ; 15 รอบ 94
C 60 s ,
0
เป็นเวลา 30 วินาที กับ 72
C 90 s ; และสุดท้ายขยายขั้นตอนที่ 72

C
เป็นเวลา 10 นาที