Rapid Amplification of cDNA Ends (R

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a procedure for amplification of nucleic acid sequences from a messenger RNA template between a defined internal site and either the 3´ or the 5´ end of the mRNA (1). This methodology of amplification with single-sided specificity has been described as “one-sided” PCR (2) or “anchored” PCR (3). PCR requires two sequence-specific primers that flank the sequence to be amplified (4,5). However, to amplify and characterize regions of unknown sequences, this requirement imposes a limitation (3). 3´ RACE takes advantage of the natural poly(A) tail found in mRNA as a generic priming site for PCR. In this procedure, mRNAs are converted into cDNA using reverse transcriptase (RT) and an oligo-dT adapter primer. Specific cDNA is then amplified by PCR using a gene-specific primer (GSP) that anneals to a region of known exon sequences and an adapter primer that targets the poly(A) tail region. This permits the capture of unknown 3´-mRNA sequences that lie between the exon and the poly(A) tail. 5´ RACE uses an antisense gene specific primer for the synthesis of specific cDNA by reverse transcriptase.

Prior to PCR, a TdT-tailing step attaches an adapter sequence to the unknown 5´ sequences of the cDNA. Specific cDNA is then amplified by PCR using a GSP that anneals in a region of known exon sequences and an adapter primer that targets the 5´ terminus. RACE has been used for amplification and cloning of rare mRNAs (6) and may be applied to existing cDNA libraries (7). Additionally, RACE products can be directly sequenced without any intermediate cloning steps (8,9), or the products may be used to prepare probes (10). Products generated by the 3´ and 5´ RACE  procedures may be combined to generate full-length cDNAs (10,11). Lastly, the RACE procedures may be utilized in conjunction with exon-trapping methods (12) to enable amplification and subsequent characterization of unknown coding sequences.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยายอย่างรวดเร็วของ cDNA สิ้นสุด (แข่งขัน) เป็นขั้นตอนการขยายลำดับกรดนิวคลีอิกจากเอ็มอาร์เอ็นเอแม่แบบระหว่างไซต์ภายในกำหนด และ 3´ หรือ 5´ ส่วนท้ายของ mRNA (1) กฎเกณฑ์นี้ขยายมี specificity เดียวแล้วอธิบายเป็น PCR "ด้านเดียว" (2) หรือ PCR "ยึดไว้" (3) PCR ต้องไพรเมอร์เฉพาะลำดับสองที่อยู่ขนาบข้างลำดับจะ เอาต์ (4,5) อย่างไรก็ตาม ขยาย และลักษณะภูมิภาครู้จักลำดับ ข้อกำหนดนี้กำหนดข้อจำกัด (3) 3´ การแข่งขันใช้ประโยชน์จากหาง poly(A) ธรรมชาติที่พบใน mRNA เป็นเว็บไซต์ทั่วไปด้วย PCR ในขั้นตอนนี้ mRNAs จะถูกแปลงเป็น cDNA ที่ใช้กลับ transcriptase (RT) และพื้นที่อะแดปเตอร์ oligo dT แล้วมีขยายเฉพาะ cDNA โดย PCR ที่ใช้รองพื้นเฉพาะยีน (GSP) ที่ anneals ภูมิภาครู้จัก exon ลำดับและพื้นที่อะแดปเตอร์ที่เป้าหมาย ภูมิภาคหาง poly(A) นี้อนุญาตให้จับ 3´ mRNA ไม่ทราบลำดับที่อยู่ระหว่าง exon และหาง poly(A) 5´ การแข่งขันใช้การยีน antisense เฉพาะสีรองพื้นสำหรับการสังเคราะห์ cDNA เฉพาะ โดย transcriptase กลับ ก่อน PCR ขั้นตอน TdT tailing แนบลำดับตัวอะแดปเตอร์กับลำดับที่ 5´ ไม่รู้จักของ cDNA แล้วมีขยายเฉพาะ cDNA โดย PCR โดยใช้ GSP ที่ anneals ในภูมิภาครู้จัก exon ลำดับและพื้นที่อะแดปเตอร์ที่เป้าหมายนัส 5´ ใช้สำหรับขยายการแข่งขันของ mRNAs หายาก (6) และอาจนำไปใช้กับห้องสมุด cDNA ที่มีอยู่ (7) นอกจากนี้ การแข่งขันผลิตภัณฑ์สามารถจะตรงเรียงลำดับไม่มีกลางโคลนตอน (8,9), หรืออาจใช้ผลิตภัณฑ์เพื่อเตรียมความพร้อมคลิปปากตะเข้ (10) ผลิตภัณฑ์ที่สร้างขึ้น โดยการ 3´ และอาจรวมขั้นตอนการแข่งขัน 5´ สร้างปราศจาก cDNAs (10,11) สุดท้ายนี้ อาจใช้ร่วมกระบวนการแข่งขันวิธีดัก exon (12) ให้ขยายและสมบัติต่อมาไม่ทราบรหัสลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อย่างรวดเร็วขยายของยีนปลาย (RACE) เป็นขั้นตอนสำหรับการขยายของลำดับกรดนิวคลีอิกจากแม่แบบสาร rna ระหว่างเว็บไซต์ภายในที่กำหนดไว้และทั้ง 3'หรือปลาย 5'ของ mRNA (1) วิธีการใช้เครื่องขยายเสียงที่มีความจำเพาะด้านเดียวนี้ได้รับการอธิบายว่า "ด้านเดียว" PCR (2) หรือ "ทอดสมอ" PCR (3) PCR ต้องใช้สองไพรลำดับเฉพาะที่ด้านข้างลำดับที่จะขยาย (4,5) อย่างไรก็ตามเพื่อขยายและลักษณะภูมิภาคของลำดับที่ไม่รู้จักความต้องการนี้กำหนดข้อ จำกัด (3) RACE 3'ใช้ประโยชน์จากโพลีธรรมชาติ (A) หางที่พบใน mRNA เป็นเว็บไซต์รองพื้นทั่วไปสำหรับ PCR ในขั้นตอนนี้ mRNAs จะถูกแปลงเป็น cDNA ใช้ transcriptase ย้อนกลับ (RT) และอะแดปเตอร์ไพร Oligo-dT ยีนที่เฉพาะเจาะจงจะขยายแล้วโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง (GSP) ที่ anneals ไปยังพื้นที่ของลำดับเอกซ์ซอนเป็นที่รู้จักและไพรเมอร์อะแดปเตอร์ที่มีเป้าหมายโพลี (A) ภูมิภาคหาง นี้ช่วยให้การจับที่ไม่รู้จักลำดับ 3'-mRNA ที่อยู่ระหว่างเอกซ์ซอนและโพลี (A) หาง RACE 5'ใช้ไพรเมอร์ยีน antisense ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการสังเคราะห์ cDNA โดยเฉพาะเอนไซม์. ก่อนที่จะมีวิธี PCR ที่มีขั้นตอน TDT-tailing แนบลำดับอะแดปเตอร์ลำดับ 5'รู้จักของยีน ยีนที่เฉพาะเจาะจงจะขยายแล้วโดยวิธี PCR โดยใช้ GSP ที่ anneals ในภูมิภาคของลำดับเอกซ์ซอนเป็นที่รู้จักและไพรเมอร์อะแดปเตอร์ที่มีเป้าหมายปลายทาง 5' การแข่งขันได้ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายและโคลน mRNAs ที่หายาก (6) และอาจจะนำไปใช้กับห้องสมุด cDNA ที่มีอยู่ (7) นอกจากนี้ผลิตภัณฑ์ RACE สามารถติดใจโดยตรงโดยไม่ต้องทำตามขั้นตอนการโคลนกลางใด ๆ (8,9) หรือผลิตภัณฑ์ที่อาจจะใช้ในการเตรียมยานสำรวจ (10) ผลิตภัณฑ์ที่สร้างขึ้นโดยวิธีการ 3'และ 5'การแข่งขันอาจจะรวมกันเพื่อสร้าง cDNAs เต็มความยาว (10,11) สุดท้ายขั้นตอนการแข่งขันอาจจะนำมาใช้ร่วมกับวิธีการเอกซ์ซอนดัก (12) เพื่อให้สามารถใช้เครื่องขยายเสียงและลักษณะที่ตามมาของลำดับการเข้ารหัสที่ไม่รู้จัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเพิ่มอย่างรวดเร็วของ cDNA Ends ( แข่ง ) คือ กระบวนการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกดังนี้จากเอ็มอาร์เอ็นเอแม่แบบระหว่างกำหนดภายในเว็บไซต์และทั้ง 3 หรือ 5 จบใหม่ใหม่ของ ( 1 ) นี้วิธีการแบบที่มีความจำเพาะด้านเดียวได้รับการอธิบายว่า " รักข้างเดียว " ) ( 2 ) หรือ " ยึด " PCR ( 3 )ซึ่งต้องใช้สองลำดับเฉพาะชนิดที่ปีกลำดับจะขยาย ( 4 , 5 ) อย่างไรก็ตาม การขยายและลักษณะภูมิภาคของไม่ทราบลำดับความต้องการนี้เรียกเก็บข้อ จำกัด ( 3 ) 3 การแข่งขันใหม่ ใช้ประโยชน์จากธรรมชาติ ( โพลี ) หางพบใน mRNA เป็นเว็บไซต์ทั่วไปรองพื้นสำหรับ PCR ในกระบวนการนี้รหัสจะถูกแปลงเป็นยีนโดยใช้ reverse transcriptase ( RT ) และ โอลิโก DT อะแดปเตอร์ไพรเมอร์ ยีนที่เฉพาะเจาะจงแล้วขยายด้วยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ของยีนที่เฉพาะเจาะจง ( GSP ) ที่ anneals ไปยังภูมิภาคหรือเอ็กซลำดับและอะแดปเตอร์ไพรเมอร์ที่เป้าหมาย poly ( A ) ตามภูมิภาค นี้อนุญาตให้จับใหม่ไม่รู้จัก - 3 ลำดับของที่วางอยู่ระหว่างล้อหน้าและ poly ( A ) หางการแข่งขัน 5 ใหม่ใช้ยีน antisense เฉพาะแนวทางสำหรับการสังเคราะห์ cDNA โดยเฉพาะสิ่งที่ตรงกันข้าม .

ก่อน PCR , TDT ตามขั้นตอนให้อะแดปเตอร์ลำดับใหม่ที่ไม่รู้จัก 5 ลำดับของยีน . ยีนที่เฉพาะเจาะจงแล้วขยายด้วยวิธี PCR โดยใช้ GSP ที่ anneals ในภูมิภาคที่รู้จักลำดับและอะแดปเตอร์ไพรเมอร์ชนิดใหม่ที่เป้าหมาย 5 สถานีการแข่งขันมีการใช้เครื่องขยายเสียงและการโคลนรหัสหายาก ( 6 ) และอาจใช้กับห้องสมุด cDNA ที่มีอยู่ ( 7 ) นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์การแข่งขันได้โดยตรงโดยไม่ต้องมีขั้นตอนการโคลนยีนกลาง ( 8,9 ) หรือผลิตภัณฑ์ที่อาจจะถูกใช้เพื่อเตรียมตรวจสอบ ( 10 ) ผลิตภัณฑ์ที่สร้างขึ้นโดย 3 และ 5 ใหม่ใหม่แข่งไหม ขั้นตอนอาจจะรวมกันเพื่อสร้าง cdnas เต็มตัว ( 10,11 ) ท้ายนี้การแข่งขันขั้นตอนอาจจะใช้ร่วมกับวิธีเอ็กซดัก ( 12 ) เพื่อให้เพิ่มจำนวน และคุณสมบัติที่ตามมาของลำดับรหัสที่ไม่รู้จัก