Here we present a method for joint

Here we present a method for joint amplification of genes of carbapenemases of molecular classes A, B, and D for hybridization analysis on DNA microarrays. Using new-generation DNA polymerase KAPA2G Fast (KAPA Biosystems, USA) together with optimization of the conditions for the multiplex PCR with 20 primer pairs allowed us to carry out joint amplification of full-length genes of seven different types of carbapenemases (KPC, VIM, IMP, SPM, SIM, GIM, and OXA) with simultaneous inclusion of biotin as a label. Yield of the labeled PCR product sufficient for further analysis by microarray hybridization was achieved 40 min after the start of the reaction. This reduced the total duration of DNA identification techniques, including sample preparation stage, to 4 h. The method for gene identification by DNA microarrays with the improved stage of amplification of specific carbapenemase genes was tested with clinical strains of gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, and Enterobacteriaceae spp. with different sensitivity towards carbapenems according to phenotyping tests. All clinical strains of A. baumannii resistant to carbapenems were found to have genes of OXA-type carbapenemases (subtypes OXA-51, OXA-23, OXA-40, and OXA-58), and clinical strains of P. aeruginosa resistant to carbapenems were found to possess the gene of VIM-type metallo-beta-lactamase (subtype VIM-2). When testing clinical strains sensitive to carbapenems, carbapenemase genes were not detected. Thus, the method of identifying carbapenemase genes on DNA microarrays is characterized by high accuracy and can be used in clinical microbiology laboratories for express diagnostics of resistance to carbapenems

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ที่นี่เรานำเสนอวิธีการในการขยายร่วมของยีนของ carbapenemases ของโมเลกุลประเภท A, B และ D สำหรับวิเคราะห์ hybridization บน DNA microarrays ใช้รุ่นใหม่ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส KAPA2G อย่างรวดเร็ว (KAPA ศาสตร์เชิงชีวภาพ สหรัฐอเมริกา) ร่วมกับการเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขสำหรับการ multiplex PCR กับ 20 คู่ไพรเมอร์ให้เราดำเนินการขยายร่วมของยีนแบบเต็มตัวของเจ็ดชนิดต่าง ๆ carbapenemases (KPC, VIM, IMP, SPM, SIM, GIM และ OXA) ด้วยการรวมกันของไบโอตินเป็นป้ายชื่อ ผลผลิตของ PCR ผลิตภัณฑ์ป้ายที่เพียงพอสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมโดย microarray hybridization สำเร็จ 40 นาทีหลังจากการเริ่มต้นของปฏิกิริยา นี้ลดลงรวมระยะเวลาของดีเอ็นเอระบุเทคนิคการ ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง ถึง 4 ชั่วโมง วิธีสำหรับการระบุยีนโดย DNA microarrays ขั้นปรับปรุงขยายของยีนเฉพาะ carbapenemase ถูกทดสอบกับทางคลินิกสายพันธุ์ของแบคทีเรียแกรมลบ Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii และออกซิเจน Enterobacteriaceae ด้วยความไวที่แตกต่างกันต่อ carbapenems การทดสอบ phenotyping พบว่าทุกสายพันธุ์ทางการแพทย์ของ A. baumannii ทนต่อ carbapenems มียีนของ OXA-ชนิด carbapenemases (ประเภทย่อย OXA-51, OXA-23, OXA-40 และ OXA-58), และพันธุ์ P. aeruginosa ทนต่อ carbapenems ทางคลินิกพบว่ามียีนของชนิด VIM metallo เบต้า-lactamase (ชนิดย่อย VIM-2) เมื่อการทดสอบทางคลินิกสายพันธุ์ไวต่อ carbapenems ยีน carbapenemase ไม่พบ ดังนั้น วิธีการระบุยีน carbapenemase บน DNA microarrays โดดเด่น ด้วยความแม่นยำสูง และสามารถใช้ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาทางคลินิกสำหรับการวินิจฉัยด่วนของความต้านทานต่อ carbapenems

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ที่นี่เรานำเสนอวิธีการสำหรับการขยายร่วมกันของยีนของ carbapenemases ของการเรียนในระดับโมเลกุล A, B, D และสำหรับการวิเคราะห์การผสมพันธุ์ในดีเอ็นเอไมโครอะเรย์ ใช้รุ่นใหม่ DNA Polymerase KAPA2G รวดเร็ว (KAPA Biosystems, สหรัฐอเมริกา) ร่วมกับการเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขสำหรับ multiplex PCR คู่กับ 20 ไพรเมอร์ช่วยให้เราสามารถดำเนินการขยายร่วมกันของยีนยาวเต็มรูปแบบของเจ็ดประเภทที่แตกต่างกันของ carbapenemases (KPC, เสียงเรียกเข้า , IMP, SPM, ซิม GIM และ oxa) กับการรวมพร้อมกันของไบโอตินเป็นฉลาก อัตราผลตอบแทนของผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีป้ายกำกับเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ต่อไปโดย microarray ผสมพันธุ์ก็ประสบความสำเร็จ 40 นาทีหลังจากที่เริ่มต้นของการเกิดปฏิกิริยา การลดระยะเวลารวมของเทคนิคประจำตัวดีเอ็นเอรวมทั้งขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างถึง 4 ชั่วโมง วิธีการสำหรับการระบุยีนดีเอ็นเอ microarrays โดยมีขั้นตอนการปรับตัวดีขึ้นของการขยายของยีน carbapenemase เฉพาะได้รับการทดสอบกับสายพันธุ์ที่ทางคลินิกของแบคทีเรียแกรมลบ aeruginosa พ, Acinetobacter baumannii และ Enterobacteriaceae เอสพีพี ที่มีความไวต่อการที่แตกต่างกันไปตาม carbapenems ทดสอบ phenotyping สายพันธุ์ทางคลินิกทั้งหมดของเอทนต่อ carbapenems baumannii พบว่ามียีนของ oxa ชนิด carbapenemases (เชื้อ oxa-51, oxa-23, oxa-40 และ oxa-58) และสายพันธุ์ที่ทางคลินิกของการทนต่อ carbapenems P. aeruginosa พบว่ามียีนของ VIM ชนิดโลหะเบต้า lactamase (การย่อยเป็นกลุ่มที่ 2) เมื่อการทดสอบทางคลินิกสายพันธุ์ที่มีความไวต่อ carbapenems ยีน carbapenemase ไม่พบ ดังนั้นวิธีการในการระบุยีน carbapenemase บนดีเอ็นเอไมโครอะเรย์ที่โดดเด่นด้วยความแม่นยำสูงและสามารถนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาคลินิกสำหรับการวินิจฉัยด่วนของความต้านทานต่อการ carbapenems

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ที่นี่เรานำเสนอวิธี Amplification ร่วมกันของยีนของ carbapenemases โมเลกุลของ คลาส A , B และ D สำหรับการวิเคราะห์ hybridization กับดีเอ็นเอิ . การใช้ DNA polymerase รุ่นใหม่ kapa2g อย่างรวดเร็ว ( จังหวัด Biosystems , USA ) ควบคู่กับการเพิ่มประสิทธิภาพของภาพสำหรับเทคนิค multoplex PCR ด้วย primer 20 คู่ ให้เราสามารถดำเนินการร่วมกันของยีนแบบเต็มตัวของเจ็ดประเภทที่แตกต่างกันของ carbapenemases ( KPC วิม , , IMP , SPM , ซิม , คิม และ oxa ) ด้วยการรวมพร้อมกันของไบโอติน เป็นป้าย ผลผลิตของผลิตภัณฑ์ที่มีข้อความซึ่งเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ต่อไปโดย microarray ( เท่ากับ 40 นาทีหลังจากที่เริ่มต้นของปฏิกิริยา ลดระยะเวลาทั้งหมดของเทคนิคการตรวจ DNA รวมทั้งขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างใน 4 ชั่วโมง สำหรับวิธีที่กำหนดโดยยีน ดีเอ็นเอ ด้วยการปรับปรุงการแสดงขั้นตอนเพิ่มปริมาณยีน carbapenemase เฉพาะถูกทดสอบกับสายพันธุ์ทางคลินิกของแบคทีเรียแกรมลบ Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii , และผิดเพี้ยน spp . ที่มีความไวต่อคาร์บาฟิแนมตามอการทดสอบ ทุกสายพันธุ์ A = คลินิกป้องกันคาร์บาฟิแนม พบว่ามียีนของ oxa ประเภท carbapenemases ( ชนิดย่อย oxa-51 oxa-23 oxa-40 , , , และ oxa-58 ) และสายพันธุ์ทางคลินิกของ P . aeruginosa ทนต่อคาร์บาฟิแนม พบว่ามียีนเมทัลโลเบต้าแลคตาเมสชนิดของวิม ( ทั้ง vim-2 ) เมื่อทดสอบทางคลินิกสายพันธุ์ที่มียีนคาร์บาฟิแนม carbapenemase , ไม่พบ ดังนั้นวิธีการระบุ carbapenemase ยีนใน DNA การแสดงเป็นลักษณะความถูกต้องสูงและสามารถใช้ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาคลินิกสำหรับบริการการต้านทานต่อคาร์บาฟิแนม