Each isolate was cultured in cultur

Each isolate was cultured in culturemedium at 37 ◦C for 3 d and
then centrifuged to collect the pellets, which were washed with PBS
(phosphate-buffered saline). Collected bacterium was lysed by incubating
in 400 μL of PBS and 100μL of 10% sodium dodecyl sulfate
at 55 ◦C for 5min. The proteinwas then precipitated in phenol chloroformsolution.
Each extracted DNAwas used as template DNA for
PCR.
More than 1500 bp of the 16S rDNA were amplified fromall bacteria
species using 27f and 1525r primers (Lane 1991). The PCR reaction
mixture comprised 10 μL of template DNA (diluted 1:10),
10 μL of 10 × PCR buffer, 10 μL of deoxynucleoside triphosphate
(2.5 mM each), 20 μL of primer pairs (5 μM), 0.4 μL of Taq polymerase
(5 U/μL, Takara Shuzo, Japan), and 49.6 μL of distilled water
to yield a final volume of 100 μL. The PCR conditions were an
initial step of 94 ◦C for 1 min, followed by amplification using the
following thermal profile: 30 cycles of 94 ◦C for 1 min, 53◦C for
1min, and72◦C for 1.5 min. Finally, the mixturewas heated at 72 ◦C
for 2 min and subsequently cooled to 4 ◦C until use.
To check the specific band of the 16S rDNA gene, aliquots of
PCR products were run for agarose gel electrophoresis and photographed
under UV light. The remaining PCR product of each
sample was purified for 16S rDNA-sequencing by a DNA purification
kit (Bio 101 Inc., Vista, Calif., U.S.A.).
The 16S rDNA was sequenced using the sequencing primers
(Table 1) by a Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied
Biosystems, Foster City, Calif., U.S.A.) and an Applied Biosystems
model 3100 automated DNA sequencing system (Applied Biosystems).
The 16S rDNA sequences of isolates were compared with
those available from the GenBank databases using the gapped
BLAST program accessed through the Natl. Center for Biotechnology
Information server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Identification of bacteria to the species levelwas defined as a 16S
rDNA-sequence similarity of ≥ 99% to that of the prototype strain
sequence in GenBank; identification at the genus level was defined
as a 16S rDNA-sequence similarity of ≥ 99% to that of the prototype
strain sequence in GenBank. The sequence alignments and comparison
were done with the multi-sequence alignment program
ClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html).
Enzyme production
Each bacterium was refreshed by aerobic incubation overnight
in an enzyme production medium at 37 ◦C. By using this culture
as a starter, the bacterium could be aerobically grown in the same
medium at 37 ◦C for 48 h. The broth was centrifuged at 10000 rpm
for 5 min. The supernatant was ultrafiltered with a 3-kDa nominal
molecular weight cutoff filter unit (Millipore,Mass., U.S.A.) and
used as bacterial concentrated crude enzyme.
Digestion and allergenic determination of gliadin
Each mixture was composed of 400 μL of 3%gliadin (fromwheat
gluten, ICN Biomedicals, Aurora, Ohio, U.S.A.) in 0.1 M Tris-HCl
containing 4 M urea (Nacalai Tesque), pH 8.6 (Watanabe and others
2001), and 2.2 unit/mL of bacterial concentrated crude enzyme
of each of 7 isolates, SB3, SB4, SB5, DB, SR, SP1, and SP2. The enzyme
was added separately. Thesemixtureswere incubated at 37 ◦C
for 1 h, and the reaction was stopped by boiling for 5 min. The
mixtures were then centrifuged at 10000 rpm for 5 min. The supernatants
were used as digested samples. The digested fragments and
allergenicity of gliadin were detected by 12.5% SDS-PAGE and immunoblotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แต่ละแยกมีอ่างใน culturemedium ที่ ◦C 37 สำหรับ 3 d และcentrifuged แล้ว เก็บขี้ ซึ่งถูกล้าง ด้วย PBS(buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ) แบคทีเรียที่รวบรวมได้ lysed โดย incubatingใน 400 μL PBS และ 100μL ของ dodecyl 10% โซเดียมซัลเฟตที่ ◦C 55 สำหรับ 5 นาที Proteinwas ตกตะกอนในวาง chloroformsolution แล้วแต่ละแยกใช้เป็นดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับ DNAwasPCRมากกว่า 1500 bp 16S rDNA ถูกแบคทีเรีย fromall เอาต์พันธุ์ที่ใช้ไพรเมอร์ 27f และ 1525r (1991 เลน) ปฏิกิริยา PCRส่วนผสมประกอบด้วย 10 μL ของแม่แบบดีเอ็นเอ (แตกออก 1:10),ΜL 10 10 × PCR บัฟเฟอร์ μL 10 ของ deoxynucleoside โนซีนไตรฟอสเฟต(2.5 mM แต่ละ), 20 μL คู่รองพื้น (5 μM), μL 0.4 ของพอลิเมอเรส Taq(5 U μL, Takara Shuzo ญี่ปุ่น), และ μL 49.6 ของน้ำกลั่นเพื่อหาปริมาตรสุดท้ายของ 100 μL เงื่อนไข PCR มีการขั้นตอนแรกของ ◦C 94 ใน 1 นาที ตาม ด้วยการใช้ขยายตัวต่อค่าความร้อน: 94 ◦C รอบ 30 ใน 1 นาที 53◦C สำหรับ1 นาที and72◦C สำหรับ 1.5 นาที สุดท้าย การ mixturewas ความร้อนที่ 72 ◦Cนาทีที่ 2 และต่อระบายความร้อนด้วยการ 4 ◦C จนใช้การตรวจสอบยีน 16S rDNA, aliquots ของวงการผลิตภัณฑ์ PCR ถูกใน agarose เจ electrophoresis และถ่ายภาพภายใต้แสง UV ผลิตภัณฑ์ PCR ที่เหลือของแต่ละตัวอย่างที่บริสุทธิ์สำหรับ 16S rDNA ลำดับที่ โดยฟอกดีเอ็นเอชุด (ไบโอ 101 Inc., Vista รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา)การ 16S rDNA ถูกเรียงลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ของลำดับ(ตารางที่ 1) โดยมีเทอร์มิเนเตอร์ขนาดใหญ่ย้อมรอบลำดับชุด (ประยุกต์Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) และการ Biosystems ใช้รุ่น 3100 อัตโนมัติระบบลำดับดีเอ็นเอ (Biosystems ใช้)ลำดับ rDNA 16S ของแยกถูกเปรียบเทียบกับพร้อมใช้งานจากฐานข้อมูลของ GenBank ที่ใช้ที่ gappedโปรแกรมระเบิดเข้าถึงผ่านทางศูนย์ Natl. ของเทคโนโลยีชีวภาพข้อมูลเซิร์ฟเวอร์ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)รหัสของแบคทีเรียการ levelwas พันธุ์ที่กำหนดเป็นการ 16Sเฉพาะลำดับ rDNA ≥ 99% ของสายพันธุ์ต้นแบบลำดับใน GenBank มีกำหนดรหัสระดับสกุลเป็นการ 16S rDNA ลำดับคล้ายคลึง≥ 99% ของต้นแบบสายพันธุ์ลำดับใน GenBank จัดแนวลำดับและเปรียบเทียบทำกับโปรแกรมลำดับหลายตำแหน่งClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)ผลิตเอนไซม์แบคทีเรียแต่ละถูกรีเฟรช โดยแอโรบิกบ่มข้ามคืนในการสื่อผลิตเอนไซม์ที่ 37 ◦C โดยวัฒนธรรมนี้เป็นการเริ่มต้น แบคทีเรียสามารถเป็น aerobically โตเดียวกลางที่ ◦C 37 สำหรับ 48 h ซุปถูก centrifuged ที่ 10000 rpmใน 5 นาที Supernatant ถูก ultrafiltered กับ nominal 3-kDaน้ำหนักโมเลกุลหน่วยกรองตัดยอด (มาก มวล., สหรัฐอเมริกา) และใช้เป็นแบคทีเรียเอนไซม์ดิบเข้มข้นย่อยอาหารและ gliadin กำหนดแพ้แต่ละส่วนผสมประกอบด้วย μL 400 ของ gliadin 3% (fromwheatตัง ICN Biomedicals ออโรรา รัฐโอไฮโอ สหรัฐอเมริกา) ในตรี-HCl 0.1 Mประกอบด้วย 4 M ยูเรีย (Nacalai Tesque), pH 8.6 (เบะและอื่น ๆ2001), และเอนไซม์ดิบเข้มข้นหน่วย 2.2 mL ของแบคทีเรียแต่ละ อัน 7 แยก SB3, SB4, SB5, DB, SR, SP1, SP2 เอนไซม์นี้มีเพิ่มต่างหาก Thesemixtureswere incubated ที่ 37 ◦Cสำหรับ 1 h และปฏิกิริยาถูกหยุด โดยต้มสำหรับคืนนี้ส่วนผสมมี centrifuged แล้วที่ 10000 rpm สำหรับ 5 นาที Supernatantsใช้เป็นตัวอย่างที่ต้องการ ชิ้นส่วน digested และallergenicity gliadin พบทาง 12.5% SDS-เพ immunoblotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แยกแต่ละเลี้ยงใน culturemedium ที่ 37 ◦Cเป็นเวลา 3
วันและจากนั้นหมุนเหวี่ยงในการเก็บรวบรวมเม็ดซึ่งถูกล้างด้วยพีบีเอส
(น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์) แบคทีเรียที่เก็บรวบรวมได้ lysed
โดยฟักใน400 ไมโครลิตรของพีบีเอสและ100μLของโซเดียม 10%
โดเดซิลซัลเฟตที่55 ◦Cสำหรับ 5 นาที proteinwas ตกตะกอนแล้วใน chloroformsolution ฟีนอล.
DNAwas สกัดแต่ละคนนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับ DNA
PCR.
มากกว่า 1,500 bp ของ 16S rDNA ถูกขยาย fromall
แบคทีเรียสายพันธุ์27 และใช้ไพรเมอร์ 1525r (ถนน 1991) ปฏิกิริยา PCR
ส่วนผสมประกอบด้วย 10 ไมโครลิตรของดีเอ็นเอแม่แบบ (ปรับลด 01:10)
10 ไมโครลิตร 10 ×บัฟเฟอร์ PCR 10 ไมโครลิตรของ triphosphate deoxynucleoside
(2.5 มิลลิแต่ละคน) 20 ไมโครลิตรของคู่ไพรเมอร์ (5 ไมครอน) 0.4 ไมโครลิตรของ Taq โพลิเมอร์
(5 U / ไมโครลิตร, Takara Shuzo ญี่ปุ่น) และ 49.6
ไมโครลิตรของน้ำกลั่นที่จะให้ผลผลิตที่มีปริมาณสุดท้ายของ100 ไมโครลิตร เงื่อนไข PCR
เขาเป็นขั้นตอนเริ่มต้นของ94 ◦Cเป็นเวลา 1
นาทีตามด้วยการขยายการใช้รายละเอียดดังต่อไปนี้ความร้อน: 30 รอบ 94 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที, 53◦Cสำหรับ
1min, and72◦C 1.5 นาที ในที่สุด mixturewas ความร้อนที่ 72
◦Cเป็นเวลา2 นาทีและต่อมาเย็นถึง 4 ◦Cจนถึงการใช้งาน.
ในการตรวจสอบวงเฉพาะของยีน 16S rDNA, aliquots
ของผลิตภัณฑ์PCR ถูกใช้สำหรับข่าวคราว agarose
และถ่ายภาพภายใต้แสงยูวี ผลิตภัณฑ์ PCR
ที่เหลือของแต่ละตัวอย่างบริสุทธิ์สำหรับ16S
rDNA-ลำดับโดยบริสุทธิ์ดีเอ็นเอชุด(ไบโอ 101 อิงค์, Vista, Calif. USA).
16S rDNA ได้รับการจัดลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ลำดับ
(ตารางที่ 1) โดยย้อมบิ๊ก เทอร์มิชุดลำดับวงจร (Applied
Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้รัฐแคลิฟอร์เนีย., สหรัฐอเมริกา) และ Applied Biosystems
รุ่น 3100 ระบบลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติ (Applied Biosystems).
16S rDNA
ลำดับของสายพันธุ์ที่ถูกเมื่อเทียบกับที่มีอยู่จากฐานข้อมูลGenBank ใช้ gapped
ระเบิด เข้าถึงได้ผ่านทางโปรแกรม Natl ศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพเซิร์ฟเวอร์สารสนเทศ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). บัตรประจำตัวของแบคทีเรียสายพันธุ์ levelwas กำหนดเป็น 16S คล้ายคลึงกัน rDNA ลำดับของ≥ 99% กับที่ของสายพันธุ์ต้นแบบลำดับในGenBank; บัตรประจำตัวที่ระดับประเภทถูกกำหนดเป็น 16S rDNA คล้ายคลึงกันลำดับของ≥ 99% กับที่ของต้นแบบลำดับสายพันธุ์ในGenBank จัดแนวลำดับและการเปรียบเทียบได้ทำกับโปรแกรมการจัดตำแหน่งหลายลำดับClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html). การผลิตเอนไซม์แบคทีเรียแต่ละคนได้รับการฟื้นฟูโดยการบ่มแอโรบิกในชั่วข้ามคืนในเอนไซม์กลางการผลิตที่ 37 ◦C โดยใช้วัฒนธรรมนี้เป็นเริ่มต้นแบคทีเรียที่อาจจะเติบโตใน aerobically เดียวกันสื่อที่37 ◦Cเป็นเวลา 48 ชั่วโมง น้ำซุปที่ได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา5 นาที สารละลายถูก ultrafiltered กับ 3 กิโลดาลตันเล็กน้อยน้ำหนักตัดหน่วยกรองโมเลกุล(ค, Mass., USA) และใช้เป็นเชื้อแบคทีเรียเอนไซม์เข้มข้น. การย่อยอาหารและความมุ่งมั่นเป็นภูมิแพ้ของ gliadin ส่วนผสมแต่ละประกอบด้วย 400 ไมโครลิตร 3% gliadin (fromwheat ตัง ICN Biomedicals แสงเงินแสงทองโอไฮโอสหรัฐอเมริกา) ใน 0.1 M Tris-HCl มี 4 M ยูเรีย (Nacalai Tesque), พีเอช 8.6 (วาตานาเบะและอื่น ๆ2001) และ 2.2 หน่วย / มิลลิลิตรเอนไซม์ของแบคทีเรียที่มีความเข้มข้นของแต่ละ7 ไอโซเลท , SB3, SB4, SB5, DB, อาร์, SP1 และ SP2 เอนไซม์ถูกบันทึกแยกต่างหาก Thesemixtureswere บ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cเป็นเวลา1 ชั่วโมงและปฏิกิริยาก็หยุดโดยการต้มเป็นเวลา 5 นาที ผสมถูกปั่นแล้วที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที supernatants ถูกนำมาใช้เป็นตัวอย่างย่อย ชิ้นส่วนย่อยและภูมิแพ้ของ gliadin ถูกตรวจพบโดย 12.5% ​​SDS-PAGE และ immunoblotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แต่ละแยกเลี้ยงใน culturemedium 37 ◦ 3 D และ C
แล้วระดับเก็บเม็ดที่ถูกล้างด้วย pbs
( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ) ซึ่งเป็น lysed เก็บโดยการแช่
400 μ L ของ PBS และ 100 μผม 10% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
55 ◦ C เป็นเวลา 5 นาที โดย proteinwas แล้วตกตะกอนในฟีนอล chloroformsolution .
แต่ละสกัดใช้เป็นแม่แบบสำหรับ
dnawas DNA PCR
มากกว่า 1 , 500 BP ของ 16S rDNA ได้ขยายจำนวนแบคทีเรียชนิดที่ใช้ 27f 1525r
และไพรเมอร์ ( เลน 1991 ) การตรวจปฏิกิริยา
ส่วนผสมประกอบด้วย 10 μ L ของดีเอ็นเอแม่แบบ ( เจือจาง 1 : 10 )
10 μชั้น 10 เฟอร์ PCR × 10
μ l deoxynucleoside ไตรฟอสเฟต ( 2.5 มม. แต่ละ ) , 20 μ L ของไพรเมอร์คู่ ( 5 μ M ) , 0.4 μ L ของแท็กการ
5 U / μผม ทาคาระ ชูโซะ ญี่ปุ่น ) และ 49.6 μผมน้ำกลั่น
ผลผลิต ปริมาณ 100 ลิตร เงื่อนไขสุดท้ายของμ ) เป็นขั้นตอนแรกของ◦
94 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที ตามด้วยการขยายการใช้
ต่อโปรไฟล์ความร้อน : 30 รอบ ◦ 94 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 53 ◦ C
เสีย and72 ◦เป็นเวลา 1.5 นาที ในที่สุด mixturewas อุ่นที่ 72 ◦ C
2 นาทีต่อมาเย็น 4 ◦ C จนกระทั่งใช้ .
ตรวจสอบวงดนตรีที่เฉพาะเจาะจงของ 16S rDNA ยีนเฉยๆของ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกเรียกใช้เจลอิเลคโตรโฟรีซีสและถ่ายภาพ
ภายใต้แสงยูวี ที่เหลือจากผลิตภัณฑ์ของแต่ละ
ตัวอย่างบริสุทธิ์สำหรับ 16S rDNA จัดลำดับโดยดีเอ็นเอบริสุทธิ์
Kit ( ไบโอ 101 อิงค์ , Vista , รัฐแคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา )
16S rDNA เป็นลำดับการจัดลำดับดีเอ็นเอ
( ตารางที่ 1 ) โดยการย้อมชุด Terminator รอบใหญ่ ( ใช้
Biosystems ฟอสเตอร์ เมืองนิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา) และการประยุกต์ Biosystems
รุ่น 3100 ระบบจัดลำดับดีเอ็นเอแบบอัตโนมัติ ( Applied Biosystems )
ลำดับ 16S rDNA ของไอโซเลทเมื่อเทียบกับขนาด
ที่พร้อมใช้งานจากฐานข้อมูลโดยใช้โปรแกรมการเข้าถึงผ่านทางช่อง
ระเบิด NATL . ศูนย์บริการข้อมูลชีวภาพ
( http : / / www.ncbi . nlm . NIH . gov ) .
การจำแนกชนิดของแบคทีเรียชนิดรองลงมาคือกำหนดเป็น (
ความเหมือนของลำดับด้วย≥ 99% ของต้นแบบสายพันธุ์
ลำดับในขนาด ; การจำแนกในระดับจีนัสได้นิยาม
เป็น 16S rDNA ความเหมือนของลำดับ≥ 99% ของต้นแบบ
ความเครียดลำดับบริเวณ ลำดับการเปรียบเทียบ
เสร็จหลายลำดับการเรียงโปรแกรม
clustalw ( http : / / clustalw ddbj Nig . . . ac.jp / top-j.html ) .

การผลิตเอนไซม์แต่ละสามารถถูกฟื้นฟูโดยแอโรบิคบ่มค้างคืน
ในการผลิตเอนไซม์อาหารที่ 37 ◦โดยใช้วัฒนธรรม
เป็นเริ่มต้น , แบคทีเรียสามารถเติบโตในระดับเดียวกัน aerobically
37 ◦เป็นเวลา 48 ชั่วโมง มันเป็นระดับที่ความเร็วรอบ 10 , 000 รอบ
5 นาทีนำเป็น ultrafiltered กับ 3-kda ปกติ
ตัวกรองโมเลกุลหน่วย ( มิลลิ , มวล . , USA ) และ