2.2. Determination of ergothioneine

2.2. Determination of ergothioneine content
The concentration of ESH in the ME was 9.13 ± 2.03 mg/ml. The
concentration of ESH was analysed using HPLC-mass spectrometry
analysis (Shimadzu LCMS-2010EV spectrometer with a Develosil
C30-UG-5 reversed-phase column) following the method of Dubost,
Bellman, Peterson, and Royse (2007).
2.3. Experimental organism
Sixty-three live red queen crabs (C. japonicus), weighing
364 ± 48 g each, were caught in Toyama Bay, Japan, and transported
to Toyama Prefectural Agricultural, Forestry, and Fisheries
Research Center (Toyama, Japan). The crabs were acclimatised for
4 days to stabilize their condition before experimental treatment.
The crabs were fed with Acetes shrimp (Acetes japonicus) and
maintained in an aerated tank at 4 C with 34-ppt-salinity purified
seawater.
2.4. Total RNA and cDNA synthesis
Hemocytes separated from the crab haemolymph were preserved
in an RNA-stabilizing solution (Ambion; Applied Biosystems
Japan Ltd., Tokyo, Japan) and stored at 4 C. Total RNA from
the hemocytes was isolated using RNAiso (TaKaRa Bio Inc., Shiga,
Japan) and converted into cDNA using PrimeScript™ Reverse
Transcriptase (TaKaRa Bio. Inc.).
2.5. Partial cloning and sequencing of the proPO cDNA fragment
Degenerate primers were designed from the conserved regions
of the proPO genes by using the available sequences of swimming
crab (Portunus trituberculatus), mudcrab (Scylla serrata), kuruma
shrimp (Marsupenaeus japonicus), and black tiger shrimp (Penaeus
monodon) proPO genes in the National Center for Biotechnology
Information (NCBI) Genbank database. Primers proPO-F and
proPO-R, 50-CACCACTGGCACTGGCATCT-30 and 50-TTGTGCCAGC
GGTAGAACAC-30 , respectively, were used for polymerase chain
reaction (PCR) amplification. Hemocyte cDNA samples were used
as templates in a 20 ll PCR reaction containing the primer pair
proPO-F and proPO-R, dNTP (2 mM), PCR buffer (10), and Taq
DNA polymerase (1.0 U). PCR cycling conditions were as follows:
95 C for 5 min, followed by 28 cycles of 95 C for 30 s, 55 C for
30 s, 72 C for 30 s, and then a final extension at 72 C for 5 min.
PCR transcripts were visualised on a 1.0% agarose gel stained with
ethidium bromide. The PCR product of the expected molecular size
(500 bp) was cloned and sequenced using ABI 3130x1 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, CA).
2.6. In vivo experiments
2.6.1. Immersion treatments
Immersion treatments at 0, 2, and 4 h using 1.0% ME solution
were performed as a preliminary experiment to standardise
immersion time. PO haemolymph activity decreased with increasing
time of immersion (data not shown). There was no significant
difference between the PO haemolymph activities at 2 and 4 h
immersion; thus, 2 h immersion was used in the subsequent concentration-
dependent experiment. To determine the dose dependency
of the effect of ME on melanosis prevention, four 50 l
tanks containing 13 l of purified seawater with 0.0%, 0.5%, or 1.0%
ME were prepared as part of the preliminary experiment. Six crabs
were immersed in each ME solution at a ratio of 6:1 (v/w of crab)
for 2 h at 4 C with continuous aeration. The efficacy of the 1.0%
ME, which was determined to inhibit PO activity (data not shown)
in the haemolymph of crabs in the aforementioned experiment,
was then compared with a negative control (seawater) and two positive
controls: 0.05% SS and 0.05% HR in purified seawater. Four
groups of six crabs were immersed in four different solutions (control,
ME, SS, and HR).
2.6.2. Haemolymph sampling and assay of haemolymph PO activity
A 1 ml sample of the haemolymph was withdrawn from the
arthrodial membrane of the last walking leg of the crab by using
a sterile syringe preloaded with 1 ml anticoagulant (450 mM NaCl,
10 mM KCl, 10 mM EDTA, and 10 mM HEPES). The PO activity of
each sample (n = 3 per group) was measured spectrophotometrically
using L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) as the substrate
in a pH 7.8 reaction medium and incubated at 37 C as
previously reported (Encarnacion, Fagutao, Hirono, Ushio, & Ohshima,
2010).
2.6.3. Reverse transcription–PCR analysis
Crab haemolymph (1 ml) was collected after 2 h of immersion
treatment, and then the hemocytes were isolated immediately.
The hemocytes were preserved in an RNA-stabilizing solution
(Ambion) and stored at 4 C. Total RNA from the hemocytes was
isolated using RNAiso and converted into cDNA using Prime-
Script™ Reverse Transcriptase. The cDNA products were quantified
to confirm that all were of equal concentration. To determine
whether the proPO transcripts were silenced, reverse transcription-
PCR (RT–PCR) was performed using gene-specific primers for
the proPO and beta-actin (b-actin) genes. b-Actin was used as a control
to monitor the amount of RNA/cDNA PCR template and the
A.B. Encarnacion et al. / Food Chemistry 127 (2011) 1594–1599 1595
amplification efficiency between samples. The prime

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. การกำหนดเนื้อหา ergothioneineความเข้มข้นของ ESH ใน ME ถูก 9.13 ± 2.03 mg / ml. การความเข้มข้นของ ESH ถูกวิเคราะห์โดยใช้ HPLC มวล spectrometryวิเคราะห์ (สเปกโตรมิเตอร์ Shimadzu LCMS - 2010EV ด้วย DevelosilC30-UG-5 คอลัมน์กลับเฟส) ตามวิธีการของ Dubostยาม ปิเตอร์สัน และ Royse (2007)2.3. ทดลองสิ่งมีชีวิตปูราชินีแดงสดหกสิบสาม (C. หลัก), ชั่งน้ำหนัก364 ± 48 กรัมแต่ละ ถูกจับได้ในอ่าวโทยามะ ญี่ปุ่น และขนส่งการจังหวัดโทยามะ เกษตร ป่าไม้และประมงศูนย์วิจัย (โทยามะ ญี่ปุ่น) ปูถูก acclimatised สำหรับ4 วันเพื่อคงสภาพของพวกเขาก่อนการทดลองรักษาปูถูกเลี้ยง ด้วยกุ้ง Acetes (Acetes หลัก) และรักษาในตลับมวลเบาที่ 4 C กับ 34 ppt เค็มบริสุทธิ์น้ำทะเล2.4. การสังเคราะห์ RNA และ cDNA จำนวนHemocytes แยกจาก haemolymph ปูถูกรักษาไว้ในเสถียรภาพ RNA (Ambion ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพประเทศญี่ปุ่นจำกัด โตเกียว ญี่ปุ่น) และเก็บไว้ที่ c 4. RNA รวมจากhemocytes ถูกแยกโดยใช้ RNAiso (TaKaRa ชีวภาพ Inc. ชิกะญี่ปุ่น) และถูกแปลงไปใช้ PrimeScript™กลับ cDNATranscriptase (TaKaRa Bio Inc.)2.5. การโคลน และการจัดลำดับของส่วน cDNA ของสนอเวลาบางส่วนออกแบบไพรเมอร์ degenerate จากภูมิภาคภัตของยีนสนอเวลาโดยลำดับมีว่ายน้ำคุรุ ปู (Portunus trituberculatus), mudcrab (ปูทะเล)กุ้ง (Marsupenaeus หลัก), และกุ้งกุลาดำ (กุ้งกุลายีนที่สนอเวลา monodon) ในศูนย์แห่งชาติสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพฐานข้อมูลข้อมูล (NCBI) Genbank ไพรเมอร์สนอเวลา-F และสนอเวลา-R, 50-CACCACTGGCACTGGCATCT-30 และ 50-TTGTGCCAGCGGTAGAACAC-30 ลำดับ ใช้สำหรับพอลิเมอเรสเชนปฏิกิริยา (PCR) ขยาย ใช้ตัวอย่างของ cDNA hemocyteเป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR จะ 20 คู่ไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR สนอเวลา-F และ R สนอเวลา dNTP (2 มม.), (10), และ Taqดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (1.0 U) PCR ขี่เงื่อนไขดังต่อไปนี้:95 C 5 นาที ตาม ด้วยรอบ 28 95 C 30 s, 55 C สำหรับs, C 72 30 30 s และจากนั้นการขยายสุดท้าย 72 c เป็นเวลา 5 นาทีใบแสดงผล PCR ได้เพียงเล็กน้อยได้ในเจล 1.0% agarose ย้อมด้วยโบรไมด์ ethidium ผลิตภัณฑ์ PCR ของขนาดโมเลกุลที่คาดไว้(500 bp) ถูกโคลน และเรียงลำดับโดยใช้การวิเคราะห์ทางพันธุกรรม 3130 x 1 ABI(ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ CA)2.6 การทดลองที่ในร่างกาย2.6.1 การแช่บำบัดทรีทเมนท์แช่ที่ 0, 2 และ 4 h ใช้ 1.0% ME โซลูชั่นดำเนินการเป็นการทดลองเบื้องต้นเพื่อ standardiseเวลาแช่ กิจกรรม haemolymph PO ที่ลดลงกับเพิ่มเวลาแช่ (ไม่แสดงข้อมูล) ก็ไม่สำคัญความแตกต่างระหว่างกิจกรรม haemolymph PO ที่ 2 และ 4 hแช่ ดังนั้น ใช้ในความเข้มข้นตามมาแช่ 2 ชมการทดลองขึ้น การตรวจสอบการพึ่งยาผลกระทบของฉันเกี่ยวกับการป้องกัน melanosis สี่ 50 lรถถังที่ประกอบด้วย 13 l ของน้ำทะเลบริสุทธิ์ กับ 0.0%, 0.5%, 1.0%ฉันถูกเตรียมไว้เป็นส่วนหนึ่งของการทดลองเบื้องต้น หกปูถูกแช่อยู่ในแต่ละฉันอัตราส่วน 6:1 (v/w ปู)สำหรับ 2 ชม.ที่ 4 C กับอากาศอย่างต่อเนื่อง ประสิทธิภาพของ 1.0%ฉัน ซึ่งถูกกำหนดในการยับยั้งกิจกรรม PO (ไม่แสดงข้อมูล)ใน haemolymph ของปูในการทดลองดังกล่าวแล้วการเปรียบเทียบตัวควบคุมเป็นลบ (น้ำทะเล) และบวกสองควบคุม: 0.05% SS และ 0.05% ชม.ในน้ำทะเลบริสุทธิ์ สี่กลุ่มของปูหกถูกแช่อยู่ในโซลูชั่นต่าง ๆ สี่ (ควบคุมฉัน SS และชม.)2.6.2. Haemolymph สุ่มตัวอย่างและทดสอบกิจกรรม haemolymph POตัวอย่าง 1 ml ของ haemolymph ถูกถอนออกจากการarthrodial เมมเบรนของขาเดินครั้งสุดท้ายของปูโดยใช้เข็มฉีดยาฆ่าเชื้อมาพร้อมสารกันเลือดแข็ง 1 มิลลิลิตร (450 มม. NaCl10 mM KCl, EDTA 10 มม. 10 มม. และ HEPES) กิจกรรมของ POแต่ละตัวอย่าง (n = 3 ต่อกลุ่ม) โดยวัด spectrophotometricallyใช้ L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) เป็นพื้นผิวในปฏิกิริยา pH 7.8 กลาง และรับการกกที่ 37 C เป็นรายงานก่อนหน้านี้ (Encarnacion, Fagutao อิ โอะ และ Ohshima2010)2.6.3. กลับวิเคราะห์ถอด – PCRรวบรวมหลังจาก 2 ชม.จากการแช่ปู haemolymph (1 ml)การรักษา และ hemocytes ได้แยกทันทีHemocytes ถูกเก็บรักษาไว้ในโซลูชันเสถียรภาพอาร์เอ็นเอ(Ambion) และเก็บไว้ที่ 4 ถูกจาก hemocytes RNA รวมคแยกโดยใช้ RNAiso และแปลงเป็น cDNA ใช้นายก-ปเทส Script™ ผลิตภัณฑ์ cDNA ถูกวัดเพื่อยืนยันว่า ทั้งหมดมีความเข้มข้นเท่ากัน การตรวจสอบว่าใบสนอเวลาได้เงียบ ย้อนกลับถอด-PCR (RT – PCR) ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ของยีนเฉพาะสำหรับสนอเวลาและเบต้าแอกติน (บีแอกติน) ยีน แอกติน b ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการตรวจสอบปริมาณของ RNA/cDNA PCR แม่และA.B. Encarnacion et al. / เคมีอาหาร 127 (2011) ค.ศ. 1594 – 1599 1595มีประสิทธิภาพขยายระหว่างตัวอย่าง นายก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การหาปริมาณ ergothioneine
ความเข้มข้นของ ESH ในฉันเป็น 9.13 ± 2.03 mg / ml
ความเข้มข้นของ ESH ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธี HPLC-มวลสาร
(สเปกโตรมิเตอร์ Shimadzu LCMS-2010EV กับ Develosil วิเคราะห์
-UG-5 C30 คอลัมน์ย้อนกลับเฟส) ตามวิธีการของ Dubost ที่
Bellman ปีเตอร์สันและ Royse (2007).
2.3 สิ่งมีชีวิตทดลอง
หกสิบสามสดปูราชินีแดง ( C. japonicus) น้ำหนัก
364 ± 48 กรัมแต่ละถูกจับในโทะยะมะเบย์, ญี่ปุ่น, และการขนส่ง
ไป Toyama Prefectural เกษตรป่าไม้และประมง
ศูนย์วิจัย (โทะยะมะญี่ปุ่น) ปูถูก acclimatised สำหรับ
4 วันเพื่อรักษาเสถียรภาพของสภาพของพวกเขาก่อนที่จะทดลองรักษา.
ปูได้รับการเลี้ยงดูด้วย Acetes กุ้ง (Acetes japonicus) และ
เก็บรักษาไว้ในถังมวลเบาที่ 4? C ที่มี 34 ppt ความเค็มบริสุทธิ์
น้ำทะเล.
2.4 อาร์เอ็นเอและรวมยีนสังเคราะห์
เม็ดเลือดแยกออกจากเลือดปูที่ถูกเก็บรักษาไว้
ในสารละลาย RNA เสถียรภาพ (Ambion ?; Applied Biosystems
จำกัด ประเทศญี่ปุ่นกรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส RNA รวมจาก
เซลล์เม็ดเลือดที่ถูกแยกโดยใช้ RNAiso? (Takara Bio อิงค์ Shiga,
ญี่ปุ่น) และเปลี่ยนเป็น cDNA ใช้ PrimeScript ™ย้อนกลับ
Transcriptase (Takara Bio. อิงค์).
2.5 โคลนบางส่วนและลำดับของ proPO ยีนแฟรกเมนต์
ไพรเมอร์เลวได้รับการออกแบบจากบริเวณป่าสงวน
ของยีน proPO โดยใช้ลำดับที่มีอยู่ของว่ายน้ำ
ปู (ชนิด Portunus trituberculatus) mudcrab (สกิลลา serrata) Kuruma
กุ้ง (Marsupenaeus japonicus) และกุลาดำ กุ้ง (Penaeus
monodon) ยีน proPO ในศูนย์แห่งชาติสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพ
ฐานข้อมูล (NCBI) Genbank ไพรเมอร์ proPO-F และ
proPO-R 50 CACCACTGGCACTGGCATCT-30 และ 50 TTGTGCCAGC
GGTAGAACAC-30 ตามลำดับถูกนำมาใช้สำหรับวิธี Polymerase chain
reaction (PCR) ขยาย ตัวอย่างเซลล์เม็ดเลือด cDNA ถูกนำมาใช้
เป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR 20 LL มีไพรเมอร์คู่
proPO-F และ proPO-R dNTP (2 มิลลิเมตร) PCR บัฟเฟอร์ (10?) และ Taq
DNA Polymerase (1.0 U) PCR เงื่อนไขการขี่จักรยานมีดังนี้
95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 28 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา?
30 S 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและจากนั้นขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา? 5 นาที.
ถอดเสียง PCR ถูกมองเห็นบน agarose gel ที่ 1.0% ย้อมด้วย
ethidium bromide ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีขนาดโมเลกุลคาด
(500 bp) เป็นโคลนและลำดับขั้นตอนการใช้ ABI 3130x1 ทางพันธุกรรมวิเคราะห์
(Applied Biosystems, CA).
2.6 ในการทดลองกับร่างกาย
2.6.1 การรักษาแช่
รักษาแช่ที่ 0, 2 และ 4 ชั่วโมงโดยใช้วิธีการแก้ปัญหา ME 1.0%
ได้ดำเนินการเป็นการทดลองเบื้องต้นที่จะสร้างมาตรฐาน
เวลาแช่ กิจกรรม PO เลือดลดลงด้วยการเพิ่ม
เวลาของการแช่ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ไม่มีนัยสำคัญก็คือ
ความแตกต่างระหว่างกิจกรรม PO เลือดที่ 2 และ 4 ชั่วโมง
แช่; ดังนั้น 2 ชั่วโมงแช่ถูกนำมาใช้ในภายหลัง concentration-
ขึ้นอยู่กับการทดลอง เพื่อตรวจสอบการพึ่งพายา
ผลกระทบของฉันในการป้องกัน melanosis สี่ 50 ลิตร
ถังที่มี 13 ลิตรของน้ำทะเลบริสุทธิ์กับ 0.0%, 0.5% หรือ 1.0%
ME ได้จัดทำขึ้นเป็นส่วนหนึ่งของการทดลองเบื้องต้น หกปู
ถูกแช่อยู่ในสารละลายแต่ละ ME ในอัตราส่วน 6: 1 (v / W ของปู)
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาและมีอากาศอย่างต่อเนื่อง? ประสิทธิภาพของ 1.0%
ME ซึ่งได้รับการมุ่งมั่นที่จะยับยั้งกิจกรรม PO (ไม่ได้แสดงข้อมูล)
ในเลือดของปูในการทดสอบดังกล่าวข้างต้น
แล้วเมื่อเทียบกับการควบคุมลบ (น้ำทะเล) และสองบวก
การควบคุม: เอสเอส 0.05% และ 0.05 % การบริหารทรัพยากรบุคคลในน้ำทะเลบริสุทธิ์ สี่
กลุ่มหกปูแช่ในการแก้ปัญหาที่แตกต่างกันสี่ (ควบคุม
ME, เอสเอสและ HR).
2.6.2 การสุ่มตัวอย่างเลือดและการทดสอบของกิจกรรมเลือด PO
1 มิลลิลิตรตัวอย่างเลือดที่ถูกถอนออกจาก
เมมเบรน arthrodial ของขาเดินสุดท้ายของปูโดยใช้
เข็มฉีดยาฆ่าเชื้อพร้อมกับ 1 มลสารกันเลือดแข็ง (450 มิลลิโซเดียมคลอไรด์,
10 มิลลิ KCl 10 มิลลิ EDTA และ 10 มิลลิ HEPES) กิจกรรมที่ป ณ ของ
แต่ละตัวอย่าง (n = 3 ต่อกลุ่ม) วัด spectrophotometrically
ใช้ L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) เป็นสารตั้งต้น
ในกลางค่า pH 7.8 ปฏิกิริยาและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็น
รายงานก่อนหน้านี้ (Encarnacion, Fagutao, โรโน, Ushio และ Ohshima,
2010).
2.6.3 ย้อนกลับถอดความ-PCR วิเคราะห์
ปูเลือด (1 มล.) ที่ถูกเก็บรวบรวมหลังจาก 2 ชั่วโมงของการแช่
การรักษาแล้วเม็ดเลือดที่ถูกแยกออกทันที.
เม็ดเลือดถูกเก็บรักษาไว้ในการแก้ปัญหา RNA เสถียรภาพ
(Ambion?) และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส RNA รวมจากเซลล์เม็ดเลือดที่ถูก
แยกโดยใช้ RNAiso? และเปลี่ยนเป็น cDNA ใช้ Prime-
สคริปต์™ย้อนกลับ Transcriptase ผลิตภัณฑ์ยีนถูกวัด
เพื่อยืนยันว่าทุกคนเท่าเทียมกันของความเข้มข้น เพื่อตรวจสอบ
ว่าจิตบำบัด proPO ถูกเงียบย้อนกลับ transcription-
PCR (RT-PCR) ได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ
proPO และเบต้าโปรตีน (B-โปรตีน) ยีน B-โปรตีนถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม
การตรวจสอบปริมาณของ RNA / ยีน PCR และแม่แบบที่
A.B. Encarnacion et al, / อาหารเคมี 127 (2011) 1594-1599 1595
ประสิทธิภาพการขยายตัวอย่างระหว่าง นายกรัฐมนตรี