Galactose-induced HSP104 overexpres

Galactose-induced HSP104 overexpression

Yeast cells transformed with either pYES2, pUKC1831, pUKC2200 or pUKC2212 were grown for 14–16 h at 30 °C in YNB/glucose-based minimal medium lacking uracil to allow for selection of the URA3-based plasmids. The cells were then resuspended in a pre-induction medium (0.67% YNB without amino acids, 2% raffinose with complete supplement minus uracil; YNBRaf) to give a starting OD600 = 0.1. The culture was then grown at 30 °C with aeration until OD600 ≈ 0.5 was reached. Filter-sterilized galactose solution (20%) was then added to a final concentration of 2% w/v (YNBGal) and the culture incubated for a further 6 h. 1 ml each culture was then used to inoculate fresh YNBGal medium and this was incubated for a further 18 h (to give a t = 24 h time point). This was repeated to give a 48 h time point. At each time point an appropriately diluted culture sample was plated in triplicate onto one-quarter YEPD to determine the viable cell number and the percentage of [psi−] cells at the time of plating.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กาแล็กโทสเกิดการแสดงออกของ HSP104เปลี่ยนเซลล์ยีสต์ ด้วย pYES2, pUKC1831, pUKC2200 หรือ pUKC2212 ได้ปลูกสำหรับ h 14 – 16 ที่ 30 ° C ใน YNB/กลูโคส คะแนนน้อยขาด uracil เพื่ออนุญาตให้เลือก plasmids URA3 คะแนน เซลล์ถูก resuspended ในสื่อเหนี่ยวนำก่อนแล้ว (0.67% YNB ไม่ มีกรดอะมิโน raffinose 2% กับอาหารเสริมสมบูรณ์ลบ uracil YNBRaf) เพื่อให้เป็น OD600 เริ่มต้น = 0.1 วัฒนธรรมถูกแล้วปลูกที่ 30 ° C กับอากาศจน OD600 ≈ 0.5 ก็มาถึง เข้มข้น 2% w/v (YNBGal) สุดท้ายแล้วถูกฆ่ากรองกาแล็กโทสโซลูชัน (20%) และวัฒนธรรมที่มีต่อ 6 h. 1 ml แต่ละวัฒนธรรมแล้วใช้ฉีดสดกลาง YNBGal และนี้ได้รับการกก incubated สำหรับชั่วโมง 18 เพิ่มเติม (จะให้ t =จุดเวลา 24 ชม.) นี้ซ้ำแล้วซ้ำอีกเพื่อให้จุดเวลา 48 ชั่วโมง ในแต่ละจุดเวลา ตัวอย่างเจือจางเหมาะสมวัฒนธรรมถูกชุบลข้อลงหนึ่งในสี่ YEPD กำหนดเซลล์ทำงานได้จำนวนและเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ [psi−] เมื่อทำการชุบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กาแลคโตที่เกิด HSP104 แสดงออก

เซลล์ยีสต์เปลี่ยนกับทั้ง pYES2, pUKC1831, pUKC2200 หรือ pUKC2212 ปลูกสำหรับ 14-16 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสใน YNB / กลูโคสตามสื่อน้อยขาด uracil เพื่อให้การเลือกของพลาสมิด URA3 ตาม เซลล์ที่ถูก resuspended แล้วในกลางก่อนเหนี่ยวนำ (0.67% โดยไม่ต้อง YNB กรดอะมิโน raffinose 2% กับอาหารเสริมที่สมบูรณ์ uracil ลบ; YNBRaf) เพื่อให้เริ่มต้น OD600 = 0.1 วัฒนธรรมเติบโตเป็นผู้ใหญ่แล้ววันที่ 30 ° C มีการเติมอากาศจนกว่า OD600 ≈ 0.5 ก็มาถึง กรองฆ่าเชื้อแก้ปัญหากาแลคโต (20%) ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วจะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 2% w / v (YNBGal) และวัฒนธรรมบ่มเป็นเวลาอีก 6 ชั่วโมง 1 มิลลิลิตรวัฒนธรรมแต่ละคนถูกนำมาใช้เพื่อฉีดวัคซีนกลาง YNBGal สดและนี้ถูกบ่มอีก 18 ชั่วโมง (เพื่อให้อย่าง = จุดเวลา 24 ชั่วโมง) นี้ซ้ำที่จะให้จุดเวลา 48 ชั่วโมง ณ จุดเวลาในแต่ละตัวอย่างวัฒนธรรมเจือจางเหมาะสมถูกชุบเพิ่มขึ้นสามเท่าบนหนึ่งในสี่ YEPD เพื่อตรวจสอบจำนวนเซลล์ทำงานได้และร้อยละของ [psi-] เซลล์ในช่วงเวลาของการชุบที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ hsp104 overexpression กาแลกโตสยีสต์เซลล์เปลี่ยนด้วย pyes2 pukc1831 pukc2200 , , หรือ pukc2212 ปลูก 14 – 16 ชั่วโมง 30 ° C ใน ynb / กลูโคส minimal medium ขาด Name ให้เลือกของ ura3 โดยใช้พลาสมิดที่ใช้ เซลล์แล้ว resuspended ในสื่อชักนำ pre ( 0.67 % ynb ไม่มีกรดอะมิโน 2 % แรฟฟิโนสกับสมบูรณ์เสริมลบ Name ; ynbraf ) ให้เริ่ม od600 = 0.1 วัฒนธรรมก็ปลูกที่ 30 องศา C อากาศ od600 ≈ 0.5 จนครบ กรองสารละลายฆ่าเชื้อกาแลคโตส ( 20% ) ก็เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 2 % W / V ( ynbgal ) และวัฒนธรรมบ่มสำหรับอีก 6 ชั่วโมง 1 ml แต่ละวัฒนธรรมก็เคยฉีดวัคซีนกลาง ynbgal สดและถูกบ่มสำหรับอีก 18 ชั่วโมง ( ให้ t = จุดที่เวลา 24 ชั่วโมง ) นี้ย้ำให้เวลา 48 ชั่วโมงจุด ในแต่ละจุดเวลาที่เหมาะสม ซึ่งวัฒนธรรมตัวอย่างทั้งสามใบชุบลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อหนึ่งในสี่หาเบอร์ได้ และร้อยละ [ PSI − ] เซลล์ในเวลาของการชุบ