2. Materials and methods2.1. Animal

2. Materials and methods
2.1. Animals
All experimental procedures were approved by the
Polytechnic University of Valencia Research Ethics
Committee.
A total of 20 adult males of the genetic line ‘‘R’’ were
used in the experiment and were bred at the farm of the
Polytechnic University of Valencia. Line R is a paternal
line selected for daily gain (DG) between 28 and 63 d of
age through 25 generations [14]. Selection is based on
phenotypic values of DG and is conducted in nonoverlapping
generations; the generation interval is 6 mo.
Environmental conditions were maintained using a
control system for light (16:8 light/dark photoperiod),
ventilation and temperature (18–25 8C). After weaning,
the males were housed in individual cages with a
photoperiod of 16 h light/day. Animals were fed ‘‘ad
libitum’’ with a commercial rabbit diet.
2.2. Chromosome preparation
2.2.1. Peripheral blood culture
Blood samples were collected using a sterile needle
and sterile syringe with anticoagulant (Heparin) fromthe
male rabbit central artery. Cell cultures were prepared in
PB Max Karyotyping medium (Gibco, Invitrogen).
One ml of whole blood was added to 10 ml of the
culture medium and incubated in flack-task tubes for
72 h at 37 8C in 5% CO2 and 95% humidity. For cell
cycle synchronization 200 ml of thymidine solution
(8 mg/ml in PBS) was added at 56 h of culture, and
colcemide (0.10 mg/ml) was added 4.5 h before harvest
to arrest lymphocytes at metaphase. The cultures were
then centrifuged at 300 g for 10 min, supernatant was
removed and 10 ml of 0.075 M potassium chloride
(hypotonic solution) was added to cause hypotonic
shock (during 20 min), allowing the entrance of fluids
and inducing cellular lysis. Cells were then washed and
centrifuged at 300 g for 10 min. Supernatant was
extracted and modified Carnoy’s fixative solution (3:1
methanol-acetic acid) was added during constant
agitation to avoid fiber formation; the treatment was
repeated at least three times.
2.2.2. Cell harvest
The fixed cell suspension was then dropped onto
microscope slides for examination. Microscope slides
were prepared for microscope examination with a
protocol described by Henegariu [15].
Chromosomal analysis was carried out from chromosome
photomicrographs, using 50 metaphase spreads for
numerical chromosome evaluation per rabbit. The slides
were examined by light microscopy at amagnification of
1000X. Completemetaphase spreads that did not present
any overlap and were not fractionated were photographed.
Metaphases pictures were analyzed with the aid
of Leica CW4000, software. As a result of this analysis
the males were classified as males A, those that showed
aneuploidy, and males N or normal males.
2.3. Semen analyses and insemination procedure
Semen was collected randomly from March to
August with the aid of an artificial vagina. Only
ejaculates exhibiting a white colour were used in the
experiment, and if gel was present, it was removed.
Then the volume was recorded.
Aliquots from each ejaculate (10 ml) were diluted
1:20 in an extender (Tris-citrate acid-glucose) containing
bovine serum albumin 0.3% (BSA) to prevent the
spermatozoa from sticking to the glassware during
motility analysis. Ten microliters of the diluted sample
was placed into a 10 mmdeep Makler counting chamber
(Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) for motility
analysis using a computer-assisted sperm analysis
(CASA) system (Sperm Class Analyzer, S.C.A.,
Microptic, Barcelona, Spain). Sperm motility was
assessed at 37 8C with 10X phase contrast objective.
For each sample four microscope fields were analyzed.
The percentage of total motile spermatozoa (MOT, %),
average path velocity (VAP, mm/s; the average velocity
of the smoothed cell path), curvilinear velocity (VCL,
mm/s; the average velocity measured over the actual
point to point track followed by the cell), straight-line
velocity (VSL, mm/s; the average velocity measured in
a straight line from the beginning to the end of the
track), linearity index (LIN = (VSL/VCL) x100, %),
amplitude of lateral head displacement (ALH, mm; the
mean width of the head oscillation as the sperm cells
swim), straightness coefficient (STR = (VAP/VCL)
x100, %), and wobble (WOB = (VAP/VCL) x100, %;
a measure of the oscillation of the actual trajectory
about its spatial average path) were recorded.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การสัตว์ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยการจริยธรรมการวิจัยมหาวิทยาลัยสารพัดช่าง Valenciaคณะกรรมการมีจำนวนชายผู้ใหญ่ 20 บรรทัดพันธุกรรม ''อาร์ ''ใช้ในการทดลอง และได้ bred ที่ฟาร์มของวิทยาลัยสารพัดช่างมหาวิทยาลัยของ Valencia รายการ R จะเป็นปู่บรรทัดที่เลือกระหว่าง d 28 และ 63 ของกำไรรายวัน (กิจ)อายุผ่านรุ่น 25 [14] เลือกตามค่าไทป์ของกิจ และดำเนินในขนานรุ่น รุ่น 6 หม้อมีรักษาสภาพแวดล้อมโดยใช้การระบบควบคุมแสง (16:8 ชั่วโมงแสง/มืด),ระบายอากาศและอุณหภูมิ (8 18-25 C) หลังจากการ weaningตัวมีห้องพักในแต่ละกรงด้วยการชั่วโมงแสงวันละ 16 h มีเลี้ยงสัตว์ "โฆษณาlibitum'' กับอาหารกระต่ายเชิงพาณิชย์2.2 เตรียมโครโมโซม2.2.1 การต่อพ่วงเลือดวัฒนธรรมตัวอย่างเลือดเก็บรวบรวมโดยใช้เข็มที่ฆ่าเชื้อและเข็มฉีดยาฆ่าเชื้อกับ anticoagulant (เฮพาริน) จากการกระต่ายเพศหลอดเลือดแดงที่เซ็นทรัล วัฒนธรรมเซลล์ถูกเตรียมไว้ในPB สูงสุด Karyotyping ปานกลาง (Gibco, Invitrogen)Ml หนึ่งของเลือดทั้งหมดถูกเพิ่ม 10 ml ของวัฒนธรรมกลาง และ incubated ในตาแฟล็กงานท่อสำหรับh 72 ที่ 8C 37 ใน 5% CO2 และ 95% ความชื้น สำหรับเซลล์วนตรง 200 ml ของโซลูชัน thymidineเพิ่ม (8 mg/ml ใน PBS) ที่ h 56 ของวัฒนธรรม และcolcemide (0.10 mg/ml) เพิ่ม 4.5 h ก่อนเก็บเกี่ยวจับ lymphocytes ที่ metaphase มีวัฒนธรรมcentrifuged แล้ว ที่ 300 กรัมสำหรับ 10 นาที supernatant ถูกเอาออกไป และ 10 ml ของ 0.075 M โปแตสเซียมคลอไรด์เพิ่มทำ hypotonic (hypotonic โซลูชัน)ช็อค (ระหว่าง 20 นาที), ให้เข้าของของเหลวและ inducing lysis โทรศัพท์มือถือ เซลล์ถูกล้างแล้ว และcentrifuged ที่ 300 กรัมสำหรับ 10 นาที Supernatant ถูกแยก และแก้ไข Carnoy ของโซลูชันตรึง (3:1เพิ่มกรดอะซิติกเมทานอล) ระหว่างค่าคงอาการกังวลต่อการหลีกเลี่ยงตัวของเส้นใย การรักษาได้ทำซ้ำอย่างน้อย 3 ครั้ง2.2.2 เก็บเกี่ยวเซลล์การระงับเซลล์ถาวรถูกแล้วปล่อยลงบนภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์สำหรับตรวจสอบ ภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ถูกเตรียมไว้สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์การโพรโทคอลโดย Henegariu [15]วิเคราะห์ของโครโมโซมทำออกจากโครโมโซมphotomicrographs ใช้แพร่กระจาย metaphase 50 สำหรับโครโมโซมที่เป็นตัวเลขประเมินต่อกระต่าย ภาพนิ่งถูกตรวจสอบ โดยแสง microscopy ที่ amagnification ของCompletemetaphase x. อัพ 1000 แพร่กระจายที่ได้นำเสนอใด ๆ ซ้อนทับ และถูกแบ่งถูกถ่ายภาพรูปภาพ metaphases ได้วิเคราะห์ ด้วยความช่วยเหลือของไล CW4000 ซอฟต์แวร์ จากการวิเคราะห์นี้ชายถูกจัดประเภทเป็นชาย A ที่แสดงให้เห็นว่าaneuploidy และชาย N หรือปกติชาย2.3. น้ำเชื้อวิเคราะห์และขั้นตอนการผสมเทียมน้ำเชื้อรวบรวมได้จากมีนาคมถึงเดือนสิงหาคม ด้วยความช่วยเหลือของช่องคลอดการประดิษฐ์ เท่านั้นejaculates อย่างมีระดับสีขาวใช้ในการทดลอง และถ้าเจมี ถูกเอาออกแล้ว มีการบันทึกเสียงมียกเว้น aliquots จากแต่ละน้ำ (10 มล.)1:20 ใน extender (ทริสเรทติ้งซิเตรตกรดน้ำตาลกลูโคส) ประกอบด้วยการวัว serum albumin 0.3% (บีเอสเอ) เพื่อป้องกันการจากการผสานกับแก้วระหว่าง spermatozoaวิเคราะห์ motility Microliters 10 ของตัวอย่างแตกออกมีอยู่ในหอนับ Makler 10 mmdeep(เครื่องมือแพทย์ Sefi ไฮฟา อิสราเอล) สำหรับ motilityใช้วิเคราะห์อสุจิคอมพิวเตอร์ช่วยวิเคราะห์(CASA) ระบบ (วิเคราะห์ชั้นสเปิร์ม S.C.A.Microptic บาร์เซโลนา สเปน) มีสเปิร์ม motilityประเมินที่ 8C 37 มี 10 X ระยะความคมชัดในวัตถุประสงค์มีวิเคราะห์กล้องจุลทรรศน์สี่เขตข้อมูลสำหรับแต่ละตัวอย่างเปอร์เซ็นต์ของผลรวม motile spermatozoa (มด %),ความเร็วเฉลี่ยเส้น (โกวัป mm/s ความเร็วเฉลี่ยของเซลล์ที่ปรับให้โค้งเส้นทาง), ความเร็ว curvilinear (VCLmm/s ความเร็วเฉลี่ยที่วัดเหนือจริงติดตามจุดจะจุดตามเซลล์), เส้นตรงความเร็ว (VSL, mm/s ความเร็วเฉลี่ยที่วัดในเส้นตรงจากจุดเริ่มต้นของการติดตาม), ดัชนีแบบดอกไม้ (หลิน = (VSL VCL) x 100 %),ความกว้างของด้านข้างหัวแทน (ALH มม. การหมายถึง ความกว้างของการสั่นหัวเป็นเซลล์อสุจิว่ายน้ำ), สัมประสิทธิ์ straightness (STR = (VCL โกวัป)x 100 % และกระเด้ง (WOB (VCL โกวัป) = x 100 %การวัดการสั่นของวิถีจริงเกี่ยวกับเส้นเฉลี่ยของปริภูมิ) ถูกบันทึกไว้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สัตว์
ทุกขั้นตอนการทดลองได้รับการอนุมัติจาก
มหาวิทยาลัยโพลีเทคนิควาเลนเซียวิจัยจริยธรรม
คณะกรรมการ.
จำนวน 20 ผู้ใหญ่เพศชายของสายพันธุกรรม '' R '' ถูก
ใช้ในการทดลองและได้รับการอบรมที่ฟาร์มของ
มหาวิทยาลัยโพลีเทคนิควาเลนเซีย สาย R คือบิดา
บรรทัดที่เลือกเพื่อผลประโยชน์ในชีวิตประจำวัน (DG) ระหว่างวันที่ 28 และ 63 ของ d
อายุผ่าน 25 รุ่น [14] การเลือกจะขึ้นอยู่กับ
ค่าฟีโนไทป์ของ DG และจะดำเนินการใน nonoverlapping
รุ่น; ช่วงรุ่นคือ 6 เดือน.
สภาพสิ่งแวดล้อมได้รับการดูแลโดยใช้
ระบบการควบคุมแสง (16: 8 แสงไฟ / เข้ม),
การระบายอากาศและอุณหภูมิ (18-25 8C) หลังจากหย่านม
เพศที่ถูกตั้งอยู่ในกรงบุคคลที่มี
แสงของแสง 16 ชั่วโมง / วัน ได้รับการเลี้ยงดูสัตว์ '' โฆษณา
libitum '' กับอาหารกระต่ายเชิงพาณิชย์.
2.2 เตรียมโครโมโซม
2.2.1 วัฒนธรรมเลือด
เก็บตัวอย่างเลือดโดยใช้เข็มผ่านการฆ่าเชื้อ
และเข็มฉีดยาฆ่าเชื้อที่มีสารกันเลือดแข็ง (เฮ) fromthe
กระต่ายชายหลอดเลือดกลาง เซลล์วัฒนธรรมได้จัดทำขึ้น
กลาง PB karyotyping แม็กซ์ (Gibco, Invitrogen).
หนึ่งมิลลิลิตรของเลือดถูกบันทึกอยู่ใน 10 มิลลิลิตรของ
อาหารเลี้ยงเชื้อและบ่มในหลอด Flack งานสำหรับ
72 ชั่วโมงที่ 37 8C ใน 5% CO2 และความชื้น 95% . สำหรับเซลล์
ประสานรอบ 200 มล. ของการแก้ปัญหา thymidine
(8 mg / ml ในพีบีเอส) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 56 ชั่วโมงของวัฒนธรรมและ
colcemide (0.10 mg / ml) ถูกเพิ่มเข้ามา 4.5 ชั่วโมงก่อนการเก็บเกี่ยว
ที่จะจับกุมเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ metaphase วัฒนธรรมที่ถูก
ปั่นแล้วที่ 300 กรัมเป็นเวลา 10 นาที, ใสถูก
ลบออกและ 10 มล 0.075 M โพแทสเซียมคลอไรด์
(สารละลาย hypotonic) ถูกเพิ่มเข้ามาจะทำให้เกิด hypotonic
ช็อต (ในช่วง 20 นาที) ช่วยให้การเข้ามาของของเหลว
และกระตุ้นให้เกิดการสลายเซลลูลาร์ เซลล์ที่ถูกล้างแล้วและ
หมุนเหวี่ยงที่ 300 กรัมเป็นเวลา 10 นาที ใสถูก
สกัดและแก้ไขวิธีการแก้ปัญหาตรึง Carnoy (3: 1
เมทานอลกรดอะซิติก-) เพิ่มขึ้นในช่วงคง
ปั่นป่วนเพื่อหลีกเลี่ยงการก่อเส้นใย การรักษาที่ถูก
ทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง.
2.2.2 การเก็บเกี่ยวเซลล์
เซลล์แขวนลอยคงที่จากนั้นก็ลงบน
สไลด์กล้องจุลทรรศน์สำหรับการตรวจสอบ สไลด์กล้องจุลทรรศน์
กำลังเตรียมพร้อมสำหรับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์
โปรโตคอลอธิบายโดย Henegariu [15].
การวิเคราะห์โครโมโซมได้ดำเนินการจากโครโมโซม
photomicrographs ใช้ 50 metaphase กระจายสำหรับ
การประเมินผลโครโมโซมตัวเลขต่อกระต่าย ภาพนิ่ง
ที่ได้รับการตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงที่ amagnification ของ
1000X กระจาย Completemetaphase ที่ไม่ได้นำเสนอ
การทับซ้อนใด ๆ และไม่ได้ถูกถ่ายภาพ fractionated.
ภาพ Metaphases วิเคราะห์ด้วยความช่วยเหลือ
ของ Leica CW4000, ซอฟแวร์ อันเป็นผลมาจากการวิเคราะห์นี้
ชายถูกจัดให้เป็นเพศผู้ที่แสดงให้เห็น
aneuploidy และเพศ N หรือเพศปกติ.
2.3 การวิเคราะห์น้ำอสุจิและวิธีการผสมเทียม
น้ำเชื้อเก็บสุ่มตั้งแต่เดือนมีนาคมถึง
เดือนสิงหาคมด้วยความช่วยเหลือของช่องคลอดเทียม เฉพาะ
ejaculates แสดงสีขาวที่ใช้ใน
การทดลองและถ้าเจลอยู่ในปัจจุบันก็จะถูกลบออก.
จากนั้นปริมาณการได้รับการบันทึก.
aliquots จากแต่ละอุทาน (10 มล.) ได้รับการปรับลด
01:20 ในขยาย (กรด Tris-ซิเตรต กลูโคส) ที่มี
ซีรั่มอัลบูมิวัว 0.3% (บีเอสเอ) เพื่อป้องกันไม่ให้
สเปิร์มจากการเกาะแก้วในระหว่าง
การวิเคราะห์การเคลื่อนไหว สิบ microliters ของกลุ่มตัวอย่างเจือจาง
ถูกวางลง 10 mmdeep Makler นับห้อง
(Sefi เครื่องมือแพทย์, อิสราเอล) สำหรับการเคลื่อนไหวของ
การวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ที่สเปิร์มคอมพิวเตอร์ช่วย
(CASA) ระบบ (สเปิร์มคลาสวิเคราะห์ SCA,
Microptic บาร์เซโลนาประเทศสเปน ) การเคลื่อนไหวของอสุจิได้รับการ
ประเมินที่ 37 8C กับ 10X เฟสวัตถุประสงค์ตรงกันข้าม.
สำหรับแต่ละตัวอย่างสี่สาขากล้องจุลทรรศน์วิเคราะห์.
ร้อยละของการเคลื่อนไหวรวมตัวอสุจิ (MOT,%)
เส้นทางความเร็วเฉลี่ย (VAP, mm / s; ความเร็วเฉลี่ย
ของเรียบ เส้นทางเซลล์) ความเร็วโค้ง (VCL,
mm / s; วัดความเร็วเฉลี่ยที่เกิดขึ้นจริงในช่วง
ชี้ไปที่จุดติดตามตามด้วยเซลล์) เส้นตรง
ความเร็ว (VSL, mm / s; ความเร็วเฉลี่ยในวัด
เป็นเส้นตรงจาก จุดเริ่มต้นถึงจุดสิ้นสุดของ
แทร็ค) ดัชนีเชิงเส้น (LIN = (VSL / VCL) x100,%)
ความกว้างของรางหัวด้านข้าง (ALH, มม
ความกว้างเฉลี่ยของการสั่นหัวเป็นเซลล์สเปิร์ม
ว่ายน้ำ), ตรง ค่าสัมประสิทธิ์ (STR = (VAP / VCL)
x100%) และโยกเยก (WOB = (VAP / VCL) x100%;
มาตรการของการสั่นของวิถีที่เกิดขึ้นจริง
เกี่ยวกับเส้นทางเฉลี่ยอวกาศ) ที่ถูกบันทึกไว้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ขั้นตอนการทดลองสัตว์

ทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยของมหาวิทยาลัยโพลีเทคนิควาเลนเซีย
.
ทั้งหมด 20 ผู้ใหญ่เพศชายของสายพันธุกรรม ' ' R ' '
ที่ใช้ในการทดลอง และถูกเลี้ยงในฟาร์มของ
โรงเรียนโปลีเทคนิคมหาวิทยาลัยวาเลนเซีย เส้นเป็นเส้นเลือกบุตร
เข้าทุกวัน ( DG ) ระหว่าง 28 และ 63 D
อายุถึง 25 รุ่น [ 14 ] การเลือกใช้ค่าคุณสมบัติของ DG
และดำเนินการใน nonoverlapping
ชั่วคนรุ่นช่วง 6 เดือน

สภาพสิ่งแวดล้อมยังคงใช้ระบบการควบคุมแสง ( 16 : 8 แสง / มืดแสง ) ,
ระบายอากาศและอุณหภูมิ ( 18 – 25 8C ) หลังหย่านม
ผู้ชาย , ถูกขังในกรงแต่ละคนด้วย
ต่อแสง 16 ชั่วโมงต่อวัน สัตว์ได้รับ 'ad
' หยาบ ' ' กับโฆษณากระต่ายอาหาร .
2.2 . การเตรียมโครโมโซม
2.2.1 . อุปกรณ์การเพาะเชื้อในเลือด
เก็บตัวอย่างเลือด การใช้เข็มฉีดยาฆ่าเชื้อและฆ่าเชื้อด้วย

เลือด ( heparin ) จากชายกระต่ายกลางหลอดเลือดแดง เซลล์วัฒนธรรมเตรียมใน PB แม็กซ์ โครโมโซม ( gibco )
,
Invitrogen )1 มิลลิลิตรของเลือดทั้งหมดถูกเพิ่ม 10 มล.
สื่อวัฒนธรรมในงานโดยมีหลอด
72 H ที่ 37 8C ในคาร์บอนไดออกไซด์ 5% และ 95 % ความชื้น สำหรับรอบ 200 มิลลิลิตร ให้เซลล์

โซลูชั่นไทมิดีน ( 8 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรใน PBS ) เพิ่มที่ 56 H ของวัฒนธรรมและ
colcemide ( 0.10 มก. / มล. ) เพิ่ม 4.5 ชั่วโมง ก่อนการเก็บเกี่ยว
จับเม็ดเลือดขาวที่เมทาเฟส วัฒนธรรมคือ
แล้วระดับที่ 300 กรัม เป็นเวลา 10 นาทีน่านคือ
ลบออกและ 10 มิลลิลิตร 0.075 m โพแทสเซียมคลอไรด์
( ไฮโพทอนิก โซลูชั่น ) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้ไฮโปโทนิก
ช็อก ( ในช่วง 20 นาที ) ช่วยให้ประตูทางเข้าของของเหลว
และกระตุ้นเซลล์เสื่อม . เซลล์ก็แล้ว ล้างและ
ระดับที่ 300 กรัมนาน 10 นาที นำกำลังสกัดและแก้ไข carnoy
เป็นฟิกเซทีฟโซลูชั่น ( 3
เมทานอลกรดอะซิติก ) ถูกเพิ่มเข้ามาในช่วงคงที่
เขย่าเพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างเส้นใย ; การรักษาอย่างน้อย 3 ครั้ง ซ้ำถูก
.
2.2.2 . เก็บเกี่ยวเซลล์ซ่อมเซลล์แขวนลอยอยู่

แล้วหล่นลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์สำหรับตรวจสอบ กล้องจุลทรรศน์สไลด์
เตรียมสำหรับกล้องจุลทรรศน์ตรวจด้วย
( อธิบายโดย henegariu [ 15 ] .
การวิเคราะห์โครโมโซมถูกหามออกจากโครโมโซม
photomicrographs ใช้ 50 กระจายองค์ประกอบสำหรับ