Alkyldihydropyrones, new polyketide

Alkyldihydropyrones, new polyketides synthesized
by a type III polyketide synthase from Streptomyces
reveromyceticus
Teruki Aizawa1, Seung-Young Kim1, Shunji Takahashi2,3, Masahiko Koshita1, Mioka Tani1, Yushi Futamura3,
Hiroyuki Osada2,3 and Nobutaka Funa1
Genome sequencing allows a rapid and efficient identification of novel catalysts that produce novel secondary metabolites.
Here we describe the catalytic properties of dihydropyrone synthase A (DpyA), a novel type III polyketide synthase encoded
in a linear plasmid of Streptomyces reveromyceticus. Heterologous expression of dpyA led to the accumulation of
alkyldihydropyrones A (1), B (2), C (3) and D (4), which are novel dihydropyran compounds that exhibit weak cytotoxicity
against the leukemia cell line HL-60. DpyA catalyzes the condensation of b-hydroxyl acid thioester and methylmalonyl-CoA
to yield a triketide intermediate that then undergoes lactonization of a secondary alcohol and a thioester to give
alkyldihydropyrone.
The Journal of Antibiotics advance online publication, 2 July 2014; doi:10.1038/ja.2014.80
INTRODUCTION
Type III polyketide synthase (PKS), which is widely distributed
among higher plants, fungi and bacteria, catalyzes the assembly of
primary metabolites such as acyl-CoA compounds to synthesize
structurally complex polyketides.1 The reaction catalyzed by type III
PKS starts with the formation of a thioester bond between the
catalytic center cysteine and an acyl group derived from a starter
substrate. Decarboxylative condensation of an extender substrate
toward a thioester linkage between the acyl group and the catalytic
center cysteine extends the growing polyketide chain. With a few
exceptions such as diketide synthase, which catalyzes hydrolysis of a
polyketide chain,2 typical type III PKS enzymes catalyze cyclization of
a polyketide chain to yield a monocyclic compound. The variety in
the reactions catalyzed by type III PKSs can be attributed to the
selectivity of starter and extender substrates, the condensation times
and the pattern of cyclization.1
A number of type III PKSs have been identified from the genus
Streptomyces. For example, RppA catalyzes condensation of five
molecules of malonyl-CoA to synthesize 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene,
which is a key intermediate of hexahydroxyperylenequinone
melanin biosynthesis in S. griseus.3,4 Germicidin synthase synthesizes
germicidin in S. coelicolor A3(2) via the condensation of an acyl
carrier protein ester of b-keto acid and ethylmalonyl-CoA.5 SrsA
synthesizes alkylresorcinols by sequential and order-controlled
condensation of malonyl-CoA, malonyl-CoA and methylmalonyl-
CoA toward long-chain acyl-CoA in S. griseus.6 Ken2, a homolog
of DpgA,7–9 which synthesizes 3,5-dihydroxyphenylacetyl-CoA, was
found in a kendomycin biosynthetic gene cluster of S. violaceoruber.10
Very recently, Tang et al.11 discovered that presulficidin, which is
synthesized by Cpz6, a type III PKS from the caprazamycin
biosynthetic cluster, relays sulfonate from 30-phosphoadenine-50-
phosphosulfate to caprazamycin.
Genome sequence analyses of Streptomyces species have shown that
the number of biosynthetic gene clusters encoded on the chromosome
is much higher than the number of secondary metabolites isolated
from each species.12,13 The genome of S. reveromyceticus SN-593 was
sequenced in the course of the studies of the biosynthesis of
reveromycin A, which inhibits bone resorption and bone metastases
of tumor cells.14–16 Analysis of the draft genome data of
S. reveromyceticus revealed that a type III PKS named DpyA is
encoded on a linear plasmid derived from this bacterium. In this
study, we demonstrate that DpyA catalyzes the synthesis of the novel
dihydropyran compounds alkyldihydropyrone A–D (Figure 1) from
b-hydroxyl acid thioesters and methylmalonyl-CoA, both in vivo and
in vitro. DpyA preferentially uses the b-hydroxyl acid thioester rather
than the b-keto acid thioester as a starter substrate. A unique feature
of DpyA is an ability to catalyze lactonization of secondary alcohols
and thioesters. In addition, alkyldihydropyrones showed weak cytotoxicity
against the leukemia cell line HL-60.
MATERIALS AND METHODS
General
Media, growth conditions and general recombinant DNA techniques of
Escherichia coli and Streptomyces were described by Sambrook et al.17 and
Kieser et al.,18 respectively. E. coli HST04 and HST08, restriction enzymes and
other DNA-modifying enzymes used for DNA manipulation were purchased
1Graduate Division of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka, Shizuoka, Japan; 2Chemical Biology Research Group, RIKEN Center for Sustainable
Resource Science, Saitama, Japan and 3Antibiotics Laboratory, RIKEN, Saitama, Japan
Correspondence: Professor N Funa, Graduate Division of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka, 52-1, Yada, Suruga, Shizuoka 422-8526, Japan.
E-mail: [e-mail]
Received 23 January 2014; revised 22 April 2014; accepted 27 May 2014
The Journal of Antibiotics (2014), 1–5
& 2014 Japan Antibiotics Research Association All rights reserved 0021-8820/14
www.nature.com/ja
from Takara Biochemicals (Shiga, Japan). E. coli ASKA clone () JW1079 was
obtained from the National BioResource Project (National Institute of
Genetics of Japan). HR-MS were measured using a JEOL AccuTOF-DART
mass spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan). 1H, 13C and 2D NMR spectra of
alkyldihydropyrones were measured in CD3OD on a Bruker BioSpin AV400N
FT-NMR spectrometer (Bruker, Billerica, MA, USA). Optical rotations of
alkyldihydropyrones were measured on a JASCO P-2200 digital polarimeter
(JASCO, Tokyo, Japan). IR spectra of alkyldihydropyrones were measured on a
JASCO FT/IR-550 spectrometer (JASCO). UV spectra of alkyldihydropyrones
were measured on a JASCO V-630BIO spectrophotometer (JASCO).
Construction of pIJ6021-SRE2_11 and pIJ4123-SRE2_11
An NdeI site was introduced at the start codon of dpyA by PCR with primer I:
50-GCGGAATTCCATATGGCTGCCTATGTGAGCTG-30 (the EcoRI site is
underlined; the NdeI site is italicized; the boldface letter indicates the silent
mutation introduced to abolish the native NdeI site), and primer II:
50-GCGGGATCCGACCTGGACTGACCATCA-30 (the BamHI site is italicized).
The amplified fragment was cloned between the EcoRI and BamHI sites of
pUC19, resulting in pUC19-SRE2_11. DNA sequencing of the plasmid
confirmed the correct sequence. The NdeI–BamHI fragment excised from
pUC19-SRE2_11 was cloned between the NdeI and BamHI sites of pIJ6021
and pIJ4123,19 resulting in pIJ6021-SRE2_11 and pIJ4123-SRE2_11,
respectively.
HPLC analysis of alkyldihydropyrones produced by Streptomyces
S. coelicolor M1146/pIJ6021-SRE2_11 was used to inoculate 50ml of yeast
extract–malt extract liquid medium containing 5 mgml1 of kanamycin, and
the resultant culture was grown at 30 1C. After 24 h, 5 mgml1 of thiostrepton
was added to induce the tip promoter, and the culture was continued for a
further 48 h. A 2 ml aliquot of the supernatant from the broth culture was
acidified with 30 ml of 6M HCl and extracted with ethyl acetate. The ethyl
acetate phase was evaporated and the residue was dissolved in a small amount
of methanol. Reverse-phase HPLC analysis was carried out using a Docosil B
column (4.6250mm; Senshu Scientific, Tokyo, Japan). Fractions eluted with
a gradient of 10–90% acetonitrile in water (both containing 0.1% trifluoroacetic
acid) at a flow rate of 1mlmin1 at 40 1C for 30 min. UV absorbance
was detected at 254nm.
Large-scale preparation of polyketides produced by S. coelicolor
M1146/pIJ6021-SRE2_11
S. coelicolor M1146/pIJ6021-SRE2_11 was used to inoculate 21 liter of yeast
extract–malt extract liquid medium containing 5 mgml1 of kanamycin, and
grown at 30 1C. After 24 h, 5 mgml1 of thiostrepton was added and the
culture was continued for a further 72 h. The pH of the culture supernatant
was adjusted to 2.0 with 6M HCl, and then extraction was carried out using
ethyl acetate. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous
sodium sulfate and evaporated until dry. The crude materials were dissolved in
a small amount of acetone and flash chromatographed on silica gel using
benzene/acetone (1:1, vol/vol) as an eluent. The eluate was evaporated and
dissolved in methanol for reverse-phase preparative HPLC. The crude
materials were purified using a reverse-phase preparative HPLC apparatus
equipped with a 5C18-AR-II column (20250mm2; Nacalai Tesque, Kyoto,
Japan) by elution with a gradient of methanol in water containing 0.1%
trifluoroacetic acid, at a flow rate of 5 ml min1 at ambient temperature. The
elution conditions were as

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Alkyldihydropyrones, polyketides ที่สังเคราะห์ใหม่
โดย synthase โพลีคีไทด์ III ชนิดจาก Streptomyces
reveromyceticus
Teruki Aizawa1, Kim1 ยงเซิง Shunji Takahashi2, 3, Masahiko Koshita1, Mioka Tani1, Yushi Futamura3,
ฮิโระยุกิ Osada2, 3 และ Nobutaka Funa1
จีโนมลำดับให้รหัสอย่างรวดเร็ว และมีประสิทธิภาพของสิ่งที่ส่งเสริมนวนิยายที่ผลิตนวนิยาย metabolites รอง
ที่นี่เราอธิบายถึงตัวเร่งปฏิกิริยาคุณสมบัติของ dihydropyrone synthase A (DpyA), โพลีคีไทด์ synthase III ชนิดนวนิยายเข้า
ใน plasmid เชิงเส้นของ Streptomyces reveromyceticus นิพจน์ heterologous ของ dpyA นำไปสู่การสะสมของ
alkyldihydropyrones ได้ (1), B (2), C (3) และ D (4), ซึ่งเป็นสารประกอบ dihydropyran นวนิยายที่แสดง cytotoxicity อ่อน
กับเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวเส้น HL-60 DpyA catalyzes แน่นของไฮดรอกซิล b กรด thioester และ methylmalonyl-CoA
ให้ triketide เป็น กลางนั้นที่ผ่าน lactonization สุรารองและ thioester ให้
alkyldihydropyrone.
สมุดยาปฏิชีวนะล่วงหน้าสิ่งพิมพ์ออนไลน์ 2 2014 กรกฎาคม doi:10.1038/ja.2014.80
INTRODUCTION
Type III โพลีคีไทด์ synthase (PKS), ซึ่งถูกนำไปเผยแพร่
สูงพืช เชื้อรา และแบคทีเรีย catalyzes แอสเซมบลีของ
metabolites หลักเช่น acyl CoA สารประกอบสังเคราะห์
polyketides.1 structurally ซับซ้อนปฏิกิริยากระบวนตามชนิด III
PKS เริ่มต้น ด้วยการก่อตัวของตราสารหนี้ thioester ระหว่าง
cysteine ศูนย์ตัวเร่งปฏิกิริยาและกลุ่ม acyl มาเริ่มต้น
พื้นผิว Decarboxylative แน่นของพื้นผิวการ extender
ต่อการเชื่อมโยง thioester ระหว่างกลุ่ม acyl และที่ตัวเร่งปฏิกิริยา
cysteine ศูนย์ขยายสายโพลีคีไทด์เติบโต มีไม่กี่
ข้อยกเว้นเช่น diketide synthase ที่ catalyzes ไฮโตรไลซ์ของการ
สายโพลีคีไทด์ ทั่วไป 2 ชนิดราคา III PKS เอนไซม์สถาบัน cyclization ของ
สายโพลีคีไทด์ให้สารประกอบ monocyclic ความหลากหลายใน
สามารถเกิดจากปฏิกิริยากระบวนตามชนิด III PKSs
ใวสตาร์ทและ extender ได้ เวลาที่มีหยดน้ำเกาะ
และรูปแบบของหมายเลข cyclization.1
A ชนิด III PKSs ได้รับการระบุจากตระกูลนี้
Streptomyces ได้ ตัวอย่าง RppA catalyzes สรุปห้า
โมเลกุลของ malonyl-CoA สังเคราะห์ 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene,
ซึ่งเป็นตัวกลางสำคัญของ hexahydroxyperylenequinone
synthesizes ชีวสังเคราะห์เมลานินใน S. griseus.3,4 Germicidin synthase
germicidin ใน coelicolor S. A3(2) ผ่านแน่นของ acyl การ
ขนส่งโปรตีนเอสบี-keto กรดและ SrsA ethylmalonyl CoA.5
synthesizes alkylresorcinols ตามลำดับ และ ควบคุมใบสั่ง
สรุป malonyl-CoA, malonyl-CoA และ methylmalonyl-
CoA ไปทางโซ่ยาว acyl CoA ใน S. griseus.6 Ken2 เป็น homolog
ของ DpgA, 7 – 9 ที่ synthesizes 3,5-dihydroxyphenylacetyl-CoA ถูก
พบในคลัสเตอร์ยีน biosynthetic kendomycin ของ S. violaceoruber.10
Very ล่า ถังและ al.11 พบว่า presulficidin ซึ่งเป็น
สังเคราะห์ โดย Cpz6 ชนิด III PKS จากการ caprazamycin
biosynthetic คลัสเตอร์ รีเลย์ sulfonate จาก 30-phosphoadenine - 50-
phosphosulfate กับ caprazamycin.
จีโนมลำดับวิเคราะห์พันธุ์ Streptomyces ได้แสดงที่
จำนวนคลัสเตอร์ biosynthetic ยีนบนโครโมโซมที่เข้า
จะสูงกว่าจำนวนของ metabolites รองแยกต่างหาก
จาก species.12,13 แต่ละ กลุ่มของ S. reveromyceticus SN-593 ถูก
เรียงลำดับในหลักสูตรการศึกษาชีวสังเคราะห์ของ
reveromycin A ซึ่งยับยั้งการแพร่กระจาย resorption และกระดูกกระดูก
ของเนื้องอก cells.14–16 วิเคราะห์ข้อมูลจีโนมร่างของ
S. reveromyceticus เปิดเผยชนิด PKS III ที่ชื่อ DpyA เป็น
เข้าใน plasmid เส้นที่มาจากแบคทีเรียนี้ ใน
ศึกษา เราแสดงว่า DpyA catalyzes สังเคราะห์จากนวนิยาย
dihydropyran สารประกอบ alkyldihydropyrone A – D (รูปที่ 1) จาก
ไฮดรอกซิล b กรด thioesters และ methylmalonyl-CoA ทั้งในสัตว์ทดลอง และ
เพาะเลี้ยง DpyA โน้ตใช้ thioester กรดไฮดรอกซิล b ค่อนข้าง
กว่า thioester กรด b keto เป็นขั้นเริ่มต้น มีเฉพาะ
DpyA เป็นความสามารถในการ lactonization ของ alcohols รองสถาบัน
และ thioesters , Alkyldihydropyrones แสดงให้เห็นว่าอ่อนแอ cytotoxicity
กับเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวเส้น HL 60.
วิธีการและวัสดุ
ทั่วไป
สื่อ เงื่อนไขการเจริญเติบโต และเทคนิคดีเอ็นเอวททชทั่วไป
Escherichia coli และ Streptomyces ได้อธิบายไว้ โดย Sambrook et al.17 และ
Kieser et al., 18 ตามลำดับ E. coli HST04 และ HST08 เอนไซม์จำกัด และ
ซื้ออื่น ๆ เอนไซม์ปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอที่ใช้สำหรับจัดการดีเอ็นเอ
1Graduate กองครั้งและวิทยาศาสตร์สิ่งแวดล้อม มหาวิทยาลัยของชิสึโอกะ ชิสึโอกะ ญี่ปุ่น กลุ่มวิจัยชีววิทยา 2Chemical ศูนย์เพื่อความยั่งยืนอาทิ
วิทยาศาสตร์ทรัพยากร ไซตามะ ญี่ปุ่น และ 3Antibiotics ปฏิบัติการ อาทิ ไซตามะ ญี่ปุ่น
ติดต่อ: ศาสตราจารย์ N Funa ฝ่ายบัณฑิตของครั้งและวิทยาศาสตร์สิ่งแวดล้อม มหาวิทยาลัยของชิสึโอกะ 52-1, Yada, Suruga ชิสึโอกะ 422-8526 ญี่ปุ่น
อีเมล: [e-mail]
รับ 23 2014 มกราคม ปรับปรุง 22 2014 เมษายน รับ 27 2014 พฤษภาคม
สมุดรายวันของยาปฏิชีวนะ (2014), 1 – 5
& 2014 ญี่ปุ่นยาปฏิชีวนะวิจัยสมาคมสงวน 0021-8820/14
www.nature.com/ ja
จาก Takara Biochemicals (ชิงะ ญี่ปุ่น) E. coli ASKA โคลน() JW1079 ถูก
ได้รับจากโครงการ BioResource ชาติ (สถาบันแห่งชาติ
พันธุศาสตร์ญี่ปุ่น) HR-MS ถูกวัดโดยใช้ AccuTOF-โผ JEOL
โดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ (JEOL โตเกียว ญี่ปุ่น) 1H, 13C และแรมสเป็คตรา NMR 2D ของ
alkyldihydropyrones ถูกวัดใน CD3OD บนการ Bruker BioSpin AV400N
FT NMR สเปกโตรมิเตอร์ (Bruker, Billerica, MA สหรัฐอเมริกา) หมุนเวียนแสงของ
alkyldihydropyrones มีวัดบน polarimeter เป็นดิจิตอล 2200 JASCO P
(JASCO โตเกียว ญี่ปุ่น) แรมสเป็คตรา IR ของ alkyldihydropyrones มีวัดบนเป็น
JASCO FT/IR-550 สเปกโตรมิเตอร์ (JASCO) UV แรมสเป็คตราของ alkyldihydropyrones
ถูกวัดในแบบ JASCO V-630BIO เครื่องทดสอบกรดด่าง (JASCO) .
ก่อสร้าง pIJ6021 SRE2_11 และ pIJ4123-SRE2_11
อัน NdeI ไซต์ถูกนำมาใช้ในรหัสพันธุกรรมเริ่มต้นของ dpyA โดย PCR กับพื้นผม:
50-GCGGAATTCCATATGGCTGCCTATGTGAGCTG-30 (ไซต์ EcoRI
ขีดเส้นใต้ ตัวเอนไซต์ NdeI เงียบบ่งชี้ตัวอักษร boldface
กลายพันธุ์นำไปยุบเว็บไซต์ NdeI เป็น), และรองพื้นทู:
50-GCGGGATCCGACCTGGACTGACCATCA-30 (เว็บไซต์ BamHI เป็นตัวเอียง) .
ส่วนเอาต์ถูกโคลนระหว่าง EcoRI และ BamHI ไซต์ของ
pUC19 เกิดใน pUC19 SRE2_11 ลำดับดีเอ็นเอของ plasmid
ยืนยันลำดับที่ถูกต้อง ส่วน NdeI – BamHI excised จาก
pUC19 SRE2_11 ถูกโคลนระหว่าง NdeI และ BamHI ไซต์ของ pIJ6021
และ pIJ4123, 19 ใน pIJ6021 SRE2_11 และ pIJ4123-SRE2_11,
ตามลำดับ.
วิเคราะห์ HPLC alkyldihydropyrones ผลิต โดย Streptomyces
coelicolor S. M1146/pIJ6021-SRE2_11 ใช้ฉีด 50ml ของยีสต์
สารสกัด – มอลต์สกัดขนาดกลางของเหลวที่ประกอบด้วย mgml 5 1 ของกานามัยซิน และ
วัฒนธรรมผลแก่มีปลูกที่ 30 1C. หลังจาก 24 ชม mgml 5 1 ของ thiostrepton
เพิ่มชวนโปรโมเตอร์แนะนำ และวัฒนธรรมได้อย่างต่อเนื่องสำหรับการ
48 h เพิ่มเติม ส่วนลงตัว 2 ml ของ supernatant จากวัฒนธรรมซุปถูก
acidified กับ 30 ml ของ 6 M HCl และสกัด ด้วยเอทิล acetate เอทิล
acetate ระยะหายไป และสารตกค้างถูกละลายในน้อย
ของเมทานอล วิเคราะห์ HPLC กลับเฟสถูกดำเนินการโดยใช้ Docosil B
คอลัมน์ (4.6 250 mm Senshu วิทยาศาสตร์ โตเกียว ญี่ปุ่น) ส่วน eluted กับ
ไล่ acetonitrile 10-90% ในน้ำ (trifluoroacetic 0.1% ทั้งที่มี
กรด) ที่อัตราการไหลของ 1mlmin 1 ที่ 1C 40 สำหรับ 30 นาที UV absorbance
พบที่ 254nm
เตรียมมาตราส่วนขนาดใหญ่ของ polyketides ผลิต โดย S. coelicolor
M1146/pIJ6021-SRE2_11
Coelicolor S. M1146/pIJ6021-SRE2_11 ใช้ฉีด 2 1 ลิตรของยีสต์
สารสกัด – มอลต์สกัดขนาดกลางของเหลวที่ประกอบด้วย mgml 5 1 ของกานามัยซิน และ
โตที่ 30 1C. หลังจาก 24 ชม เพิ่ม mgml 5 1 ของ thiostrepton และ
วัฒนธรรมได้อย่างต่อเนื่องสำหรับ h 72 ตัวต่อไป PH ของวัฒนธรรม supernatant
2.0 กับ 6 M HCl ถูกปรับแล้ว สกัดออกมาใช้
เอทิล acetate ชั้นอินทรีย์ถูกล้าง ด้วยน้ำเกลือ แห้งมากกว่าได
โซเดียมซัลเฟต และหายไปจนกว่าจะแห้ง วัสดุดิบที่ละลายใน
อะซีโตนและแฟลช chromatographed เจลใช้น้อย
เบนซีน/อะซีโตน (1:1, vol/vol) เป็น eluent Eluate ได้หายไป และ
ละลายในเมทานอลสำหรับกลับเฟส preparative HPLC ดิบ
วัสดุที่บริสุทธิ์โดยใช้อุปกรณ์กลับเฟส preparative HPLC
พร้อมคอลัมน์ 18-AR-II 5C (20 250 มม. 2 Nacalai Tesque เกียวโต,
ญี่ปุ่น) โดย elution ด้วยการไล่ระดับสีของเมทานอลประกอบด้วยกรด 0.1%
trifluoroacetic ที่อัตราการไหล 5 ml นาที 1 อุณหภูมิของน้ำ ใน
elution เงื่อนไขได้เป็น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

alkyldihydropyrones polyketides ใหม่ , สังเคราะห์
ตามประเภทที่ 3 โดย synthase จาก Streptomyces

reveromyceticus เทรุกิ aizawa1 ซึงยอง kim1 ชุนจิ takahashi2,3 , มาซาฮิโกะ koshita1 mioka tani1 , , , futamura3 ยูชิ , ฮิโรยูกิ โนบุทากะ funa1

และ osada2,3 จีโนมลำดับช่วยให้รวดเร็วและมีประสิทธิภาพการผลิตสารทุติยภูมิและนวนิยายนวนิยาย
.ที่นี่เราจะอธิบายคุณสมบัติการเร่งปฏิกิริยาของ dihydropyrone synthase ( dpya ) , ประเภทนวนิยาย III และเข้ารหัสโดย
ในพลาสมิดโดย Streptomyces reveromyceticus . ชนิดของการแสดงออก dpya นำไปสู่การสะสมของ
alkyldihydropyrones ( 1 ) , B ( 2 ) , C ( 3 ) และ D ( 4 ) ซึ่งเป็นนวนิยาย dihydropyran สารประกอบที่แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว
อ่อนแอต่อสาย hl-60 .dpya และการควบแน่นของกรดไทโอเ เทอร์ b-hydroxyl methylmalonyl COA
และให้ผลผลิต triketide กลางที่ผ่าน lactonization ของแอลกอฮอล์ทุติยภูมิและไทโอเ เทอร์ให้

alkyldihydropyrone . วารสารของยาปฏิชีวนะล่วงหน้าออนไลน์สิ่งพิมพ์ , 2 กรกฎาคม 2014 ; ดอย : 10.1038 / จา 2014.80

แนะนำสามประเภทโดย synthase ( pks ) ซึ่งมีการกระจายอย่างกว้างขวาง
ระหว่างพืชสูงกว่า เชื้อรา และแบคทีเรีย และสารประกอบ
หลักเช่น , สารเคลือบสังเคราะห์
polyketides โครงสร้างซับซ้อน ปฏิกิริยาเร่ง 1 โดย pks Type III
เริ่มต้นด้วยการก่อตัวของไทโอเ เทอร์พันธะระหว่าง
ไอเสียศูนย์ซิสเตอีนและไอเวอร์แมกตินได้มาจาก starter
พื้นผิว การควบแน่น decarboxylative ของ Extender พื้นผิว
ทางเชื่อมระหว่างหมู่เอซิลไทโอเ เทอร์ และซิสเตอีน
ศูนย์เร่งขยายการเติบโตโดยห่วงโซ่ มีไม่กี่
ข้อยกเว้นเช่น diketide synthase ซึ่งกระตุ้นการย่อยสลายของ
โดยโซ่ ประเภท 2 โดยทั่วไป 3 pks เอนไซม์อัลของการเร่งโดยโซ่ผลผลิตสารประกอบ monocyclic . ความหลากหลายใน
ปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาด้วยประเภทที่ 3 pkss สามารถนำมาประกอบกับการเลือกเริ่มต้นและ Extender พื้นผิว
,
/ ครั้งและรูปแบบของอัล 1
จำนวนของประเภทที่ 3 pkss ได้รับการระบุจากสกุล Streptomyces
. ตัวอย่างเช่น rppa และการควบแน่นของห้า
โมเลกุลของ malonyl COA สังเคราะห์ 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene
,ซึ่งเป็นสื่อกลางที่สำคัญของ hexahydroxyperylenequinone
เมลานินในในเอส griseus , 3 , 4 , และ germicidin สังเคราะห์
germicidin ใน S . coelicolor A3 ( 2 ) ผ่านการควบแน่นของเอซิลเอสเทอร์ของกรด b-keto
พาหะโปรตีนและ COA ethylmalonyl 5 srsa
สังเคราะห์โดยต่อเนื่องเพื่อควบคุมและ alkylresorcinols
การควบแน่นของ malonyl COA , COA malonyl และ methylmalonyl -
COA ต่อ COA ในเอส griseus เปลี่ยนตัว , 6 ken2 , homolog
ของ dpga 7 – 9 ซึ่งสังเคราะห์ 3,5-dihydroxyphenylacetyl-coa ,
kendomycin ร่วมกลุ่มยีนที่พบใน S . violaceoruber 10
มากเมื่อเร็ว ๆนี้ , Tang et al.11 ค้นพบว่า presulficidin ซึ่ง
สังเคราะห์โดย cpz6 ประเภท III pks จาก caprazamycin
ร่วมกลุ่มซัลโฟเนตจาก 30-phosphoadenine-50 -
, รีเลย์phosphosulfate เพื่อ caprazamycin .
ลำดับจีโนมการวิเคราะห์ของ Streptomyces สายพันธุ์พบว่า
จำนวนการเข้ารหัสยีนบนโครโมโซมกลุ่ม
ที่สูงกว่าจำนวนของสารทุติยภูมิจากแต่ละชนิดแยก
. 12 , 13 ‘จีโนมของ S
reveromyceticus sn-593 เป็นลำดับในหลักสูตรของการศึกษาการสังเคราะห์
reveromycin เป็น ,ซึ่งยับยั้งการละลายของกระดูกและกระดูกแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง
14 – 16 การวิเคราะห์ข้อมูลจีโนมของร่าง
S . reveromyceticus เปิดเผยว่า Type III pks ชื่อ dpya คือ
เข้ารหัสบนเส้นพลาสมิดที่ได้จากแบคทีเรียนี้ ในการศึกษานี้เราแสดงให้เห็นว่า dpya
และการสังเคราะห์สารประกอบ dihydropyran นวนิยาย
alkyldihydropyrone เป็น– D
( รูปที่ 1 ) จากb-hydroxyl thioesters methylmalonyl COA และกรดทั้งชนิด
หลอด dpya preferentially ใช้กรดไทโอเ เทอร์ b-hydroxyl ค่อนข้าง
กว่า b-keto กรดไทโอเ เทอร์เป็นเริ่มต้นพื้นผิว
เป็นคุณลักษณะเฉพาะของ dpya คือความสามารถในการเร่ง lactonization ของแอลกอฮอล์และมัธยมศึกษา
thioesters . นอกจากนี้ alkyldihydropyrones พบอ่อนแอเซลล์กับเซลล์เส้น hl-60
. .
วัสดุและวิธีการสื่อทั่วไป

สภาพการเจริญเติบโตและทั่วไปดีเอ็นเอเทคนิค
( Escherichia และ Streptomyces ถูกอธิบายโดย sambrook ET และ al.17
คีเซอร์ et al . , 18 ตามลำดับ และ E . coli hst04 hst08 เอนไซม์ดีเอ็นเออื่น ๆข้อ จำกัดและ
เอนไซม์ดัดแปรที่ใช้ดีเอ็นเอซื้อ
1 กองวิทยาศาสตร์โภชนาการและสิ่งแวดล้อมมหาวิทยาลัยชิซูโอกะ , ชิสึโอกะ ญี่ปุ่น กลุ่มงานวิจัยชีววิทยา 2chemical ศูนย์ไรเคนยั่งยืน
ทรัพยากรวิทยาศาสตร์ , ไซตามะ , ญี่ปุ่น และห้องปฏิบัติการ 3antibiotics ริเคน , ไซตามะ , จดหมายญี่ปุ่น
: ศาสตราจารย์ N funa , บัณฑิต กองโภชนาการ และวิทยาศาสตร์สิ่งแวดล้อม มหาวิทยาลัยชิซูโอกะ , 52-1 ยาดา ซุรุกะ 422-8526
ชิสุโอกะ ประเทศญี่ปุ่น [e-mail]
e - mail :ได้รับ 23 มกราคม 2014 ; แก้ไข 22 เมษายน 2014 ; ยอมรับ 27 พฤษภาคม 2014
วารสารยาปฏิชีวนะ ( 2014 ) , 1 - 5
& 2014 ญี่ปุ่นยาปฏิชีวนะวิจัยสมาคมสงวนลิขสิทธิ์ 0021-8820 / 14
www.nature . com / จา
จาก Takara อัลลิซิน ( ชิงะ , ญี่ปุ่น ) E . coli โคลนโจ๊งเว (  ) jw1079 คือ
ที่ได้รับจากโครงการทรัพยากรชีวภาพแห่งชาติ ( National Institute of
พันธุศาสตร์ของญี่ปุ่น )hr-ms ถูกวัดโดยใช้ จอล accutof โผ
แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( Jeol , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) 1H และ 13C NMR สเปกตรัมของ 2D ,
alkyldihydropyrones ที่วัดใน cd3od ในบรุคเกอร์ biospin av400n
ft-nmr Spectrometer ( บรุคเกอร์บิลเลริกา , MA , USA , ) หมุนของเลนส์
alkyldihydropyrones ถูกวัดใน jasco p-2200 ดิจิตอล polarimeter
( jasco , โตเกียว , ญี่ปุ่น )อินฟราเรดสเปกตรัมของ alkyldihydropyrones วัดบน
jasco ฟุต / ir-550 Spectrometer ( jasco ) แสงสเปกตรัมของ alkyldihydropyrones
เป็นวัดอยู่บน jasco v-630bio Spectrophotometer ( jasco )

และการก่อสร้าง pij6021-sre2_11 pij4123-sre2_11 เป็น ndei เว็บไซต์แนะนําที่รหัสพันธุกรรมเริ่มต้นของ dpya โดยวิธี PCR ด้วยไพรเมอร์ I :
50-gcggaattccatatggctgcctatgtgagctg-30 ( ชิ้นส่วน เว็บไซต์
ขีดเส้นใต้ ;เว็บไซต์ ndei ตัวเอียงตัวหนาคือ ; จดหมายแสดงเงียบ
การกลายพันธุ์แนะนำยกเลิกเว็บไซต์ ndei พื้นเมือง ) และไพรเมอร์ 2 :
50-gcgggatccgacctggactgaccatca-30 ( เว็บไซต์ BamHI เป็นตัวเอียง )
amplified fragment คือโคลนระหว่าง EcoRI และ BamHI ของเว็บไซต์
puc19 ที่เกิดใน puc19-sre2_11 . ลำดับของพลาสมิด
ดีเอ็นเอยืนยันให้ถูกต้องส่วน ndei BamHI และตัดจาก
puc19-sre2_11 ถูกโคลนและระหว่าง ndei BamHI และเว็บไซต์ของ pij6021
pij4123,19 ที่เกิดใน pij6021-sre2_11 pij4123-sre2_11

และ , ตามลำดับ การวิเคราะห์ HPLC ของ alkyldihydropyrones ผลิตโดย Streptomyces
S . coelicolor m1146 / pij6021-sre2_11 ใช้ฉีดเพื่อสกัดยีสต์
( malt extract อาหารเหลวที่มี 5 mgml  1 ของเหตุผลและ
วัฒนธรรมดังกล่าวโต 30 1c หลังจาก 24 ชั่วโมง , 5 mgml  1 thiostrepton
เพิ่มมากขึ้นเคล็ดลับโปรโมเตอร์และวัฒนธรรมอย่างต่อเนื่องสำหรับ
ต่อไป 48 ชั่วโมง 2 ml ส่วนลงตัวของสูงจากน้ำซุปวัฒนธรรม
ปรับกับ 30 มล. 6M HCl และสกัดด้วยเอทิลอะซิเตท . เอทิลอะซิเตท และระยะที่ถูกระเหย
กาก
ละลายใน จำนวนเล็ก ๆของเมทานอลกลับเฟส HPLC วิเคราะห์โดยใช้ docosil B
คอลัมน์ ( 4.6  250mm ญี่ปุ่นขายเช่นกันทางวิทยาศาสตร์ , โตเกียว ) ตัวอย่างเศษส่วนกับ
ไล่ระดับ 10 – 90% ไนในน้ำ ( ทั้งที่ประกอบด้วย 0.1% trifluoroacetic
acid ) ที่อัตราการไหลของ 1mlmin  1 ใน 40 c เป็นเวลา 30 นาที ค่าการดูดกลืนแสงยูวี ที่ตรวจพบใน 254nm
.
การเตรียมขนาดใหญ่ของ polyketides ผลิตโดย coelicolor m1146 pij6021-sre2_11

/ Sเอส coelicolor m1146 / pij6021-sre2_11 เคยฉีดวัคซีน 2  1 ลิตรสารสกัดยีสต์
( malt extract อาหารเหลวที่ประกอบด้วย 5 mgml  1 ของอาณาจักรมอญและ
โต 30 1c หลังจาก 24 ชั่วโมง , 5 mgml  1 thiostrepton เพิ่มและ
วัฒนธรรมต่อเนื่องอีก 72 ชั่วโมง ของวัฒนธรรมนำ
ปรับ 2.0 กับ 6M HCl และการสกัดโดยใช้
เอทิลอะซิเทตชั้นอินทรีย์คือการล้างด้วยน้ำเกลือแห้ง
โซเดียมซัลเฟตรัส และระเหยจนแห้ง วัสดุดิบถูกละลายใน
จำนวนเล็ก ๆของอะซิโตนและแฟลช chromatographed บนซิลิกาเจลที่ใช้น้ำมันเบนซิน /
) ( 1 : 1 1 : Vol / Vol ) เป็นนี้ ในสารละลาย ( eluate ) ถูกละลายในเมทานอลระเหยและ
รีเฟสเบื้องต้น 2 . โดย
วัสดุที่ได้ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้กลับเฟส HPLC อุปกรณ์ =
พร้อมกับ 5c18-ar-ii คอลัมน์ ( 20  250mm2 ; nacalai tesque , เกียวโต ,
( ญี่ปุ่น ) โดยการไล่ระดับของเมทานอลในน้ำที่มี 0.1 %
กรดไตรฟลูออโรอะซิติก ที่อัตราการไหล 5 มิลลิลิตรต่อนาที  1 ที่อุณหภูมิห้อง
( เป็นเงื่อนไข