Quantitative real-time polymerase c

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was
performed using a Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG kit
(Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Each reaction
contained the cDNA reverse-transcribed from 50 ng of RNA and 125 nM
(each) of one of the pairs of primers in Table 1. Amplicon size was determined
by agarose gel electrophoresis and the identity of each amplicon
was confirmed by nucleotide sequencing. Primer efficiency was determined
using at least five different dilutions (spanning at least five
orders of magnitude) of the purified PCR products for each of the
genes as the template for qRT-PCR. Primer efficiency values close to
1.0 are considered acceptable (Kubista et al., 2006). The qRT-PCR reactions
were performed and the resulting data were analysed using a
Rotorgene 3000 thermal cycler (Corbett Research). The fluorescence
curves produced for each sample were used to calculate the threshold
cycle (Ct) values. Using these values, the fold-change in expression
normalised to β-actin and relative to the control cells was calculated
using the 2−ΔΔCt method (Livak and Schmittgen, 2001).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เป็นปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR)ใช้ qPCR แพลทินัม® SYBR ®เขียวชุด SuperMix UDG(Invitrogen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วย cDNA ที่ทับศัพท์กลับจาก 50 ng ของอาร์เอ็นเอและ 125 นาโนเมตร(แต่ละ) หนึ่งคู่ไพรเมอร์ในตารางที่ 1 กำหนดขนาด Ampliconโดย agarose เจ electrophoresis และอัตลักษณ์ของแต่ละ ampliconมียืนยันจากลำดับของนิวคลีโอไทด์ กำหนดประสิทธิภาพรองพื้นใช้น้อยห้า dilutions อื่น (รัฐน้อยห้าอันดับของขนาด) ของผลิตภัณฑ์ PCR ที่บริสุทธิ์สำหรับแต่ละยีนเป็นแบบสำหรับ qRT PCR ค่าประสิทธิภาพรองพื้นใกล้1.0 ถือว่ายอมรับได้ (Kubista และ al., 2006) ปฏิกิริยา qRT PCRดำเนิน และข้อมูลได้ที่ analysed โดยใช้การRotorgene 3000 ร้อน cycler (คอร์เบตต์วิจัย) Fluorescence ที่เส้นโค้งที่ผลิตสำหรับแต่ละตัวอย่างใช้ในการคำนวณขีดจำกัดรอบค่า (Ct) ใช้ค่าเหล่านี้ เปลี่ยนพับในนิพจน์normalised กับβ-แอกติน และเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุมมีคำนวณโดยใช้วิธี 2−ΔΔCt (Livak และ Schmittgen, 2001)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปริมาณเวลาจริงวิธี polymerase chain reaction (PCR qRT-)
ได้รับการดำเนินการโดยใช้Platinum®SYBR®สีเขียวqPCR SUPERMIX-UDG ชุด
(Invitrogen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปฏิกิริยาของแต่ละคนที่มีอยู่ cDNA ย้อนกลับ-คัดลอกจาก 50 มณฑลของอาร์เอ็นเอและ 125 นาโนเมตร (แต่ละคน) ของหนึ่งในคู่ไพรเมอร์ในตารางที่ 1 ขนาด Amplicon ถูกกำหนดโดยข่าวคราวagarose และตัวตนของแต่ละ amplicon รับการยืนยันโดยลำดับเบส ประสิทธิภาพการใช้ไพรเมอร์ที่ถูกกำหนดโดยใช้เวลาอย่างน้อยห้าเจือจางแตกต่างกัน(ซึ่งประกอบไปด้วยอย่างน้อยห้าคำสั่งของขนาด) ของผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์สำหรับแต่ละยีนเป็นแม่แบบสำหรับqRT-วิธี PCR ค่าประสิทธิภาพการใช้ไพรเมอร์ใกล้กับ1.0 จะถือว่าได้รับการยอมรับ (Kubista et al., 2006) ปฏิกิริยา qRT-PCR ได้ดำเนินการและข้อมูลที่เกิดขึ้นมาวิเคราะห์โดยใช้Rotorgene 3000 Cycler ร้อน (Corbett วิจัย) เรืองแสงโค้งผลิตแต่ละตัวอย่างถูกนำมาใช้ในการคำนวณเกณฑ์วงจร(CT) ค่า โดยใช้ค่าเหล่านี้พับการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกปกติจะเบต้าโปรตีนและเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุมที่คำนวณโดยใช้2 วิธีΔΔCt (Livak และ Schmittgen, 2001)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์โดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส ( ข้าพเจ้า PCR ) คือ
โดยใช้แพลทินัม ® SYBR ®สีเขียว qpcr supermix udg Kit
( Invitrogen ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละปฏิกิริยา
ประกอบด้วย cDNA และย้อนกลับจาก 50 นาโนของ RNA และ 125 nm
( แต่ละ ) ของหนึ่งในคู่ของไพรเมอร์ในตารางที่ 1 ขนาดและตั้งใจ
โดยเอนไซม์เจล , เอกลักษณ์ของแต่ละที่ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และ
. ประสิทธิภาพการใช้ไพรเมอร์ตั้งใจ
อย่างน้อยห้าวิธีการต่าง ๆ ( รวมถึงคำสั่งของขนาดอย่างน้อย 5
) ของเชื้อบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์แต่ละ
ยีนเป็นแม่แบบสำหรับข้าพเจ้า PCR ประสิทธิภาพรองพื้นค่า

ปิด 1.0 ถือว่ายอมรับได้ ( kubista et al . , 2006 )ที่ข้าพเจ้าได้จากปฏิกิริยา
และผลวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้
rotorgene 3000 ความร้อนรอบ ( Corbett วิจัย ) เรืองแสง
เส้นโค้งที่ผลิตสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกใช้เพื่อคำนวณวงจรเกณฑ์
( CT ) ค่า การใช้ค่าเหล่านี้ พับเปลี่ยนสีหน้า
SCB ให้บีตา - actin และเทียบกับเซลล์ควบคุมมีค่า
โดยใช้ 2 วิธี ( −ΔΔ CT และ livak schmittgen , 2001 )