Western Blot AnalysisTestes were ho

Western Blot Analysis
Testes were homogenized as previously described [22]. Protein concentration was determined using bicinchonic acid method with BSA as a standard. Homogenates (30–50 μg) were resolved on 4–20% Tris gels and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Membranes were blocked for 1 hour at room temperature in PBS (pH 7.4) containing 0.1% Tween-20 and 5% nonfat dry milk, and then probed overnight with anti-P450scc antibody at 1:6,000 dilution, anti-StAR antibody at 1:3,000 dilution, anti-gp91phox (a catalytic subunit of reactive oxygen species-generating enzyme NADPH oxidase, [23]) antibody at 1:1,000 dilution, anti-GPx-1 (an antioxidant enzyme, [24]) antibody at 1:1,000 dilution, and anti-4-HNE (a marker of oxidative stress, [25]), antibody at 1:5,000 dilution. Signals were standardized to β-actin (1:7,000 dilution) [26]. Bands were detected by horseradish peroxidase conjugated anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies and quantified using NIH Image 1.29 (National Institutes of Health). To verify that β-actin expression was not affected by SCD, the density of a set of samples was standardized per total proteins (Ponceau S staining). Ratios did not differ from those obtained using β-actin for standardization (data not shown).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาลิ้มลองได้ homogenized เป็นกลุ่มอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [22] ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดด้วยวิธีกรด bicinchonic บีเอสเอเป็นมาตรฐาน Homogenates (30-50 μg) ถูกแก้ไขบนตรี 4-20% และโอนย้ายไปเข้า difluoride polyvinylidene เข้าบล็อก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องใน PBS (pH 7.4) มี 0.1% Tween-20 และ 5% nonfat แห้งนม และพิสูจน์แล้ว ค้างคืน ด้วยแอนติบอดีต้าน P450scc ที่เจือจาง 1:6,000 แอนติบอดีป้องกันดาวที่เจือจาง 1:3,000, anti-gp91phox (เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาย่อยของออกซิเจนปฏิกิริยาชนิดสร้างเอนไซม์ NADPH oxidase, [23]) แอนติบอดีที่เจือจาง 1:1,000, anti-GPx-1 (เป็นสารต้านอนุมูลอิสระเอนไซม์, [24]) แอนติบอดีที่เจือจาง 1:1,000 ป้องกัน-4-HNE (เครื่องหมายของความเครียด oxidative, [25]), และแอนติบอดีที่เจือจาง 1:5,000 สัญญาณมีมาตรฐานต้องβ-แอกติน (1:7, 000 เจือจาง) [26] วงพบ โดย horseradish peroxidase กลวงเมาส์ต่อต้าน หรือป้องกันกระต่ายรองแอนตี้ และ quantified ใช้ NIH รูป 1.29 (สถาบันแห่งชาติสุขภาพ) เพื่อตรวจสอบว่า แอกตินβนิพจน์ไม่ได้รับผลจาก SCD ความหนาแน่นของชุดอย่างมีมาตรฐานต่อโปรตีนรวม (Ponceau S ย้อมสี) อัตราส่วนได้ไม่แตกต่างจากผู้รับใช้β-แอกตินมาตรฐาน (ข้อมูลไม่แสดง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อัณฑะการวิเคราะห์
blot ตะวันตกโฮโมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 22 ] ความเข้มข้นของโปรตีน จึงตัดสินใจใช้วิธีกรด bicinchonic กับ BSA เป็นมาตรฐาน homogenates ( 30 – 50 μ g ) ถูกแก้ไขบน 4 – 20 % ทั้งนี้ เจลและโอนไปยังีนไดฟลูออไรด์เยื่อ เยื่อที่ถูกบล็อกเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้องใน PBS ( pH 7.4 ) ประกอบด้วย 0tween-20 1 % และ 5 % นมแห้งไม่มีไขมันและจากนั้นตรวจสอบค้างคืนกับ anti-p450scc แอนติบอดีที่ 1:6000 เจือจางป้องกันดาวแอนติบอดีที่ 1:3000 เจือจาง anti-gp91phox ( แลมดาของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยาการสร้างเอนไซม์ออกซิเดส nadph [ 23 ] ) แอนติบอดีที่ 000 เจือจาง anti-gpx-1 ( สารต้านอนุมูลอิสระเอนไซม์ [ 24 ] ) แอนติบอดีที่ 000 เจือจาง และ anti-4-hne ( เครื่องหมายของความเครียดออกซิเดชัน[ 25 ] ) , แอนติบอดีที่ 1:5000 เจือจาง สัญญาณที่เป็นมาตรฐานเพื่อบีตา - actin ( 1:7000 เจือจาง ) [ 26 ] วงดนตรีที่ถูกตรวจพบโดยเอนไซม์ conjugated มะรุมป้องกันเมาส์หรือป้องกันกระต่ายระดับแอนติบอดีและปริมาณการใช้ยาภาพ 1.29 ( สถาบันสุขภาพแห่งชาติ ) เพื่อตรวจสอบว่าบีตา - การแสดงออกแอกทิน ได้รับผลกระทบ โดย SCD ,ความหนาแน่นของชุดของตัวอย่างเป็นมาตรฐานต่อโปรตีนทั้งหมด ( ใน s Staining ) อัตราส่วนไม่แตกต่างจากผู้ที่ได้ใช้บีตา - actin มาตรฐาน ( ข้อมูลไม่แสดง )