Western blot analysisOvarian tissue

Western blot analysis

Ovarian tissue protein extracts (30 μg) were separated by SDS-PAGE using 13 % (v/v) gels and transferred onto a PVDF membrane. Membranes were blocked with 5 % (v/v) non-fat dry milk overnight at 4 °C and then washed for 10 min with the washing buffer (0.1 % v/v Tween 20, 50 mM Tris/HCl, and 200 mM NaCl; pH 7.6). The membranes were incubated for 2 h with primary antibodies (dilution 1:1,000 in blocking buffer) that specifically recognised the active form of TIMP-2 and (Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas, USA), TIMP-3, (Santa Cruz), and β-actin (Santa Cruz). After primary antibody binding, the membranes were washed three times for 15 min each with TBS-T buffer and incubated for 2 h with HRP-conjugated anti-goat (Abcam, Cambridge, UK) or anti-mouse (Abcam) secondary antibodies diluted 1:5,000 in blocking buffer). The membranes were incubated for 5 min with the ECL detection reagent in the dark and then exposed to X-ray film for 10 min; protein expression was normalized to that of β-actin, which served as an internal control, using the software Alpha Innotech ver. 4.0.0 (San Leandro, CA, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาสารสกัดจากโปรตีนเนื้อเยื่อรังไข่ (30 μg) ได้โดยใช้ 13% (v/v) เจเพ SDS และโอนย้ายไปเมมเบรน PVDF เยื่อหุ้มถูกถู ด้วยน้ำนมแห้งไม่ใช่ไขมัน 5% (v/v) ค้างคืนที่ 4 ° C และล้างแล้ว สำหรับ 10 นาทีกับล้างบัฟเฟอร์ (0.1% v/v Tween 20, ตรี/HCl 50 มม. และ 200 mM NaCl; pH 7.6) สารถูก incubated สำหรับ h 2 กับหลักแอนตี้ (1:1,000 เจือจางในบัฟเฟอร์บล็อก) ที่เฉพาะยังแบบฟอร์มที่ใช้งาน TIMP-2 และ (ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ Inc. เท็กซัส สหรัฐอเมริกา), TIMP-3, (ซานตาครูซ), และβ-แอกติน (ซานตาครูซ) หลังจากแอนติบอดีหลักผูก สารถูกล้างสามครั้งสำหรับ 15 นาทีแต่ละกับ TBS T บัฟเฟอร์ แล้ว incubated สำหรับ h 2 HRP กลวงป้องกันแพะ (Abcam เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) หรือ 1:5,000 แตกออกแอนตี้รองเมาส์ป้องกัน (Abcam) ในบล็อกบัฟเฟอร์) การสาร incubated ใน 5 นาทีด้วยรีเอเจนต์ตรวจสอบ ECL ในมืดแล้ว สัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์สำหรับ 10 นาที นิพจน์ของโปรตีนได้ตามปกติกับβ-แอกติน ซึ่งเป็นตัวควบคุมภายใน ใช้ไม่ Innotech อัลฟาของซอฟต์แวร์ 4.0.0 (Leandro ซาน CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ดวงตะวันสารสกัดจากโปรตีนเนื้อเยื่อรังไข่ (30 ไมโครกรัม) ถูกแยกออกจากระบบ SDS-PAGE ใช้ 13% (v / v) เจลและโอนไปยังเมมเบรน PVDF เยื่อถูกบล็อก 5% (v / v) ที่ไม่มีไขมันนมแห้งค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสและล้างแล้วเป็นเวลา 10 นาทีกับบัฟเฟอร์ซักผ้า (0.1% ปริมาตร / ปริมาตร Tween 20, 50 มิลลิทริส / HCl และ 200 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ ; pH 7.6) เยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับแอนติบอดีหลัก (เจือจาง 1: 1,000 ในการปิดกั้นกันชน) ที่ได้รับการยอมรับโดยเฉพาะรูปแบบการใช้งานของ TIMP-2 (ซานตาครูซอิงค์เทคโนโลยีชีวภาพ, เท็กซัสสหรัฐอเมริกา) TIMP-3 (Santa Cruz) และβ-โปรตีน (Santa Cruz) หลังจากแอนติบอดีหลักที่มีผลผูกพันเยื่อถูกล้างสามครั้งเป็นเวลา 15 นาทีแต่ละคนมีบัฟเฟอร์ TBS-T และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับ HRP-conjugated ป้องกันแพะ (Abcam เคมบริดจ์สหราชอาณาจักร) หรือต่อต้านเมาส์ (Abcam) แอนติบอดีรองเจือจาง 1 : 5000 ในการปิดกั้นกันชน) เยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีกับการตรวจหาสาร ECL ในที่มืดและสัมผัสแล้วในภาพยนตร์เรื่อง X-ray เป็นเวลา 10 นาที; การแสดงออกของโปรตีนได้ปกติกับที่ของβ-โปรตีนซึ่งทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมภายในโดยใช้ซอฟแวร์อัลฟา Innotech เวอร์ชั่น 4.0.0 (ซานลีอันโดร, CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot การวิเคราะห์

รังไข่เนื้อเยื่อโปรตีนสกัด ( μ 30 กรัม ) แยกถูกใช้ 13 % ( v / v ) เจลและโอนไปยัง PVDF เมมเบรน เยื่อที่ถูกบล็อกด้วย 5% ( v / v ) ไม่อ้วนนมแห้งค้างคืนที่ 4 ° C เป็นเวลา 10 นาทีแล้วล้างด้วยล้างบัฟเฟอร์ ( 0.1 % v / v Tween 20 , 50 มม. โดย / HCl และเกลือ ; 200 มม. pH 7.6 )เยื่อถูกบ่ม 2 ชั่วโมงกับแอนติบอดีประถมศึกษา ( เจือจาง 000 ในบล็อกบัฟเฟอร์ ) ที่ได้รับการยอมรับโดยเฉพาะฟอร์มที่ใช้งานของ timp-2 ( Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ Inc . , Texas , สหรัฐอเมริกา ) , timp-3 ( Santa Cruz ) , และบีตา - actin ( Santa Cruz ) ตามหลัก โดยผูกเยื่อหุ้มอยู่ซักสามครั้ง 15 นาทีละ tbs-t บัฟเฟอร์ และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับ HRP และป้องกันแพะ ( ABCAM , เคมบริดจ์ , UK ) หรือป้องกันเมาส์ ( ABCAM ) แอนติบอดีมัธยมเจือจาง 1:5000 ในบล็อกบัฟเฟอร์ ) เยื่อถูกบ่มนาน 5 นาทีกับการทดสอบการตรวจหาสารเคมีในที่มืดแล้วตากฟิล์มเอกซเรย์สำหรับ 10 นาที ;การแสดงออกของโปรตีนเป็นปกติว่าบีตา - actin ซึ่งทำหน้าที่เป็นระบบควบคุมภายใน การใช้ซอฟต์แวร์อัลฟา Innotech Ver . การ ( San Leandro , CA , USA )