Yeast two-hybrid assay. Yeast two-h

Yeast two-hybrid assay. Yeast two-hybrid was performed using the
MATCHMAKERTMGAL4 Two-Hybrid System III according to the manufacturer’s
protocol (Clontech). The open reading frame of SlFYFL was amplified by PCR
with the primer pairs SlFYFL(Y)-F and SlFYFL(Y)-R (Table 1S). The PCR products
were digested using EcoRI and Pst I and cloned into the EcoR I and Pst I sites of the
pGBKT7 bait vector to obtain the vector FYFL-pGBKT7. Then FYFL-pGBKT7
vector was transferred into Y2HGold. The Y2HGold with bait was plated on SD
medium lacking Trp (SDO) and SD medium lacking Trp, His, Ade (TDO) to test
self-activation of FYFL-pGBKT7. In parallel, the open reading frame of SlRIN,
SlJOINTLESS and SlMADS1 were also amplified by primers (SlRIN(Y)-F,
SlRIN(Y)-R), (SlJ(Y)-F, SlJ(Y)-R) and (SlMADS1 (Y)-F, SlMADS1 (Y)-R) (Table 1S).
The products were cloned into the pGADT7 vector, and introduced into Y187.
Subsequently, Y2HGold with bait and Y187 with prey were cultured together in 2 3
YPDA medium for 24 h. After that these cultures were cultured on SD medium
lacking Trp, Leu (DDO) to select for diploids containing prey and bait vectors. After 2
to 5 days, fresh diploid cells were plated on SD medium lacking Trp, Leu, and His,
Ade, with X-a-Gal (QDO/X) to judge whether SlFYFL can interact with SlRIN,
SlJOINTLESS and SlMADS1 or not, respectively. Plates were incubated for 3 to7 days
at 30uC. An empty prey and bait vector were used as negative controls with each
bait and prey construct, respectively. Meanwhile, positive controls were cultured. The
assays were repeated at least three times with fresh transformants.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยีสต์ผสมสองวิเคราะห์ ยีสต์ผสมสองถูกดำเนินการโดยใช้การMATCHMAKERTMGAL4 III ระบบไฮบริด 2 ตามของผู้ผลิตโพรโทคอล (Clontech) กรอบเปิดอ่านของ SlFYFL ถูกขยาย ด้วย PCRมีพื้นที่จับคู่ SlFYFL (Y) - F และ SlFYFL (Y) - R (ตาราง 1S) ผลิตภัณฑ์ PCRไม่ต้องใช้ EcoRI และ Pst ฉัน และ cloned เป็น EcoR ฉันและ Pst ฉันไซต์ของpGBKT7 เหยื่อเวกเตอร์เวกเตอร์ FYFL pGBKT7 ได้รับ แล้ว FYFL pGBKT7เวกเตอร์มีการโอนย้ายไปยัง Y2HGold Y2HGold มีเหยื่อถูกชุบใน SDกลางขาด Trp (SDO) และ SD กลางขาด Trp เขา Ade (TDO) เพื่อทดสอบการเรียกใช้ FYFL pGBKT7 ตนเอง พร้อมกัน เฟรมเปิดอ่านของ SlRINSlJOINTLESS และ SlMADS1 ที่ยังขยาย โดยไพรเมอร์ (SlRIN (Y) -FSlRIN(Y)-R), (SlJ (Y) -F, SlJ(Y)-R) และ (SlMADS1 (Y) -F, SlMADS1 (Y) -R) (ตาราง 1S)ผลิตภัณฑ์มีโคลนเป็นเวกเตอร์ pGADT7 และนำเข้าสู่ Y187ในเวลาต่อมา Y2HGold กับเหยื่อและ Y187 มีเหยื่อถูกอ่างด้วยกันใน 2 3ปานกลาง YPDA 24 ชม หลังจากที่ วัฒนธรรมเหล่านี้มีอ่างใน SD ปานกลางขาด Trp ลัว (DDO) เลือกสำหรับ diploids ประกอบด้วยเหยื่อ และเหยื่อเวกเตอร์ หลังจาก 25 วัน เซลล์สด diploid ถูกชุบ Trp ขาดปานกลาง SD ลือ และ เขาAde ด้วย X-a-กัล (QDO / X) วิพากษ์ว่า SlFYFL สามารถโต้ตอบกับ SlRINSlJOINTLESS และ SlMADS1 หรือไม่ ตามลำดับ แผ่นที่ incubated สำหรับ 3 วัน to7ที่ 30uC ใช้ว่างเหยื่อและเหยื่อเวกเตอร์ที่เป็นลบควบคุมด้วยเหยื่อและเหยื่อสร้าง ตามลำดับ ในขณะเดียวกัน ควบคุมบวกมีอ่างด้วย ที่assays ถูกซ้ำน้อยสามครั้งกับ transformants สด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยีสต์ทดสอบสองไฮบริด ยีสต์สองไฮบริดได้รับการดำเนินการโดยใช้
ระบบ MATCHMAKERTMGAL4 สองไฮบริดที่สามตามที่ผู้ผลิตของ
โปรโตคอล (Clontech) กรอบการอ่านเปิด SlFYFL ถูกขยายโดยวิธี PCR
กับคู่ไพร SlFYFL (Y) -F และ SlFYFL (Y) -R (ตารางที่ 1S) ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์
ถูกย่อยโดยใช้ EcoRI และ Pst I และโคลนเข้า EcoR I และ Pst ฉันเว็บไซต์ของ
เหยื่อเวกเตอร์ pGBKT7 การขอรับเวกเตอร์ FYFL-pGBKT7 จากนั้น FYFL-pGBKT7
เวกเตอร์ที่ถูกย้ายเข้ามาใน Y2HGold Y2HGold กับเหยื่อที่ถูกชุบใน SD
กลางขาด Trp (SDO) และ SD กลางขาด Trp, เขาอาคาร (TDO) เพื่อทดสอบ
ตัวเองกระตุ้นการทำงานของ FYFL-pGBKT7 ในแบบคู่ขนานกรอบการอ่านเปิด SlRIN,
SlJOINTLESS และ SlMADS1 นอกจากนี้ยังได้ขยายโดยไพรเมอร์ (SlRIN (Y) -F,
SlRIN (Y) -R) (Slj (Y) -F, Slj (Y) -R) และ (SlMADS1 (Y) -F, SlMADS1 (Y) -R) (ตารางที่ 1S)
ผลิตภัณฑ์ที่ถูกโคลนเข้าสู่เส้น pGADT7 และนำเข้าไปใน Y187
ต่อมา Y2HGold กับเหยื่อและ Y187 กับเหยื่อที่ถูกเลี้ยงด้วยกันใน 2 3
YPDA กลางเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นวัฒนธรรมเหล่านี้ถูกนำมาเลี้ยงใน SD กลาง
ขาด Trp, ลื้อ (DDO) เพื่อเลือกสำหรับ diploids เวกเตอร์ที่มีเหยื่อและเหยื่อ หลังจากนั้น 2
ถึง 5 วันเซลล์ซ้ำสดถูกชุบใน SD กลางขาด Trp, ลื้อและเขา
อาคารที่มี XA-Gal (QDO / X) ที่จะตัดสินว่า SlFYFL สามารถโต้ตอบกับ SlRIN,
SlJOINTLESS และ SlMADS1 หรือไม่ตามลำดับ แผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 3 to7 วัน
ที่ 30uC เหยื่อและเหยื่อเวกเตอร์ที่ว่างเปล่าถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบกับ
เหยื่อและสร้างเหยื่อตามลำดับ ในขณะที่การควบคุมเชิงบวกมาเลี้ยง
ตรวจซ้ำอย่างน้อยสามครั้งด้วย transformants สด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยีสต์ลูกผสมสองตามลำดับ ยีสต์ลูกผสมสองการใช้
matchmakertmgal4 สองระบบไฮบริด III ตามขั้นตอนของผู้ผลิต (
clontech ) เปิดอ่านกรอบของ slfyfl ถูกขยายโดยวิธี PCR ด้วย primer คู่ slfyfl
( Y ) ( Y ) slfyfl - F - r ( ตารางที่ 1s ) ผลิตภัณฑ์ PCR
) ได้ถูกใช้ EcoRI และ PST และโคลนเข้าไปใน ecor ผมและ PST ฉันเว็บไซต์ของ
เวกเตอร์เวกเตอร์ fyfl-pgbkt7 เหยื่อ pgbkt7 ขอรับ . เวกเตอร์ fyfl-pgbkt7
ถูกโอนเข้ามาแล้ว y2hgold . การ y2hgold กับเหยื่อถูกหุ้มใน SD
กลางขาด TRP ( SDO ) และ SD กลางขาดกของเขา เอด ( tdo ) เพื่อทดสอบการกระตุ้นตนเอง
fyfl-pgbkt7 . ในแบบคู่ขนาน , เปิดอ่านกรอบของ slrin
sljointless slmads1 , และยังโดยขยาย PCR ( slrin ( Y ) ( Y ) slrin F ,
- R ) , ( slj ( y ) F ,slj ( Y ) R ) และ ( slmads1 ( Y ) ( Y ) slmads1 - F - r ) ( ตารางที่ 1s ) .
ผลิตภัณฑ์ถูกโคลนเข้าไปใน pgadt7 เวกเตอร์ และเข้าไป y187 .
ต่อมา y2hgold กับเหยื่อ y187 เหยื่อถูกเลี้ยงด้วยกัน 2
24 ypda ขนาดกลาง ชั่วโมง หลังจากนั้นวัฒนธรรมเหล่านี้ถูกเลี้ยงใน SD medium
ขาดก ือ ( โอ ) เพื่อเลือกสำหรับที่มีเวกเตอร์และเหยื่อล่อ หลังจาก 2
5 วันเซลล์ดิพลอยด์สดชุบบน SD กลางขาดลูกของเขาและ
เอ็ด กับ x-a-gal ( qdo / x ) ตัดสินว่า slfyfl สามารถโต้ตอบกับ slrin
sljointless slmads1 หรือไม่ , และ ตามลำดับ จานถูกบ่มเป็นเวลา 3 วัน
30uc คที่ . ว่างเปล่าและถูกใช้เป็นเหยื่อล่อเวกเตอร์การควบคุมทางแต่ละ
เหยื่อและเหยื่อสร้างตามลำดับ ในขณะที่การควบคุมบวกถูกเลี้ยง
) เป็นเวลาอย่างน้อยสามครั้งกับพลาสมิดที่สดใหม่