2. Materials and methods2.1. Standa

2. Materials and methods

2.1. Standards and reagents

Acetonitrile, formic acid and trifluoroacetic acid were of HPLC grade
from VWR Prolabo (Fontanay sous Bois, France). Phenolic standard compounds
(cyanidin 3-O-glucoside, delphinidin 3-O-glucoside, malvidin
3-O-glucoside, peonidin 3-O-glucoside, petunidin 3-O-glucoside, gallic
acid, caffeic acid, p-coumaric acid, (+)-catechin (−)-epicatechin and
epicatechin 3-O-gallate) were purchased from Extrasynthese (Genay,
France). 2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
(ABTS), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH), 6-hydroxy-2,5,7,8-
tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid (Trolox), and Folin Ciocalteu
reagent were from Sigma Aldrich Co® (St. Louis, MO, USA).

2.2. Vegetal material

Ripe chagalapoli fruits (A. compressa K.) were manually harvested in
a small orchard sited in San Andrés Tuxtla, Veracruz (18° 27″ N latitude,
and 95° 13″ W longitude, 300 meter altitude). About 12 kg of fruit was
collected from 10 to 20 different trees, in order to capture as much as
possible the biological variability. Fruits were stored at 4 °C until analysis.
Strawberries (Fragaria vesca), blueberries (Vaccinium myrtillus), and
blackberries (Rubus fructicosus) from a local market were used as controls
for total soluble phenolics, anthocyanin composition and antioxidant
activity. These berries were grown in the State of Jalisco, Mexico by The
Driscoll's company.
The fruits of A. compressa Kush (chagalapoli) are produced in a
raceme (Fig. 1a,b). Botanically, the fruit is classified as a drupe. The fruits
are spherical, with a diameter of 0.8 to 1.5 cm, deep red to purple color,
juicy, and with a slight acidic taste and soft texture (Fig. 1c). Fruits have
a spherical and hard seed that is covered with a layer of rough texture
(Fig. 1d). The seed represents around 38% of the fresh weight of the fruit.

2.3. Physicochemical characterization of fruits

Approximately 100 g of fresh fruit was manually pressed to obtain
the juice, that was used to determine total soluble solids (°Brix) with a
hand refractometer (Pal-1, ATAGO, Tokyo, Japan). The pH was measured
with a pH meter (MI 255 Hanna Instruments, Woonsocket, RI,
USA) and titratable acidity (TA) was determined by titration with
0.1 M NaOH (AOAC, 2000). TA value was expressed as tartaric acid
equivalents. All these determinations were done in triplicate.

2.4. Proximal and mineral composition

Moisture, nitrogen, ether extract, ash and fiber were measured by
the AOAC (2000) methods, in deseeded freeze-dried samples. The remaining
percentage was considered to represent carbohydrates. The
conversion factor for total protein was 6.25 (N × 6.25). Mineral content
was determined after HClO4/HNO3 digestion (Jones & Case, 1990) in an
inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy analyzer
(3000SC Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA).

2.5. Phenolic compounds

2.5.1. Extraction
One gram of deseeded fresh fruit sample was weighed in a 125-mL
Erlenmeyer flask and a volume of 20 mL of 1% trifluoroacetic acid
(TFA) in methanol was added. The sample was homogenized with a
manual blender (Bosch, Ergo Mixx) and sonicated in an Ultrasonic
bath (Brason model 2510) for 30 min and agitated in a horizontal shaker
at room temperature (~24 °C) for 1.5 h. To facilitate supernatant recovery,
the sample was centrifuged (Hettich zentrifugen, Mod. Universal
32) at 2200 g for 15 min. The supernatant was removed and the residue
was re-extracted twice with 15 mL of a mixture of methanol:acetic
acid:water (10:1:9 v/v/v). The three supernatants were pooled and brought to a final volume of 100 mL with the same solvent used in the
last two extractions. This extract was prepared in triplicate and it was
used for the analysis of total phenolic and anthocyanin contents and antioxidant
activity.

2.5.2. Total soluble phenolics (TSP)

The Folin–Ciocalteu (F-C) method was used to determine total soluble
phenolics (Singleton & Rossi, 1965). Briefly, an aliquot of the previous
extract (100 μL) was mixed with 125 μL of F-C reagent and allowed
to react for 6 min; the reaction was then neutralized with 1250 μL of saturated
Na2CO3 solution (19%) and adjusted to a final volume of 3 mL
with distilled water. The mixture was vortexed and stored in darkness
for 90 min. The absorbance of the samples was measured at 760 nm. A
standard curve was prepared with gallic acid to express the concentration
as function of this phenolic acid.

2.5.3. Total anthocyanin content (TAC)

The absorbance of the methanolic extract was measured at 520 nm
in a Perkin-Elmer spectrophotometer. A standard curve of cyanidin 3-
O-glucoside (Cy3G) was prepared and TAC was expressed as Cy3G
equivalents (Salinas, Salas, Hernández, & Ramos, 2005).

2.5.4. HPLC–DAD–ESI-MS analyses

2.5.4.1. Anthocyanins. 500 mg of lyophilized sample was mixed with
50 mL of methanol:1% TFA in water, 80:20 (v/v). The sample was sonicated
for 30 min in an ultrasound bath (Brason Model 5510), then
allowed to stand at −20 °C for 3 h, after which time it was centrifuged
at 28,000 g for 10 min at 5 °C (Sorvall RC-5B), the supernatant was recovered
and the residue was subject to two more extractions. The combined
extracts were evaporated at 35 °C to remove the methanol, and
re-dissolved in 20 mL of water and stored at −20 °C until further
analysis.
The extract was analyzed using an HPLC equipment (Hewlett–
Packard 1100) provided with a quaternary pump, automatic injector,
diode array detector and data treatment station. Separation was
achieved on an AQUA® (Phenomenex) reverse phase C18 column
(5 μm, 150 mm × 4.6 mm i.d.) thermostated at 35 °C. The solvents
used were: (A) 0.1% TFA in water, and (B) 100% acetonitrile. The gradient
employed was: isocratic 10% B for 5 min, from 10 to 15% B for 5 min,
isocratic 15% B for 5 min, from 15 to 18% B for 5 min, from 18 to 35% B for
20 min, and from 35 to 10% for 20 min, at a flow rate of 0.5 mL/min
(García-Marino, Trigueros, & Escribano-Bailón, 2010). Double online detection
was carried out in the DAD, using 520 nm as the preferred wavelength,
and by MS in an API 3200 Qtrap (Applied Biosystems, Darmstadt,
Germany) equipped with an ESI source and a triple quadrupole-ion trap
mass analyzer that was controlled by the Analyst 5.1 software. Mass
spectra were obtained in the positive ion mode. Zero grade air served
as the nebulizer gas (40 psi) and turbo gas (600 °C) for solvent drying
(50 psi). Nitrogen served as the curtain (100 psi) and collision gas
(high). Both quadrupoles were set at unit resolution. The ion spray voltage
was set at 5000 V in the positive mode. EMS and ESI methods were
used for acquisition of full scan spectra and fragmentation patterns of
the precursor ions, respectively. Setting parameters used for EMS
mode were: declustering potential (DP) 41 V, entrance potential (EP)
7.5 V, and collision energy (CE) 10 V, and parameters for EPI mode
were: DP 41 V, EP 7.5 V, CE 10 V, and collision energy spread (CES)
0 V. The anthocyanins present in the samples were characterized according
to their UV and mass spectra and retention times. Anthocyanin
quantification was made from the areas of the peaks recorded at 520 nm
by comparison with calibration curves prepared by injection of known
concentrations of standards of the usual anthocyanin 3-O-glucosides
(delphinidin 3-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside, petunidin
3-O-glucoside, peonidin 3- and malvidin 3-O-glucoside). The different
anthocyanins detected in the A. compressa samples were quantified
from the curves of the corresponding anthocyanin 3-O-glucoside containing the same aglycone. Samples were analyzed in triplicate
and the results expressed in mg per g dry weight.

2.5.4.2. Non-anthocyanin phenolic compounds.
The analysis was achieved with the same equipment described for anthocyanins. The analytical
column was a Waters Spherisorb 3 μm (150 × 4.6 mm) that was maintained
at 35 °C. The solvents used were: (A) 0.1% formic acid, and
(B) 100% acetonitrile. The gradient employed was: isocratic 15% of B
for 5 min, lineal 15% to 20% of B in 5 min, 20% to 25% of B in 10 min,
25% to 35% of B in 10 min, 35% to 10% of B in 10 min, followed by a
time of system equilibrium before the next injection. The flow rate
was set at 0.5 mL/min (Barros, Dueñas, Carvalho, Ferreira, & SantosBuelga,
2012). Double detection was carried out in the DAD using 280
and 370 nm as preferred wavelengths, and by mass spectrometry in
the same equipment and conditions described for anthocyanins, but
setting detection in the negative ion electrospray mode. The phenolic
identities were assigned based on their retention characteristics, UV–
visible spectra, pseudomolecular ions and mass fragmentation patterns.
For quantitative analysis, calibration curves were prepared by injection
of known concentrations of the available standard compounds (caffeic
and p-coumaric acids, (+)-catechin, (−)-epicatechin, kaempferol 3-Oglucoside,
quercetin 3-O-glucoside and quercetin 3-O-rutinoside). Compounds
for which a commercial standard was not available were quantified
through the calibration curve of a compound from the same
phenolic group. Samples were analyzed in triplicate and the results
expressed in mg per g dry weight.

2.6. Antioxidant activity

2.6.1. DPPH assay

The method was performed at 20 °C using a 60 μM solution of 1,1-
diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co®) in 80%
methanol. Aliquots of 200 μL of extract reacted with 2.8 mL of DPPH in
quartz cells, and absorbance was monitored every 5 min over 30 min,
at 515 nm, using 80% methanol solution as blank. The reduced percentage
of the DPPH was calculated with the equation: % reduced DPPH =
[(C − S) / C] × 100, where C is the net absorbance of the control and S
is the net absorbance of the sample. The control was prepared by mixing
100 μL of 80% methanol with 2.9 mL of the DPPH solution (Soler-Rivas,
Espín, & Wichers, 2000).

2.7. Statistical analysis
Data from fruit characterizati

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 มาตรฐานและ reagentsได้เกรด HPLC Acetonitrile กรด และกรด trifluoroaceticจาก Prolabo VWR (Fontanay ชาวบอยส์ ฝรั่งเศส) ม่อฮ่อมมาตรฐาน(cyanidin 3-O-glucoside, delphinidin 3-O-glucoside, malvidin3-O-glucoside, peonidin 3-O-glucoside, petunidin 3-O-glucoside, gallicกรด กรด caffeic กรด p-coumaric (+) -สารสกัดจาก (−) -epicatechin และepicatechin 3-O-gallate) ซื้อจาก Extrasynthese (Genayฝรั่งเศส) กรด 2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic)(รเรียน), 1.1 ฟีนิลได-2-picryl-hydrazil (DPPH), 6-hydroxy-2,5,7,8 -กรด tetramethyl-chroman-2-carboxylic (Trolox), และ Folin Ciocalteuรีเอเจนต์ได้จาก บริษัทซิก Aldrich ® (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา)2.2 การเกิดวัสดุผลไม้สุก chagalapoli (A. compressa คุณ) ได้ด้วยตนเองเก็บเกี่ยวผลผลิตสวนขนาดเล็กที่ในซาน Andrés Tuxtla, Veracruz (ละติจูด 27 ″ N 18°และ ลองจิจูด 95 องศา 13″ W ระดับความสูง 300 เมตร) ประมาณ 12 กก.ของผลไม้ได้รวบรวมจาก 10 ไป 20 ต้นไม้ต่าง ๆ การจับมากที่สุดเท่าเป็นไปได้สำหรับความผันผวนทางชีวภาพ ผลไม้ถูกเก็บไว้ที่ 4 ° C จนถึงการวิเคราะห์สตรอเบอร์รี่ (Fragaria vesca) บลูเบอร์รี่ (Vaccinium myrtillus), และblackberries (Rubus fructicosus) จากตลาดท้องถิ่นถูกใช้เป็นตัวควบคุมphenolics ละลายทั้งหมด ส่วนประกอบมีโฟเลทสูง และสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมการ ครบเหล่านี้ถูกปลูกในรัฐ Jalisco เม็กซิโกโดยการบริษัทของ Driscollผลไม้ของ A. compressa Kush (chagalapoli) ที่ผลิตในการraceme (Fig. 1a, b) Botanically ผลไม้ถูกจัดประเภทเป็นแบบ drupe ผลไม้มี ทรงกลม มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.8-1.5 เซนติเมตร ลึกสีแดงกับสีม่วงฉ่ำ และ มีรสเปรี้ยวเล็กน้อย และนุ่มเนื้อกิน 1c) มีผลไม้เมล็ดทรงกลม และแข็งที่ปกคลุม ด้วยชั้นของเนื้อหยาบกิน 1d) เมล็ดแทนประมาณ 38% ของน้ำหนักสดของผลไม้2.3. physicochemical คุณสมบัติของผลไม้กดผลไม้ประมาณ 100 กรัมได้รับด้วยตนเองน้ำ ที่ใช้ในการกำหนดของแข็งละลายน้ำรวม (° Brix) ด้วย การมือ refractometer (Pal-1 อาตาโกะ โตเกียว ญี่ปุ่น) มีวัด pHด้วยเครื่องวัด pH (MI 255 Hanna เครื่อง Woonsocket, RIสหรัฐอเมริกา) และกำหนดว่า titratable (ตา) โดยการไทเทรตด้วย0.1 M NaOH (AOAC, 2000) ตาค่าถูกแสดงเป็นกรด tartaricเทียบเท่า Determinations ทั้งหมดเหล่านี้ถูกทำใน triplicate2.4. องค์ประกอบที่ proximal และแร่มีวัดความชื้น ไนโตรเจน สารสกัดอีเทอร์ เถ้า และเส้นใยด้วยAOAC (2000) วิธีการ ในตัวอย่างกรอบ deseeded เหลือเปอร์เซ็นต์ที่ถือแทนคาร์โบไฮเดรต ที่ตัวแปลงสำหรับโปรตีนรวม 6.25 (N × 6.25) ได้ เนื้อหาแร่กำหนดหลังจากย่อยอาหาร HClO4/HNO3 (โจนส์และกรณี 1990) ในการท่านควบคู่วิเคราะห์กอะตอมปล่อยก๊าซพลาสม่า(3000SC เพอร์เวลเลสเลย์ MA สหรัฐอเมริกา เอลเมอ)2.5. ม่อฮ่อม2.5.1 การสกัดหนึ่งกรัมของ deseeded ผลไม้อย่างมีน้ำหนักใน 125-mLErlenmeyer หนาวและมีปริมาตร 20 มิลลิลิตรของกรด 1% trifluoroacetic(TFA) ในเมทานอลที่เพิ่มขึ้น ตัวอย่างถูก homogenized เป็นกลุ่มด้วยการเบลนเดอร์ด้วยตนเอง (Bosch, Ergo Mixx) และ sonicated ในการ Ultrasonicน้ำ (Brason รุ่น 2510) 30 นาที และนั้นกระตุ้นทำเชคเกอร์แนวนอนที่อุณหภูมิห้อง (~ 24 ° C) สำหรับ 1.5 h เพื่อกู้คืน supernatantตัวอย่างถูก centrifuged (Hettich zentrifugen, Mod มาตรฐานสากล32) ที่ 2200 กรัมสำหรับ 15 นาที Supernatant ถูกเอาออก และการตกค้างถูกสกัดอีกครั้ง ด้วย 15 mL ผสมระหว่างเมทานอล: อะซิติกกรด: น้ำ (10:1:9 v/v/v) Supernatants 3 ทางถูกพู และนำปริมาตรสุดท้ายของ 100 mL ด้วยตัวทำละลายเดียวกันที่ใช้ในการล่าสุดสองสกัด มีเตรียมสารสกัดนี้ใน triplicate และก็ใช้สำหรับการวิเคราะห์เนื้อหามีโฟเลทสูงและฟีนอรวมและสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมการ2.5.2 การรวมละลาย phenolics (ช้อนชา)วิธี Folin-Ciocalteu (F-C) ถูกใช้เพื่อกำหนดทั้งหมดที่ละลายน้ำได้phenolics (เดี่ยว & Rossi, 1965) สั้น ๆ เป็นส่วนลงตัวของก่อนหน้า(100 μL) สารสกัดผสมกับ μL 125 ของรีเอเจนต์ F C และอนุญาตการตอบสนองในนาทีที่ 6 ปฏิกิริยาที่ neutralized แล้วกับ μL 1250 ของอิ่มตัวโซลูชั่น Na2CO3 (19%) และปรับปริมาตรสุดท้ายของ 3 mLด้วยน้ำกลั่น ส่วนผสมคือ vortexed และเก็บไว้ในความมืดสำหรับ 90 นาที มีวัด absorbance ของตัวอย่างที่ 760 nm Aเส้นโค้งมาตรฐานที่เตรียม มีกรด gallic แสดงความเข้มข้นเป็นฟังก์ชันของกรดฟีนอนี้2.5.3 การมีโฟเลทสูงรวมเนื้อหา (มาตรวัด)มีวัด absorbance ของสารสกัด methanolic ที่ 520 nmในเครื่องทดสอบกรดด่างเพอร์เอลเมอ เส้นโค้งมาตรฐาน cyanidin 3-O-glucoside (Cy3G) ถูกเตรียม และมาตรวัดถูกแสดงเป็น Cy3Gเทียบเท่า (ลิ ศาลา Hernández และ Ramos, 2005)2.5.4 การ HPLC – พ่อ – ESI-MS วิเคราะห์2.5.4.1 นี้ anthocyanins 500 มิลลิกรัมของอย่าง lyophilized ถูกผสมกับมล. 50% เมทานอล: 1 TFA น้ำ 80:20 (v/v) ตัวอย่างที่ sonicatedใน 30 นาทีในการซาวด์ (Brason รุ่น 5510), จากนั้นอนุญาตให้ยืน −20 ° C สำหรับ 3 h หลังจากเวลาที่มันถูก centrifugedที่ g 28000 สำหรับ 10 นาทีที่ 5 ° C (Sorvall RC-5B), supernatant ถูกกู้คืนและสารตกค้างถูกต้อง 2 สกัดเพิ่มมากขึ้น การรวมบางส่วนได้หายไปที่ 35 ° C เอาเมทานอล และการละลายในน้ำ 20 mL และเก็บไว้ที่ −20 ° C เป็นต้นไปวิเคราะห์สารสกัดได้วิเคราะห์โดยใช้อุปกรณ์ HPLC (Hewlett –Packard 1100) มีปั๊ม quaternary หัวฉีดอัตโนมัติไดโอดอาร์เรย์จับและสถานีรักษาข้อมูล แยกเป็นได้ในคอลัมน์ย้อนขั้นตอน C18 มีควา® (Phenomenex)(5 μm ประชาชน 150 มม. × 4.6 มม.) thermostated ที่ 35 องศาเซลเซียส หรือสารทำละลายใช้ได้: (A) 0.1% ในน้ำ และ (ข) 100% acetonitrile TFA การไล่ระดับสีจ้างถูก: isocratic คิด 10% B 5 นาที 10% 15 B สำหรับ 5 นาทีisocratic คิด 15% B 5 นาที 15 18% B สำหรับ 5 นาที จาก 18 ถึง 35% B20 นาที และ 10% สำหรับ 20 นาที ที่อัตราการไหล 0.5 mL/นาที 35(García มาริโน Trigueros และ Escribano-Bailón, 2010) ตรวจสอบออนไลน์คู่ได้ดำเนินการในพ่อ ใช้ 520 nm เป็นความยาวคลื่นที่ต้องการโดย MS ในการ Qtrap 3200 API (ใช้ Biosystems ดาร์มสเยอรมนี) พร้อมกับแหล่ง ESI และกับดักทริ quadrupole ไอออนวิเคราะห์มวลที่ถูกควบคุม โดยซอฟต์แวร์ 5.1 นักวิเคราะห์ มวลแรมสเป็คตราได้รับในโหมดไอออนบวก อากาศระดับศูนย์บริการเป็นฝอยละอองก๊าซ (40 psi) และแก๊สเทอร์โบ (600 ° C) ในตัวทำละลายแห้ง(50 psi) ไนโตรเจนเป็นม่าน (100 psi) และแก๊สชน(สูง) Quadrupoles ทั้งถูกตั้งที่ความละเอียดหน่วย แรงดันไฟฟ้าสเปรย์ไอออนที่ตั้งที่ 5000 V ในโหมดบวก มีวิธี EMS และ ESIใช้สำหรับการซื้อแรมสเป็คตราสมบูรณ์และการกระจายตัวของรูปแบบของกันสารตั้งต้น ตามลำดับ การตั้งค่าพารามิเตอร์ที่ใช้สำหรับไปรษณีย์ EMSมีโหมด: declustering ศักยภาพ (DP) 41 V เข้าชมศักยภาพ (EP)7.5 V และพลังงานการชน (CE) 10 V และพารามิเตอร์สำหรับโหมด EPIถูก: DP 41 V, EP 7.5 V, CE 10 V และพลังงานการชนที่แพร่กระจาย (CES)0 V Anthocyanins ในตัวอย่างมีลักษณะตามการ UV แรมสเป็คตรามวล และเวลาคง มีโฟเลทสูงทำการนับจากพื้นที่แห่งบันทึกที่ 520 nmby comparison with โค้งเทียบโดยฉีดเป็นที่รู้จักความเข้มข้นของมาตรฐานมีโฟเลทสูงปกติ 3-O-glucosides(delphinidin 3-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside, petunidinPeonidin 3 - 3-O-glucoside และ malvidin 3-O-glucoside) ที่แตกต่างกันตรวจพบในตัวอย่าง A. compressa anthocyanins มี quantifiedจากเส้นโค้งสอดคล้องกันมีโฟเลทสูง 3-O-glucoside ประกอบด้วย aglycone เดียว มีวิเคราะห์ตัวอย่างใน triplicateและผลที่แสดงในมิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง2.5.4.2. ไม่มีโฟเลทสูงม่อฮ่อม การวิเคราะห์สำเร็จ ด้วยอุปกรณ์เดียวกับที่อธิบายไว้สำหรับ anthocyanins การวิเคราะห์ทางคอลัมน์ถูก μm น้ำ Spherisorb 3 (150 × 4.6 mm) ที่ถูกเก็บรักษาที่ 35 องศาเซลเซียส หรือสารทำละลายที่ใช้ได้: (A) 0.1% กรด และ(ข) 100% acetonitrile ถูกไล่ระดับการจ้างงาน: isocratic คิด 15% ของ Blineal 15% ถึง 20% ของ B ใน 5 นาที 5 นาที 20% ถึง 25% ของ B ใน 10 นาที25% ถึง 35% ของ B ใน 10 นาที 35% ถึง 10% ของ B ใน 10 นาที ตามด้วยการเวลาของระบบสมดุลก่อนการฉีดต่อไป อัตราการไหลตั้งที่ 0.5 mL/min (Barros, Dueñas, Carvalho, Ferreira, & SantosBuelga2012) การตรวจหาคู่ถูกดำเนินในพ่อใช้ 280และ 370 nm เป็นความยาวคลื่นที่ต้องการ และในโตรเมทรีอุปกรณ์และอธิบายสำหรับ anthocyanins เงื่อนไขเดียวกัน แต่ตรวจหาการตั้งค่าในโหมดวิธีพ่นละอองไฟฟ้าไอออนลบ การฟีนอรหัสประจำตัวให้กับการเก็บข้อมูลลักษณะ UV-มองเห็นแรมสเป็คตรา pseudomolecular กัน และรูปแบบการกระจายตัวของมวลสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ เทียบเส้นโค้งถูกเตรียม โดยการฉีดของทราบความเข้มข้นของสารมาตรฐานว่าง (caffeicและกรด p-coumaric (+) -สารสกัดจาก (−) -epicatechin, kaempferol 3-Oglucosidequercetin 3-O-glucoside และ quercetin 3-O-rutinoside) สารประกอบสำหรับที่มาตรฐานทางการค้าไม่ว่างถูก quantifiedผ่านโค้งเทียบของสารประกอบจากเหมือนกันกลุ่มฟีนอ มีวิเคราะห์ตัวอย่าง triplicate และผลลัพธ์แสดงเป็นมิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง2.6 กิจกรรมสารต้านอนุมูลอิสระ2.6.1. DPPH assayวิธีการทำที่ 20 ° C ใช้โซลูชัน 60 μM 1.1-ฟีนิลได-2-picryl-hydrazil (DPPH) (บริษัทซิก Aldrich ®) 80%เมทานอล Aliquots μL 200 ของสารสกัดจากปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นกับ 2.8 mL ของ DPPH ในควอตซ์ และเซลล์ absorbance ถูกตรวจสอบทุก 5 นาทีกว่า 30 นาทีที่ 515 nm ใช้ 80% เมทานอลโซลูชั่นเป็นค่าว่าง เปอร์เซ็นต์การลดลงของ DPPH ถูกคำนวณ ด้วยสมการ: %ลด DPPH =[(C − S) / C] × 100, C อยู่ absorbance สุทธิควบคุมและ Sabsorbance สุทธิของตัวอย่างได้ ตัวควบคุมถูกเตรียม โดยผสมΜL 100 ของเมทานอล 80% กับ 2.9 mL ของโซลูชัน DPPH (Soler-RivasEspín, & Wichers, 2000)2.7. สถิติวิเคราะห์ข้อมูลจากผลไม้ characterizati

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 มาตรฐานและสารเคมีAcetonitrile กรดฟอร์มิคและกรด TRIFLUOROACETIC เป็นของเกรด HPLC จาก VWR Prolabo (Fontanay sous Bois, ฝรั่งเศส) สารประกอบฟีนอลมาตรฐาน(cyanidin 3-O-glucoside, delphinidin 3-O-glucoside, malvidin 3-O-glucoside, peonidin 3-O-glucoside, petunidin 3-O-glucoside, ฝรั่งเศสกรดกรด caffeic กรดพี coumaric, (+) - catechin (-) - epicatechin และepicatechin 3-O-gallate) ที่ซื้อมาจาก Extrasynthese (Genay, ฝรั่งเศส) 2,2'-Azino-bis- (กรด 3 ethylbenzothiazoline-6-sulphonic) (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH), 6 ไฮดรอกซี-2,5,7,8- tetramethyl-chroman-2-กรดคาร์บอกซิ (Trolox) และ Folin Ciocalteu น้ำยามาจากซิกCo®ดิช (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา). 2.2 Vegetal วัสดุสุกผลไม้ chagalapoli (กเค compressa) ได้รับการเก็บเกี่ยวด้วยตนเองในสวนผลไม้ขนาดเล็กตั้งอยู่ในซานAndrés Tuxtla เวรากรูซ (18 ° 27 "ละติจูด N, 95 ° 13 "W เส้นแวง 300 เมตรความสูง) ประมาณ 12 กิโลกรัมของผลไม้ที่ได้รับการเก็บรวบรวม 10-20 ต้นไม้ที่แตกต่างกันเพื่อที่จะจับให้มากที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ทางชีวภาพแปรปรวน ผลไม้ที่ถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์. สตรอเบอร์รี่ (Fragaria vesca), บลูเบอร์รี่ (Vaccinium myrtillus) และแบล็ก (บัส fructicosus) จากตลาดในประเทศถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับฟีนอลที่ละลายน้ำได้รวมองค์ประกอบ anthocyanin และสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม ผลเบอร์รี่เหล่านี้ถูกปลูกในรัฐฮาลิสโกเม็กซิโกโดยบริษัท คอลล์. ผลของเอ compressa เทือกเขาฮินดูกูช (chagalapoli) มีการผลิตในช่อกระ (รูป. 1a b) พฤกษศาสตร์ผลไม้จัดเป็น drupe ผลไม้ที่มีทรงกลมที่มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.8-1.5 เซนติเมตรสีแดงเข้มสีม่วงฉ่ำและมีรสชาติที่เป็นกรดเล็กน้อยและเนื้อนุ่ม (รูป. 1c) ผลไม้ที่มีเมล็ดกลมและยากที่ปกคลุมด้วยชั้นของเนื้อหยาบ(รูป. 1 วัน) เมล็ดพันธุ์ที่แสดงให้เห็นถึงรอบ 38% ของน้ำหนักสดของผลไม้. 2.3 ลักษณะทางเคมีกายภาพของผลไม้ประมาณ 100 กรัมของผลไม้สดถูกกดด้วยตนเองเพื่อให้ได้น้ำผลไม้ที่ใช้ในการกำหนดปริมาณของแข็งที่ละลายรวม (° Brix) ด้วยเครื่องวัดมือ (Pal-1 Atago, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ค่า pH วัดกับค่า pH เมตร (MI 255 ฮันนาเครื่องดนตรี, Woonsocket น, USA) และความเป็นกรดที่ไตเตร (TA) ถูกกำหนดโดยการไตเตรทกับ0.1 M NaOH (AOAC, 2000) ค่า TA ถูกแสดงเป็นกรดทาร์ทาริกเทียบเท่า หาความทั้งหมดเหล่านี้ได้ทำในเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.4 ใกล้ชิดและองค์ประกอบแร่ความชื้นไนโตรเจนสารสกัดจากอีเทอร์เถ้าและเส้นใยถูกวัดโดยAOAC (2000) วิธีการใน deseeded ตัวอย่างแห้ง ที่เหลือร้อยละได้รับการพิจารณาให้เป็นตัวแทนของคาร์โบไฮเดรต ปัจจัยการแปลงสำหรับโปรตีนรวมอยู่ที่ 6.25 (ยังไม่มี× 6.25) แร่ธาตุที่ถูกกำหนดหลังจากการย่อยอาหาร HClO4 / HNO3 (โจนส์แอนด์เคส, 1990) ในพลาสม่า inductively คู่การปล่อยอะตอมวิเคราะห์สเปกโทรสโก(3000SC Perkin Elmer เลสลีย์, MA, USA). 2.5 สารประกอบฟีนอ2.5.1 สกัดหนึ่งกรัมของตัวอย่างผลไม้สด deseeded ได้รับการชั่งน้ำหนักใน 125 มิลลิลิตรขวด Erlenmeyer และปริมาณ 20 มล 1% กรด TRIFLUOROACETIC (TFA) ในเมทานอลถูกเพิ่มเข้ามา ตัวอย่างปั่นด้วยเครื่องปั่นคู่มือ (Bosch, Ergo Mixx) และ sonicated ในอัลตราโซนิกอาบน้ำ (Brason รุ่น 2510) เป็นเวลา 30 นาทีและไม่สบายใจในเครื่องปั่นแนวนอนที่อุณหภูมิห้อง (~ 24 ° C) 1.5 ชั่วโมง เพื่ออำนวยความสะดวกการกู้คืนใส, ตัวอย่างได้รับการหมุนเหวี่ยง (Hettich zentrifugen, มด. ยูนิเวอร์แซ32) ที่ 2,200 กรัมเป็นเวลา 15 นาที ใสจะถูกลบออกและสารตกค้างเป็นอีกครั้งที่สกัดสองครั้งกับ 15 มิลลิลิตรส่วนผสมของเมทานอล: อะซิติกกรดน้ำ (10: 1: 9 v / v / v) สาม supernatants ถูกรวบรวมและนำไปเล่มสุดท้าย 100 มิลลิลิตรที่มีตัวทำละลายที่ใช้ในช่วงสองสกัด สารสกัดนี้ถูกจัดทำขึ้นเพิ่มขึ้นสามเท่าและมันก็ใช้ในการวิเคราะห์ของฟีนอลทั้งหมดและเนื้อหา anthocyanin สารต้านอนุมูลอิสระและกิจกรรม. 2.5.2 ฟีนอลที่ละลายรวม (TSP) Folin-Ciocalteu (เอฟซี) วิธีการที่ถูกใช้ในการกำหนดที่ละลายได้ทั้งหมดฟีนอล (ซิงเกิลและรอสซี 1965) สั้น ๆ , aliquot ก่อนหน้าของสารสกัด (100 ไมโครลิตร) ผสมกับ 125 ไมโครลิตรของสารเอฟซีและได้รับอนุญาตที่จะตอบสนองเป็นเวลา 6 นาที; ปฏิกิริยาเป็นกลางแล้วกับ 1,250 ไมโครลิตรของอิ่มตัวแก้ปัญหา Na2CO3 (19%) และปรับให้ปริมาณสุดท้ายของ 3 มิลลิลิตรด้วยน้ำกลั่น ส่วนผสมที่ถูกการ vortex และเก็บไว้ในความมืดเป็นเวลา 90 นาที การดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวัดที่ 760 นาโนเมตร กราฟมาตรฐานถูกจัดทำขึ้นกับฝรั่งเศสกรดความเข้มข้นในการแสดงความเป็นฟังก์ชั่นของกรดฟีนอลนี้. 2.5.3 เนื้อหา anthocyanin รวม (TAC) การดูดกลืนแสงของสารสกัดเมทานอลที่ได้รับการวัดที่ 520 นาโนเมตรใน ​​spectrophotometer เพอร์กินเอลเมอ กราฟมาตรฐานของ cyanidin 3 O-glucoside (Cy3G) จัดทำและแทคได้รับการแสดงเป็น Cy3G เทียบเท่า (ซาลินาส, ศาลา, Hernándezและรามอส, 2005). 2.5.4 HPLC-DAD-ESI-MS วิเคราะห์2.5.4.1 anthocyanins 500 mg ของตัวอย่างแห้งผสมกับ50 มลเมทานอล: 1% TFA ในน้ำ 80:20 (v / v) ตัวอย่าง sonicated เป็นเวลา 30 นาทีในอ่างอัลตราซาวนด์ (Brason รุ่น 5510) จากนั้นอนุญาตให้ยืนที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมงหลังจากที่เวลาที่หมุนเหวี่ยงที่ 28,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 5 ° C (Sorvall RC- 5B) ใสหายและสารตกค้างเป็นเรื่องที่สองสกัดมากขึ้น รวมสารสกัดถูกระเหยที่ 35 ° C ถึงลบเมทานอลและอีกครั้งที่ละลายใน 20 มลของน้ำและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนกระทั่งต่อการวิเคราะห์. สารสกัดที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้อุปกรณ์ HPLC (Hewlett- Packard 1100) ให้กับ สี่ปั๊มหัวฉีดอัตโนมัติตรวจจับอาร์เรย์ไดโอดและสถานีการรักษาข้อมูล แยกได้รับการประสบความสำเร็จในAQUA® (Phenomenex) ขั้นตอนการกลับคอลัมน์ C18 (5 ไมครอน 150 มิลลิเมตร× 4.6 มมรหัส) thermostated ที่ 35 ° C ตัวทำละลายที่ใช้มีดังนี้ (A) 0.1% TFA น้ำและ (ข) 100% acetonitrile ไล่ระดับการจ้างงานคือ: isocratic B 10% เป็นเวลา 5 นาที, 10-15% B เป็นเวลา 5 นาที, isocratic B 15% เป็นเวลา 5 นาทีจาก 15 B 18% เป็นเวลา 5 นาที, 18-35% B สำหรับ20 นาที และ 35-10% สำหรับ 20 นาทีที่อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตร / นาที(การ์เซียมารีโน, Trigueros และ Escribano-Bailon 2010) การตรวจหาคู่ออนไลน์ได้ดำเนินการใน DAD ใช้ 520 นาโนเมตรเป็นความยาวคลื่นที่ต้องการและโดย MS ใน API 3200 Qtrap (Applied Biosystems, Darmstadt, เยอรมนี) พร้อมกับแหล่งที่มาของ ESI และกับดักสาม quadrupole ไอออนวิเคราะห์มวลที่ได้รับ ควบคุมโดยนักวิเคราะห์ 5.1 ซอฟแวร์ มวลสเปกตรัมที่ได้รับในโหมดไอออนบวก อากาศเกรดศูนย์ทำหน้าที่เป็นก๊าซ nebulizer (40 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว) และก๊าซเทอร์โบ (600 ° C) สำหรับการอบแห้งตัวทำละลาย(50 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว) ไนโตรเจนทำหน้าที่เป็นม่าน (100 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว) และก๊าซชน(สูง) quadrupoles ทั้งสองถูกตั้งไว้ที่ความละเอียดหน่วย แรงดันสเปรย์ไอออนตั้งอยู่ที่ 5000 V ในโหมดบวก วิธี EMS และ ESI ถูกใช้สำหรับการเข้าซื้อกิจการของสเปกตรัมการสแกนแบบเต็มรูปแบบและการกระจายตัวของไอออนสารตั้งต้นตามลำดับ การตั้งค่าพารามิเตอร์ที่ใช้สำหรับระบบการจัดการสิ่งแวดล้อมโหมดคือ declustering ที่มีศักยภาพ (DP) 41 V ที่มีศักยภาพทางเข้า (EP) 7.5 V และพลังงานชน (CE) 10 V และพารามิเตอร์สำหรับโหมด EPI คือ DP 41 V, EP 7.5 V, CE 10 V และพลังงานการปะทะกันการแพร่กระจาย (CES) 0 โวลต์ anthocyanins อยู่ในกลุ่มตัวอย่างมีลักษณะตามที่จะสเปกตรัมรังสียูวีและมวลและการเก็บรักษาครั้งของพวกเขา Anthocyanin ปริมาณถูกสร้างขึ้นมาจากพื้นที่ของยอดเขาบันทึกไว้ที่ 520 นาโนเมตรโดยเปรียบเทียบกับเส้นโค้งการสอบเทียบที่จัดทำโดยการฉีดที่รู้จักในระดับความเข้มข้นของมาตรฐานปกติ anthocyanin 3-O-glucosides (delphinidin 3-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside , petunidin 3-O-glucoside, peonidin 3 และ malvidin 3-O-glucoside) ที่แตกต่างกันanthocyanins ตรวจพบในตัวอย่างเอ compressa ถูกวัดจากเส้นโค้งของ anthocyanin ที่สอดคล้องกัน 3-O-glucoside ที่มี aglycone เดียวกัน ตัวอย่างการวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่าและผลที่แสดงออกในมิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง. 2.5.4.2 สารประกอบฟีนอ anthocyanin ไม่. วิเคราะห์ก็ประสบความสำเร็จด้วยอุปกรณ์เดียวที่อธิบายไว้สำหรับ anthocyanins วิเคราะห์คอลัมน์เป็นน้ำ Spherisorb 3 ไมครอน (150 × 4.6 มม) ที่ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 35 องศาเซลเซียส ตัวทำละลายที่ใช้คือ: (A) 0.1% กรดและ(ข) 100% acetonitrile การไล่ระดับสีที่ใช้คือ: isocratic 15% ของ B เป็นเวลา 5 นาที, ตรง 15% ถึง 20% ของ B ใน 5 นาที, 20% ถึง 25% ของ B ในเวลา 10 นาที, 25% ถึง 35% ของ B ในเวลา 10 นาที, 35% 10% ของ B ในเวลา 10 นาทีตามด้วยช่วงเวลาแห่งความสมดุลของระบบก่อนที่จะฉีดต่อไป อัตราการไหลอยู่ที่ 0.5 มิลลิลิตร / นาที (Barros, Dueñas, วัลโญ่, เฟอร์และ SantosBuelga, 2012) การตรวจสอบคู่ได้ดำเนินการใน DAD ใช้ 280 และ 370 นาโนเมตรเป็นความยาวคลื่นที่ต้องการและมวลสารในอุปกรณ์เดียวกันและเงื่อนไขที่อธิบายไว้สำหรับ anthocyanins แต่การตรวจสอบการตั้งค่าในโหมด electrospray ไอออนลบ ฟีนอลตัวตนที่ได้รับมอบหมายตามลักษณะการเก็บรักษาของพวกเขารังสียูวีสเปกตรัมที่มองเห็นไอออน pseudomolecular และรูปแบบการกระจายตัวของมวล. สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณเส้นโค้งการสอบเทียบได้จัดทำโดยการฉีดของความเข้มข้นที่รู้จักกันของสารมาตรฐานที่มีอยู่ (caffeic และกรดพี coumaric ( +) - catechin, (-) - epicatechin, เฟอรอล 3 Oglucoside, quercetin 3-O-glucoside และ quercetin 3-O-rutinoside) สารประกอบที่มีมาตรฐานในเชิงพาณิชย์ก็ไม่สามารถใช้ได้ถูกวัดผ่านกราฟมาตรฐานของสารที่มาจากที่เดียวกันกลุ่มฟีนอล ตัวอย่างการวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่าและผลที่แสดงในมิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง. 2.6 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ2.6.1 ทดสอบ DPPH วิธีการดำเนินการที่ 20 ° C โดยใช้ 60 ไมครอนแก้ปัญหาของ 1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) (Sigma Co®ดิช) ใน 80% เมทานอล aliquots 200 ไมโครลิตรของสารสกัดจากปฏิกิริยากับ 2.8 มิลลิลิตร DPPH ในเซลล์ผลึกและการดูดกลืนแสงได้รับการตรวจสอบทุก ๆ 5 นาทีกว่า 30 นาทีที่ 515 นาโนเมตรโดยใช้วิธีการแก้ปัญหาเมทานอล 80% ในขณะที่ว่างเปล่า ลดลงร้อยละของ DPPH ที่คำนวณด้วยสมการ:% ลดลง DPPH = [(C - S) / C] × 100, C คือการดูดกลืนแสงสุทธิควบคุมและ S คือการดูดกลืนแสงสุทธิของกลุ่มตัวอย่าง การควบคุมถูกจัดทำขึ้นโดยการผสม100 ไมโครลิตรของเมทานอล 80% กับ 2.9 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหา DPPH (Soler-วาสEspin และ Wichers, 2000). 2.7 การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลจาก characterizati ผลไม้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ

2.1 . มาตรฐานและสารเคมีกรดฟอร์มิก

ไน และกรดไตรฟลูออโรอะซิติกเป็น
เกรด HPLC จาก prolabo อนาคีเมีย ( fontanay ซูบัวส์ , ฝรั่งเศส ) มาตรฐานสารฟีโนลิก ( ไซยานิดิน 3-o-glucoside เดลฟินิดีน 3-o-glucoside
, ,
3-o-glucoside malvidin , 3-o-glucoside พีโอนิดิน , 3-o-glucoside พิตูนิดิน , กรด Caffeic กรดแกลลิค
, p-coumaric กรด( ) - catechin ( − ) - แคเทชินและ
แคเทชิน 3-o-gallate ) ซื้อจาก extrasynthese ( genay
, ฝรั่งเศส ) ได้รับ 2 , 2 - azino bis - ( 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid )
( Abbr ) 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil ( dpph ) 6-hydroxy-2,5,7,8 -
tetramethyl-chroman-2-carboxylic แอซิด ( สาร ) และ folin ciocalteu
รีเอเจนต์จากซิกม่า Aldrich Co ® ( St . Louis , MO , USA ) .

. .

วัสดุพืชchagalapoli ผลไม้สุก ( A . compressa K . ) ด้วยตนเองที่เก็บเกี่ยวใน
ขนาดเล็กสวน sited ในซาน อังเดร เป็น tuxtla Veracruz ( 18 / 27 เพลง n 95 องศาละติจูด
13 เพลง W เส้นแวงระดับความสูง 300 เมตร ) ประมาณ 12 กก. ผลไม้
เก็บจาก 10 ถึง 20 ต้นๆ เพื่อจับมากที่สุดเท่าที่เป็นไปได้
ความแปรปรวนทางชีวภาพ ผลไม้ที่อุณหภูมิ 4 องศา C จนถึงการวิเคราะห์ .
สตรอเบอร์รี่ ( fragaria vesca )บลูเบอร์รี่ ( แวคซีเนียม myrtillus ) และ
แบล็คเบอร์รี่ ( rubus fructicosus ) จากตลาดท้องถิ่นที่ใช้สำหรับผลการควบคุม
ละลายรวม องค์ประกอบของแอนโธไซยานินและสารต้านอนุมูลอิสระ

ผลเบอร์รี่เหล่านี้เติบโตในรัฐ Jalisco , เม็กซิโก โดย บริษัท ดริสคอล
.
ผลไม้ของ compressa คุช ( chagalapoli ) ที่ผลิตในช่อ
( รูปที่ 1A , B ) botanically ,ผลไม้จัดเป็นดรูป . ผลไม้
ทรงกลม มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.8 ถึง 1.5 ซม. ลึกสีแดง , สี , สีม่วง
ฉ่ำและรสชาติเปรี้ยวเล็กน้อยและเนื้อนุ่ม ( ภาพที่ 1c ) ผลไม้ที่มีเมล็ดแข็งและ
ทรงกลมที่ถูกปกคลุมด้วยชั้นของ
เนื้อหยาบ ( ภาพดี ) เมล็ดพันธุ์แทนประมาณ 38 % ของน้ำหนักสดของผลไม้

2.3 คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของผลไม้

ประมาณ 100 กรัมของผลไม้สดได้ด้วยตนเองกดขอรับ
น้ำผลไม้ที่ใช้กำหนดของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด ( องศาบริกซ์ ) กับ
มือรีแฟรกโตมิเตอร์ ( pal-1 atago , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) pH วัด
ด้วยเครื่องวัด ( มิ 255 ฮันนาเครื่องมือ Woonsocket ริ ,
, USA ) และปริมาณกรด ( TA ) ถูกกำหนดโดยการไทเทรต 0.1 M NaOH ด้วย
( โปรตีน , 2000 ) ค่า TA จะแสดงเป็นกรด tartaric
เทียบเท่า . หาเหล่านี้ทั้งหมดเสร็จ ทั้งสามใบ

2.4 . การทำงานและแร่องค์ประกอบ

ความชื้น , ไนโตรเจน , สารสกัดอีเทอร์ เถ้า และไฟเบอร์ วัดจาก
องศา เซลเซียส ( 2000 ) วิธีการในพริกหยวก / deseeded ตัวอย่างแห้ง . เปอร์เซ็นต์ที่เหลือ
ถือว่าเป็นตัวแทนของคาร์โบไฮเดรต
ตัวประกอบการแปลงสำหรับโปรตีนรวม 6.25 ( n × 6.25 )
เนื้อหาแร่ตั้งใจว่าหลังจาก hclo4 / กรดดินประสิวการย่อยอาหาร ( โจนส์&กรณี , 1990 ) ในการอุปนัยพลาสมาอะตอมคู่

( 3000sc เพอร์กินเอลเมอร์สเปกโทรสโกปีแบบฮ่องกง , , MA , USA ) .

2.5 สารประกอบฟีนอล

ดาวน์โหลด . การสกัด
กรัมหนึ่งในพริกหยวก / deseeded ผลไม้สดตัวอย่างหนักใน 125 ml ขวด
เออร์เลนเมเยอร์และปริมาณ 20 ml 1 % กรดไตรฟลูออโรอะซิติก
( ระดับ ) ในเมทานอลที่ถูกเพิ่มเข้ามาตัวอย่างถูกบดด้วยเครื่องปั่น
คู่มือ ( Bosch จึง Mixx ) และ sonicated ในอ่างอาบน้ำด้วย
( brason รุ่น 2510 ) 30 นาทีและปั่นป่วนใน
เครื่องปั่นแนวนอนที่อุณหภูมิห้อง ( ~ 24 ° C ) 1.5 ชั่วโมงเพื่ออำนวยความสะดวกนำการกู้คืน ,
ตัวอย่างระดับ ( Hettich zentrifugen mod , . สากล
32 ) ที่ 2200 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีและนำออกกาก
เป็นอีกครั้งที่สกัด 2 ครั้ง 15 มิลลิลิตร ผสมเมทานอล : น้ำ ( 10:1:9 กรดอเซ
/ v / v ) 3 supernatants ถูกรวมมาเป็นเล่มสุดท้ายของ 100 ml กับตัวทำละลายที่ใช้ในการสกัด
2 . สารสกัดนี้ถูกเตรียมไว้ทั้งสามใบ มัน
วิเคราะห์ทั้งหมดของฟีนอลและแอนโธไซยานิน และสารต้านอนุมูลอิสระ
.

งานวาง .โพลีฟีนอล ละลายรวม ( TSP )

folin – ciocalteu ( f-c ) วิธีการศึกษาผลละลาย
รวม ( Singleton &รอสซี่ , 1965 ) สั้น ๆ , เป็นส่วนลงตัวของสารก่อน
( 100 μลิตร ) ผสมกับ 125 μ l f-c รีเอเจนต์และอนุญาต
โต้กลับ 6 นาที ; ปฏิกิริยาก็เป็นกลางกับ 1250 μผมอิ่มตัว
Na2CO3 โซลูชั่น ( 19% ) และปรับระดับเสียงสุดท้าย 3 ml
ด้วยน้ำกลั่น ส่วนผสม vortexed และเก็บไว้ในที่มืด
90 นาทีมีการดูดกลืนแสงของตัวอย่างถูกวัดที่ 760 นาโนเมตร กราฟมาตรฐานเป็น
เตรียมกับเพิ่มขึ้นแสดงความเข้มข้นของกรดฟีนอล
เป็นฟังก์ชันนี้

2.5.3 . ปริมาณแอนโธไซยานิน ( TAC )

มีการดูดกลืนแสงของสารสกัดเมทานอลเป็นวัดที่ 520 nm
ในเพอร์กินเอลเมอร์ วัสดุเส้นโค้งมาตรฐานของไซยานิดิน 3 -
o-glucoside ( cy3g ) ถูกเตรียมและ TAC จะแสดงเป็น cy3g
เทียบเท่า ( Salinas , ซาลัส , เอร์นันเดซ . kgm ndez & , รามอส , 2005 ) .

2.5.4 . 2 ) พ่อ– esi-ms วิเคราะห์

2.5.4.1 . แอนโทไซยานิน . 500 มิลลิกรัมของโปรตีนตัวอย่างผสมกับ
50 มิลลิลิตร เมทานอล : น้ำในระดับร้อยละ 80 : 20 ( v / v ) จำนวน sonicated
30 นาทีในการตรวจอัลตร้าซาวด์บาท ( brason แบบ 5510 ) จากนั้น
อนุญาตให้ยืนที่ 20 ° C − 3 ชั่วโมง หลังจากมีไฟฟ้า
ที่ 28 , 000 กรัมต่อ 10 นาทีที่ 5 ° C ( เวลาที่ sorvall rc-5b ) , นำก็หาย
และอาจมีการตกค้างอีก 2 ทีม . สารสกัดรวมอยู่ที่ 35 ° C
ระเหยเอาเมทานอลและ
กำลังละลายใน 20 ml ของน้ำและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C −จนถึงการวิเคราะห์ต่อไป

การแยกวิเคราะห์โดยใช้ HPLC อุปกรณ์ ( Hewlett Packard )
1 , 100 ) ให้กับควอปั๊มหัวฉีดอัตโนมัติ
เครื่องเรย์ไดโอดและสถานีบําบัดข้อมูล แยกเป็น
ความบนควา® ( phenomenex ) กลับเฟส c18 คอลัมน์
( 5 μ M 150 มิลลิเมตร× 4.6 มม. บัตร ) thermostated ที่ 35 องศา ละลาย
ใช้คือ ( ก ) ระดับ 0.1% ในน้ำ และ ( ข ) 100% ไน . การไล่ระดับสี
ใช้คือ Isocratic 10 % B 5 นาทีจาก 10 ถึง 15 % B 5 นาที
Isocratic 15 % B 5 นาทีจาก 15 ถึง 18 % B 5 นาทีจาก 18 ถึง 35 % B
20 นาทีและจาก 35 ถึง 10% เป็นเวลา 20 นาทีในการไหล อัตรา 0.5 ml / min
( garc í a-marino trigueros & , , escribano ประกันตัวเลออง , 2010 )
ตรวจสอบออนไลน์คู่ได้ดำเนินการในการเป็นพ่อ , 520 nm ความยาวคลื่นที่ต้องการ
และ MS ใน API 3200 qtrap ( Applied Biosystems ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี , ,
) พร้อมกับแหล่ง ESI และสามคำไอออนกับดัก
วิเคราะห์มวลที่ถูกควบคุมโดยนักวิเคราะห์ 5.1 มวล
Spectra ได้รับในโหมดอิออนบวก อากาศเกรดศูนย์บริการ
เป็น nebulizer ก๊าซ ( 40 ปอนด์ ) และกังหันแก๊ส ( 600 ° C ) สำหรับตัวทำละลายแห้ง
( 50 psi )