5 min. The supernatant was transfer

5 min. The supernatant was transferred to a clean tube and the extractionwas
repeated twice, making up a total volume of 15ml supernatant
(myofibrillar protein extract).Myofibrillar protein extract was stored at
−20 °C until further processing.
2.6. 1D-SDS–PAGE gel electrophoresis
1D-SDS–PAGEwas used to examine themeatmyofibrillar protein
profiles. Myofibrillar protein profiles were obtained according to the
procedure described by (Ha, Bekhit, Carne, & Hopkins, 2013) with
modification. The myofibrillar protein extracts were thawed and
30 μl aliquots were transferred to 600 μl microfuge tubes. Milli-Q
water (15 μl), 17.1 μl BOLT™ (Life Technologies New Zealand Limited,
Auckland, New Zealand) sample buffer (4×) and 6.75 μl BOLT™
reducing agent (10×) were added to each extract to make a stock
sample. The stock samples were heated at 90 °C for 5 min. Aliquots
of stock samples (15.3 μl) were loaded onto 15 well BOLT™ 4–12%
Bis–Tris gels. Electrophoresis was performed in BOLT™ MES SDS
running buffer (1×) at 164 V for 34 min at room temperature
(21 °C ± 2.0). The gels were washed three times in Milli-Q water
for 5 min each time and stained overnight in 20 ml Invitrogen
SimplyBlue™ SafeStain with gentle shaking or were further processed
for Western blotting. Stained gels were destained with Milli-Q water
and scanned.
2.7. Western blotting
After electrophoresis gels were briefly washed in Towbin buffer (for
troponin transfer 0.05% (v/v) Tween 20 was added to Towbin buffer).
Proteins were electrotransferred to nitrocellulose membrane using a
Hoefer electroblot cell (Hoeffer, CA, USA) at 300 mA for 3 h with circulated
cold tap water (12 °C) for cooling. The electroblotted gels
were stained overnight in 20 ml Invitrogen SimplyBlue™ SafeStain
with gentle shaking. After electrotransfer the nitrocellulose membrane
(Whatman Protran BA 85, GE Healthcare, Auckland, New
Zealand) was briefly washed with MQ water prior to background
blocking that was performed by adding 20 ml of 5% (w/v) non-fat
milk powder in Tris-buffered saline (TBS) solution containing 0.1%
(v/v) Tween 20 for 3 h with gentle shaking. Background block solution
was discarded and 10 ml milk solution containing primary Ab
(10 μl troponin) was added to the nitrocellulose membrane and left
overnightwith gentle agitation at roomtemperature. Themembrane
was washed three times in TBS for 10 min each time. A 10 ml fresh
milk solution containing 1 μl of secondary Ab was added and incubated
for 3 h with gentle shaking at room temperature. The membrane was
briefly washed three times with TBS. A 2.5 ml aliquot of ECL solution 1
[2.5 mM luminol, 1.36 mM p-coumaric acid, 1.5 M Tris (pH 6.8), MQ
water] was mixed with ECL solution 2 [2.5 ml 1.5 M Tris (pH 6.8), containing
5 μl H2O2] and added to the membrane, followed by detection
using a FUJI imager LAS-3000.
2.8. Statistical analysis
Linear mixed modelswere used to analyse tenderness, purge loss and
cooking loss for the M. longissimus lumborum and M. semimembranosus
muscles separately. For each trait on each muscle type the full model included
fixed effects for treatment (number of replications of PEF), ageing
(3, 7, 14 and 21 days), and an interaction between treatment and
ageing. Each of the main fixed effects was further broken into subeffects,
with treatment effects separated into a control versus one or
more replicates; a linear effect associated with the “number of replicates”
and non-linear “number of replicate” effects. Ageingwas separated
into linear and non-linear components. Random effects included
were animal effects, blocks within animals, and randomerror. For analysis
of tenderness (shear force) data were log (base e) transformed to
improve variance homogeneity. The models were fitted using the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5 นาที Supernatant ถูกถ่ายโอนไปหลอดที่สะอาดและ extractionwasซ้ำสอง ทำค่าปริมาตรรวมของ 15ml supernatant(myofibrillar โปรตีนสกัด) สารสกัดโปรตีน myofibrillar ถูกเก็บไว้ที่−20 ° C จนถึงการประมวลผลต่อไป2.6. 1D-SDS – หน้าเจ electrophoresis1D-SDS – PAGEwas ใช้ในการตรวจสอบโปรตีน themeatmyofibrillarโพรไฟล์ โพรไฟล์ myofibrillar โปรตีนได้รับตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ โดย (Ha, Bekhit, Carne และ ฮ็อปกินส์ 2013) มีปรับเปลี่ยน สารสกัดจากโปรตีน myofibrillar ถูก thawed และ30 μl aliquots ถูกโอนย้ายไปหลอด microfuge μl 600 Qน้ำ (15 μl), 17.1 μl ™ BOLT (ชีวิตเทคโนโลยีนิวซีแลนด์ จำกัดโอ๊คแลนด์ นิวซีแลนด์) ตัวอย่าง μl 6.75 BOLT ™และบัฟเฟอร์ (4 ราย)เพิ่มตัวแทนลดลง (ตาราง 10) เพื่อแยกแต่ละคลังให้ตัวอย่างการ ตัวอย่างหุ้นถูกความร้อนที่ 90 ° C สำหรับ 5 นาที Aliquotsของตัวอย่าง (15.3 μl) ถูกโหลดลง 15 หุ้นดี™สายฟ้า 4-12%Bis – ตรีเจ ทำ electrophoresis ในสายฟ้า™ MES SDSใช้บัฟเฟอร์ (1 ราย) ที่ 164 V สำหรับ 34 นาทีที่อุณหภูมิห้อง(21 ° C ± 2.0) เจถูกล้างสามครั้งในน้ำ Qใน 5 นาทีแต่ละเวลา และทิ้งคราบแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์ใน 20 ml InvitrogenSafeStain ™ SimplyBlue กับอ่อนโยนสั่น หรือถูกประมวลผลต่อไปสำหรับ blotting วิธีเวสเทิร์น เจทิ้งคราบได้ destained น้ำ Qและสแกน2.7. blotting วิธีตะวันตกหลังจาก electrophoresis เจถูกสั้น ๆ ล้างในบัฟเฟอร์ Towbin (troponin โอน 0.05% (v/v) Tween 20 ถูกเพิ่มลงในบัฟเฟอร์ Towbin)โปรตีนถูก electrotransferred การใช้เมมเบรน nitrocellulose การHoefer electroblot เซลล์ (Hoeffer, CA, USA) 300 mA สำหรับ h 3 กับหมุนเวียนไปเย็นเคาะน้ำ (12 ° C) สำหรับระบายความร้อน เจ electroblottedมีสีค้างคืนใน 20 ml SafeStain ™ Invitrogen SimplyBlueด้วยการสั่นเบา ๆ หลังจาก electrotransfer เมมเบรน nitrocellulose(Whatman Protran BA 85, GE สุขอนามัย โอ๊คแลนด์ ใหม่นิวซีแลนด์) ถูกล้าง ด้วยน้ำ MQ ก่อนพื้นหลังสั้น ๆบล็อกที่ทำ โดยการเพิ่ม 20 มล.ของ 5% (w/v) ไม่ไขมันนมผงในทริสเรทติ้ง buffered saline (TBS) โซลูชันประกอบด้วย 0.1%(v/v) Tween 20 สำหรับ h 3 ด้วยการสั่นเบา ๆ แก้ปัญหาพื้นหลังของบล็อกได้ถูกละทิ้ง และ 10 ml นมโซลูชันประกอบด้วย Ab หลัก(10 μl troponin) ถูกเพิ่มเข้าไป nitrocellulose เมมเบรนและซ้ายovernightwith เบา ๆ อาการกังวลต่อที่ roomtemperature Themembraneถูกล้างสามครั้งใน TBS ใน 10 นาทีแต่ละครั้ง Ml 10 สดประกอบด้วย μl 1 ของ Ab รองโซลูชันนมเพิ่ม และ incubatedสำหรับ h 3 ด้วยการสั่นเบา ๆ ที่อุณหภูมิห้อง เยื่อได้ล้าง 3 ครั้ง ด้วย TBS. สั้น ๆ ส่วนลงตัว 2.5 ml ของ ECL 1[2.5 มม.ลูมินอล กรด p-coumaric มม. 1.36 ตรี 1.5 M (pH 6.8), MQน้ำ] ถูกผสม ด้วยโซลูชั่น ECL 2 [1.5 M 2.5 มลตรี (pH 6.8), ประกอบด้วย5 μl H2O2] และเพิ่มเมมเบรน ตาม ด้วยการตรวจสอบใช้ถ่ายภาพฟูจิลา-30002.8. สถิติวิเคราะห์Modelswere รวมเชิงเส้นที่ใช้ในการวิเคราะห์กดเจ็บ ล้างขาดทุน และการสูญเสียอาหารสำหรับ M. longissimus lumborum และ semimembranosus เมตรกล้ามเนื้อต่างหาก สำหรับแต่ละติดบนกล้ามเนื้อแต่ละชนิดแบบเต็มรวมอายุคงผลการรักษา (จำนวนของระยะของ PEF),(3, 7, 14 และ 21 วัน), และการโต้ตอบระหว่างการรักษา และอายุ หลักการคงลักษณะพิเศษแต่ละถูกเพิ่มเติมแบ่ง subeffectsมีลักษณะการรักษาแบ่งออกเป็นตัวควบคุมและหนึ่ง หรือเหมือนกับเพิ่มเติม ลักษณะเส้นที่เกี่ยวข้องกับ "จำนวนเหมือนกับ"และลักษณะพิเศษ "จำนวนจำลอง" ที่ไม่ใช่เชิงเส้น Ageingwas แยกเป็นส่วนประกอบเชิงเส้น และไม่เชิงเส้น รวมผลสุ่มลักษณะพิเศษของสัตว์ สัตว์ และ randomerror บล็อกได้ สำหรับการวิเคราะห์เจ็บ (แรงเฉือน) ข้อมูลมีล็อก (ฐาน e) เปลี่ยนไปปรับปรุงความแปรปรวน homogeneity รุ่นถูกติดตั้งโดยใช้การ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5 นาที. สารละลายที่ถูกย้ายไปเป็นหลอดที่สะอาดและ extractionwas
ซ้ำกันสองครั้งทำให้ค่าปริมาณรวมของใส 15ml
(สารสกัดจากโปรตีนกล้ามเนื้อ) สารสกัดจากโปรตีน .Myofibrillar ถูกเก็บไว้ที่
-20 องศาเซลเซียสจนกว่าจะดำเนินการต่อไป.
2.6 1D-SDS-PAGE เจลอิเล็ก
1D-SDS-PAGEwas ใช้ในการตรวจสอบโปรตีน themeatmyofibrillar
โปรไฟล์ โปรไฟล์โปรตีนกล้ามเนื้อได้รับเป็นไปตามขั้นตอนที่อธิบายมาจาก (ฮา Bekhit ขลุกขลิกและฮอปกินส์ 2013) ที่มีการปรับเปลี่ยน สารสกัดโปรตีนกล้ามเนื้อถูกละลายและ30 ไมโครลิตร aliquots ถูกถ่ายโอนไป 600 ไมโครลิตรหลอด microfuge Milli-Q น้ำ (15 ไมโครลิตร) 17.1 ไมโครลิตร BOLT ™ (เทคโนโลยีชีวิตนิวซีแลนด์ จำกัด , โอ๊คแลนด์นิวซีแลนด์) บัฟเฟอร์ตัวอย่าง (4 ×) และ 6.75 ไมโครลิตร BOLT ™รีดิวซ์(10 ×) มีการเพิ่มสารสกัดจากแต่ละที่จะทำให้ หุ้นกลุ่มตัวอย่าง กลุ่มตัวอย่างที่หุ้นถูกความร้อนที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที aliquots ตัวอย่างหุ้น (15.3 ไมโครลิตร) ถูกโหลดลง 15 ดี BOLT ™ 4-12% เจล Bis-Tris อิเล็กได้รับการดำเนินการใน BOLT ™ MES SDS ทำงานบัฟเฟอร์ (1 ×) ที่ 164 V 34 นาทีที่อุณหภูมิห้อง(21 องศาเซลเซียส± 2.0) เจลล้างสามครั้งในน้ำ Milli-Q เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้งและสีค้างคืนใน 20 มล. Invitrogen SimplyBlue ™ SafeStain กับอ่อนโยนสั่นหรือถูกดำเนินการต่อไปสำหรับซับตะวันตก เจลสีที่ถูก destained ด้วยน้ำ Milli-Q และสแกน. 2.7 ซับตะวันตกหลังจากที่เจลอิเล็กถูกล้างในเวลาสั้น ๆ ในบัฟเฟอร์ Towbin (สำหรับการถ่ายโอนนิ0.05% (v / v) Tween 20 ถูกบันทึกอยู่ในบัฟเฟอร์ Towbin). โปรตีนถูก electrotransferred จะเมมเบรน nitrocellulose ใช้Hoefer electroblot เซลล์ (Hoeffer, CA, USA) ที่ 300 มิลลิแอมป์เป็นเวลา 3 ชั่วโมงกับการหมุนเวียนน้ำประปาเย็น(12 ° C) เพื่อระบายความร้อน เจล electroblotted มีการย้อมค้างคืนใน 20 มล. Invitrogen SimplyBlue ™ SafeStain กับอ่อนโยนสั่น หลังจาก electrotransfer เมมเบรน nitrocellulose (เบอร์ Protran BA 85, GE Healthcare, โอ๊คแลนด์นิวซีแลนด์) เป็นเวลาสั้น ๆ ล้างด้วยน้ำ MQ ก่อนที่จะมีพื้นหลังการปิดกั้นที่ได้ดำเนินการโดยการเพิ่ม20 มล. 5% (w / v) ที่ไม่มีไขมันนมผงในทริสน้ำเกลือบัฟเฟอร์ (TBS) วิธีการแก้ปัญหาที่มี 0.1% (v / v) Tween 20 เป็นเวลา 3 ชั่วโมงกับสั่นอ่อนโยน วิธีการแก้ปัญหาบล็อกพื้นหลังถูกทิ้งและ 10 มล. วิธีการแก้ปัญหานมที่มีหลัก Ab (10 ไมโครลิตรนิ) ถูกบันทึกอยู่ในเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสและซ้ายovernightwith กวนอ่อนโยนที่ roomtemperature Themembrane ถูกล้างสามครั้งใน TBS เป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้ง 10 มล. สดวิธีการแก้ปัญหาที่มีนม1 ไมโครลิตรของรอง Ab ถูกบันทึกและบ่มเป็นเวลา3 ชั่วโมงกับอ่อนโยนเขย่าที่อุณหภูมิห้อง เมมเบรนเป็นเวลาสั้น ๆ ล้างสามครั้งกับ TBS 2.5 มล. aliquot ของการแก้ปัญหา ECL 1 [2.5 มิลลิลูมินอล, 1.36 มิลลิกรดพี coumaric 1.5 M Tris (pH 6.8) MQ น้ำ] ผสมกับวิธีการแก้ปัญหา ECL 2 [2.5 มล. 1.5 M Tris (pH 6.8) ที่มี5 ไมโครลิตร H2O2] และเพิ่มไปยังเมมเบรนตามด้วยการตรวจสอบโดยใช้อิมเมจFUJI LAS-3000. 2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติเชิงเส้น modelswere ผสมใช้ในการวิเคราะห์ความอ่อนโยน, การสูญเสียล้างและการสูญเสียการปรุงอาหารสำหรับเอ็มlongissimus lumborum และเอ็ม semimembranosus กล้ามเนื้อแยกต่างหาก สำหรับแต่ละลักษณะของกล้ามเนื้อในแต่ละพิมพ์รูปแบบเต็มรูปแบบรวมถึงผลกระทบที่ได้รับการแก้ไขในการรักษา (จำนวนซ้ำของ PEF) อายุ (3, 7, 14 และ 21 วัน) และการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างการรักษาและริ้วรอย แต่ละผลกระทบคงที่หลักถูกทำลายต่อไปใน subeffects, ที่มีผลการรักษาที่แยกออกจากกันในการควบคุมเมื่อเทียบกับหนึ่งหรือมากขึ้นซ้ำ; ผลกระทบเชิงเส้นที่เกี่ยวข้องกับ "จำนวนของซ้ำ" และที่ไม่ใช่เชิงเส้น "จำนวนของซ้ำ" ผลกระทบ Ageingwas แยกออกเป็นเชิงเส้นและส่วนประกอบที่ไม่ใช่เชิงเส้น สุ่มผลกระทบรวมถึงมีผลกระทบต่อสัตว์บล็อกภายในสัตว์และ randomerror สำหรับการวิเคราะห์ของความอ่อนโยน (แรงเฉือน) ข้อมูลคือการเข้าสู่ระบบ (ฐาน e) เปลี่ยนการปรับปรุงความสม่ำเสมอของความแปรปรวน รุ่นที่กำลังพอดีใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5 นาทีนำไปเป็นหลอดที่สะอาดและ extractionwas
ซ้ำ 2 ครั้ง ทำให้ได้ปริมาณ 15ml
( โดยนำโปรตีนที่สกัดจากสารสกัดจากโปรตีน พบ ) ถูกเก็บไว้ที่− 20 ° C
จนกระทั่งแปรรูป .
2.6 1d-sds –หน้าเจล
1d-sds – pagewas ใช้เพื่อตรวจสอบสภาพโปรตีน
themeatmyofibrillar .โดยรูปแบบโปรตีนได้ตามขั้นตอนที่อธิบายโดย
( ฮา bekhit , เนื้อ , &ฮอปกินส์ , 2013 )
ดัดแปลง การพบโปรตีนที่แยกได้ถูกละลายและ
30 μผมเฉยๆ คือ μผม microfuge 600 หลอด milli-q
น้ำ ( 15 μ L ) , 17.1 μแอลโบลท์™ ( ชีวิตเทคโนโลยีนิวซีแลนด์จำกัด (
, นิวซีแลนด์ ) ตัวอย่างบัฟเฟอร์ ( 4 × ) และ 6.75 μแอลโบลท์™
รีดิว ( 10 × ) ถูกเพิ่มไปยังแต่ละแยกเพื่อให้หุ้น
ตัวอย่าง หุ้นจำนวน 90 องศา C อุณหภูมิ 5 นาทีเฉยๆ
ตัวอย่างหุ้น ( 15.3 μ L ) ถูกโหลดไปยัง 15 ด้วยสายฟ้า™ 4 – 12 %
ทวิ ) หรือเจล วิธีแสดงในกลอน™เดือน SDS
วิ่งบัฟเฟอร์ ( 1 × ) ที่ 164 v 34 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ( 25 องศา C
± 2.0 ) เจลได้ซักสามครั้งใน milli-q น้ำ
เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้งและเปื้อนค้างคืน 20 ml Invitrogen
simplyblue ™ safestain ด้วยความอ่อนโยนสั่นหรือเพิ่มเติมประมวลผล
สำหรับ Western blotting . เปื้อนเจลเป็น destained น้ำ milli-q และสแกนด้วย
.
2.7 . วิธี Western blotting
หลังจากล้างเจลได้สั้น ๆใน towbin บัฟเฟอร์ (
โอน 0.05 % โทรโปนิน ( v / v ) Tween 20 ที่ถูกเพิ่มเข้าไปใน towbin
บัฟเฟอร์ )โปรตีนเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสเพื่อใช้เป็น electrotransferred
โฮเฟอร์ electroblot เซลล์ ( hoeffer , CA , USA ) มา 300 3 H กับหมุนเวียน
น้ำหนาว ( 12 ° C ) เพื่อระบายความร้อน การ electroblotted เจล
ใช้ย้อมคืน 20 ml Invitrogen simplyblue ™ safestain
กับอ่อนโยนสั่น หลังจาก electrotransfer มีไนโตรเยื่อ
( whatman protran BA 85 , GE Healthcare , Auckland , New
นิวซีแลนด์ ) คือสั้นๆ ล้างด้วยน้ำก่อน ? พื้นหลัง
บล็อกที่แสดง โดยการเพิ่ม 20 ml 5 % ( w / v ) ไม่อ้วน
นมผงในนอกจากนี้ในน้ำเกลือ ( TBS ) สารละลายที่มี 0.1 %
( v / v ) Tween 20 3 H กับอ่อนโยนสั่น
โซลูชั่นบล็อกพื้นหลังถูกทิ้งและ 10 ml น้ำนมสารละลายที่มีหลัก AB
( 10 μ L troponin ) ถูกเพิ่มเข้ามาและทิ้ง
เมมเบรนไนโตรovernightwith อ่อนโยนการกวนที่อุณหภูมิห้อง . themembrane
ซักสามครั้งใน TBS 10 นาทีในแต่ละครั้ง 10 ml น้ำนมสด
1 L ของสารละลายที่มีμรอง AB ถูกเพิ่มโดย
3 H กับอ่อนโยนเขย่าที่อุณหภูมิห้อง เยื่อแผ่น
สั้นซักสามครั้งกับ TBS . 2.5 ml ส่วนลงตัวของ ECL โซลูชั่น 1
[ 2.5 มม. ลูมินอล p-coumaric 1.36 มิลลิเมตร , กรด , 1.5 M ทริส ( pH 68 ) , MQ
น้ำผสมกับสารละลาย 2 [ 1.5 เมตรจาก 2.5 ml ECL ( พีเอช 6.8 ) ที่มีμ
5 L H2O2 ] และเพิ่มแผ่น ตามด้วยการใช้ฟูจิ las-3000 )
.
2.8 . สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ modelswere
ผสมเชิงเส้นนุ่มล้างขาดทุน
ขาดทุนทำอาหารสำหรับ lumborum ม. โคและ เซมิเมมเบรโนซัส
กล้ามเนื้อแยกต่างหากสำหรับแต่ละลักษณะในแต่ละประเภทของกล้ามเนื้อแบบรวม
ซ่อมผลสำหรับการรักษา ( จํานวนซ้ำของ PEF ) ริ้วรอย
( 3 , 7 , 14 และ 21 วัน ) และปฏิสัมพันธ์ระหว่างการรักษาและ
ริ้วรอย ของแต่ละหลักคงที่ ผลยังแตกเป็น subeffects
กับผลการรักษา , แบ่งออกเป็นการควบคุม
ซ้ำเมื่อเทียบกับหนึ่งหรือมากกว่าเส้นผลที่เกี่ยวข้องกับ " จํานวนซ้ำและไม่เชิงเส้น "
" จำนวนสร้าง " ผลกระทบ ageingwas แยก
เป็นเชิงเส้นและแบบส่วนประกอบ ผลสุ่มรวม
ได้ผลสัตว์ , บล็อกภายในสัตว์ และคลาดเคลื่อน . สำหรับการวิเคราะห์
ของพิศวาส ( แรงเฉือน ) ข้อมูลเข้าสู่ระบบ ( ฐาน e ) เปลี่ยนค่า

เพิ่มความ . รุ่นที่ถูกติดตั้งโดยใช้