All the inoculated solid media, aft

All the inoculated solid media, after 72 h of
aerobically cultivation at 25 ºC showed single,
morphologically well-formed colonies. Isolated
representatives of the dominant colonies were spread
on plates containing WWM, MLM and B4 solid media.
The plates were aerobically incubated at 25 ºC for 30 d
and checked periodically for the presence or absence
of crystals using optical microscopy. Isolated
representatives of the dominant colony morphologies
with carbonate-forming capacity in B4 medium
(seventeen major colony types) were selected and
purified, by restreaking them twice. All the experiments
were carried in triplicate. For the study of the carbonate
precipitation, all the selected isolated (major colony
types) were surface-inoculated onto B4 solid medium
and incubated aerobically at 25 ºC. Thirty days after
inoculation, precipitates were removed by cutting out
pieces of the media, which were placed in boiling water
to dissolve the agar. The sediments were re-suspended
and washed in distilled water to free of impurities. The
washed crystals were finally air-dried at 37 ºC. Using
this methodology, the morphology of crystals was not
altered, as observed by optical microscopy both before
and after their recovery. A control consisting of
uninoculated culture media and media inoculated with
autoclaved cells (dead cells) were included in all
experiments.
All the isolates (with crystal-forming capacity)
were taxonomically identified by analyzing the partial
sequence of the gene encoding 16S rRNA. Primers fD1
and rD1 (Weisburg et al., 1991) were synthesized by
Sigma Genosis (UK) and used to amplify nearly the full
length of the 16S rRNA gene. Fresh cultured colonies
of each strain were lysed by the addition of 20 ul of a
mixture of NaOH (0.05 M)-SDS (0.25 %, w/v), which
was then boiled for 15 min. The lysates were adjusted
to 200 ul with sterile water and centrifuged at 2500g for
5 min in a table-top centrifuge. The cleared lysates (4
ul) were used as a template for amplification. PCR was
carried out by adding the following to the lysates:
1xPCR Gold buffer (Applied Biosystems, Germany);
1.5 mM MgCl2
(Applied Biosystems, Germany); 200
uM dNTPs (Roche Molecular Biochemicals, Germany);
20 pmol of each primer; and 1 U of Ampli-Tag Gold
polymerase (Applied Biosystems, Germany). The final
volume of the reaction tubes was adjusted to 50 ul.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทั้งหมด inoculated แข็งสื่อ หลัง h 72 ของ
aerobically ปลูกที่ 25 ºC พบเดียว,
อาณานิคม morphologically ถูกต้อง แยก
ผู้แทนอาณานิคมหลักถูกแพร่กระจาย
บนแผ่นที่ประกอบด้วย WWM, MLM และ B4 แข็งสื่อ
แผ่นมี aerobically incubated ที่ 25 ºC สำหรับ 30 d
และตรวจสอบเป็นระยะ ๆ สำหรับสถานะการขาดงาน
ของผลึกที่ใช้ microscopy แสง แยก
ตัวแทนของ morphologies โคโลนี่หลัก
กับคาร์บอเนตขึ้นรูปกำลังการผลิตในกลาง B4
(17 โคโลนี่หลักชนิด) ได้เลือก และ
บริสุทธิ์ โดย restreaking สองครั้ง ทดลองทั้งหมด
ได้ดำเนินการใน triplicate สำหรับการศึกษาของคาร์บอเนต
ฝน แยกต่างหากที่เลือกทั้งหมด (โคโลนี่หลัก
ชนิด) มี inoculated ผิวบนกลางทึบ B4
และ incubated aerobically ที่ 25 ºC วันที่สามสิบหลังจาก
inoculation, precipitates ถูกเอาออก โดยตัดออก
ชิ้นสื่อ ซึ่งถูกเก็บไว้ในน้ำเดือด
การละลาย agar ตะกอนถูกหยุดชั่วคราวอีกครั้ง
และล้างในน้ำกลั่นฟรีของสิ่งสกปรก ใน
ผลึกหินถูกสุด air-dried ที่ 37 ºC ใช้
วิธีนี้ สัณฐานวิทยาของผลึกไม่
เปลี่ยนแปลง เป็นที่สังเกต โดยแสง microscopy ทั้งก่อน
และการกู้คืน ตัวควบคุมที่ประกอบด้วย
uninoculated สื่อวัฒนธรรมและสื่อ inoculated กับ
autoclaved เซลล์ (เซลล์ตาย) รวมอยู่ใน
ทดลอง.
ทั้งหมดแยกได้ (ด้วยคริสตัลรูปกำลัง)
taxonomically ระบุ โดยวิเคราะห์บางส่วน
ลำดับของยีน 16S rRNA ในการเข้ารหัส ไพรเมอร์ fD1
และ rD1 (Weisburg et al., 1991) ได้สังเคราะห์โดย
ซิก Genosis (UK) และใช้ขยายเกือบเต็ม
จำนวน 16S rRNA ยีน สดอ่างอาณานิคม
ของต้องใช้ละได้ lysed ด้านนอก 20 ul ของการ
ผสม NaOH (0.05 M) -SDS (0.25%, w/v), ซึ่ง
ถูกต้มแล้วใน 15 นาที Lysates ถูกปรับปรุง
การ ul 200 กระบอกน้ำ และ centrifuged ที่ 2500g สำหรับ
5 นาทีในเครื่องหมุนเหวี่ยงตารางด้านบน Lysates ล้าง (4
ul) ใช้เป็นแม่แบบสำหรับการขยายการ PCR ถูก
จำหน่ายออก โดยการเพิ่มต่อไปนี้ lysates:
1xPCR ทองกันชน (ใช้ Biosystems เยอรมนี);
1.5 มม. MgCl2
(ใช้ Biosystems เยอรมนี), 200
อุ่ม dNTPs (Roche โมเลกุล Biochemicals เยอรมนี);
pmol 20 แต่ละพื้น และ 1 U ของแท็ก Ampli ทอง
พอลิเมอเรส (ใช้ Biosystems เยอรมนี) สุดท้าย
มีการปรับปรุงปริมาณของหลอดปฏิกิริยาไป 50 ul

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทั้งหมดจากสื่อที่เป็นของแข็งหลังจาก 72 ชั่วโมงของการ aerobically
ที่ 25 º C พบเดียว
จากดีก่อตั้งอาณานิคม ตัวแทนแยก

ของอาณานิคมเด่นได้แก่ กระจายบนจานที่มี wwm MLM และสื่อที่เป็นของแข็ง B4 .
แผ่นถูก aerobically บ่มที่อุณหภูมิ 25 º C 30 D
และตรวจสอบเป็นระยะ ๆสำหรับการแสดงตนหรือขาด
ของผลึกโดยใช้แสงกล้องจุลทรรศน์ .ตัวแทนของอาณานิคมแยก

มีรูปลักษณะเด่นความจุปานกลาง B4
คาร์บอเนต ( 17 สาขาอาณานิคมประเภท ) ถูกเลือกและ
บริสุทธิ์ โดย restreaking พวกเขาสองครั้ง ทุกการทดลอง
ครั้งนี้ทั้งสามใบ สำหรับการศึกษาของคาร์บอเนต
ตกตะกอนทั้งหมดเลือกแยก ( ประเภทอาณานิคม
สาขา ) พบเชื้อบนพื้นผิวของแข็ง B4
ขนาดกลางโดย aerobically 25 º C 30 วันหลังจากที่
เชื้อตะกอนถูกเอาออกโดยการตัดออก
ชิ้นของสื่อซึ่งอยู่ในน้ำเดือด
ละลายวุ้น ตะกอนแขวนลอยได้อีกครั้ง
และล้างในน้ำกลั่นฟรีของสิ่งสกปรก
ล้างผลึกทำให้อากาศแห้งที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส โดยใช้º
วิธีการนี้ โครงสร้างของผลึกไม่
เปลี่ยนไปเท่าที่สังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงทั้งก่อน
และหลังจากการกู้คืนของพวกเขา . ควบคุมการประกอบวัฒนธรรมสื่อ

ใส่สังเคราะห์เซลล์ ( เซลล์ตาย ) ถูกรวมอยู่ในการทดลองทั้งหมด
.
ทุกสายพันธุ์ ( มีรูปผลึก ( ความจุ )
taxonomically ระบุโดยการวิเคราะห์ลำดับของยีน 16S rRNA บางส่วน
การเข้ารหัส ไพรเมอร์เพื่อการวิเคราะห์ และ rd1
( weisburg et al . ,1991 ) ถูกสังเคราะห์โดย
Sigma genosis ( UK ) และใช้ในการขยายเกือบเต็ม
ความยาวของ 16S rRNA ยีน สดสูตรของแต่ละสายพันธุ์มีอาณานิคม
lysed โดยนอกเหนือจาก 20 UL ของ
ผสม NaOH ( 0.05 M ) - SDS ( 0.25% w / v ) ซึ่ง
จากนั้นต้มเป็นเวลา 15 นาที โดยทำการปรับ lysates
200 UL กับน้ำหมันไฟฟ้าที่ 2500g
5 นาทีสำหรับ ตารางบนเครื่อง .การล้าง lysates ( 4
UL ) ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการขยาย . ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
ดำเนินการโดยการเพิ่มต่อไปนี้เพื่อ lysates : บัฟเฟอร์
1xpcr ทอง ( Applied Biosystems เยอรมัน ) ;

ชุด 1.5 มม. ( Applied Biosystems เยอรมัน ) ; 200
อืม dntps ( โรชโมเลกุลอัลลิซิน , เยอรมัน ) ;
20 pmol ของแต่ละสี และ 1 U ของ ampli ทอง
การแท็ก ( Applied Biosystems เยอรมนี )
สุดท้ายปริมาณของปฏิกิริยา คือ ปรับหลอด 50 UL