2.4. Light and electron microscopy

2.4. Light and electron microscopy studies
Roots and cotyledons of cacao seedlings uninoculated (control) and inoculated with strains AM7 and BA66 and grown under sterile conditions were collected 1 month after the inoculation and used in the light and electron microscopy studies. Roots were examined by transmission (TEM) and scanning (SEM) electron microscopy. For the light microscopy observations, roots and cotyledons of sterile plants were cut with a sharp blade, stained with 1% aqueous solution of toluidine blue, mounted on glass slides and observed microscopically. For the SEM, sterile seedlings were removed from the tubes using a large forceps and excess agar was carefully removed using a scalpel blade. All samples were placed on the surface of a copper specimen holder (16 29 1.5 mm). A small amount of the cryo-adhesive ‘Tissue Tek’ was applied to the mounting surface of the specimen holder prior to placement of the samples. Holders containing specimen materials were rapidly placed on the surface of a square brass metal tube pre-cooled in liquid nitrogen ( 196 C) within a styrofoam box. This process of contact freeze immobilization was performed on all samples used in the experiment. Numbered, frozen sample holders were placed into the same square brass tubing for storage in a liquid nitrogen storage dewar until removal for observation. Samples were transferred into a modified specimen carrier and transferred to an Oxford CT1500 HF cryo preparation system attached to a Hitachi S-4100 scanning electron microscope. Here the sample temperature was raised to 90 C for 10 min to etch surface water from the sample surface. The sample was then cooled to below 120 C and coated with 5– 10 nm of platinum metal, using a magnetron sputter coater, to render the surface electrically conductive and yield more secondary electrons when scanned with the electron beam during observation in the SEM. Samples were transferred to the cold stage in the SEM at 170 C and observed with an electron beam accelerating voltage of 2 kV. Micrographs were recorded on Polaroid Type 55P/ N film. Some samples were returned to the cryopreparation system after observation and fractured at 170 C, (in vacuo), using a cold scalpel blade ( 196 C), to visualize internal interactions of fungal hyphae with cacao cells. For the TEM observations, tissues from cacao plants inoculated as described above and control plants were fixed for 2 h at room temperature by immersion in 3% glutaraldehyde–0.05 M sodium cacodylate buffer, pH 7.0. They were then placed into a refrigerator at 4 C overnight. This was followed by washing 6 times over 1 h with the above-stated buffer, post fixed in 2% buffered osmium tetroxide for 2 h, dehyd rated in 100% ethan ol and infilt rated with Spurrs low-vi scosity embedding resin . Thin (10 nm) gold sections of the tissue wer e cut on a Riech ert/AO Ult racut microtome with a Diato me diamond knife and mo unted onto 200 mesh Ni grids. They were stain ed with 4% uranyl acetate and 3% lead citrate and viewed in an H-70 00 Hitach I TEM at 75 kV. Micrographs were recorded on a digit al camera.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การแสงและอิเล็กตรอน microscopyราก cotyledons cacao กล้าไม้ uninoculated (ควบคุม) และ inoculated กับสายพันธุ์ BA66 และ AM7 และเติบโตขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่ใส่ได้ 1 เดือนรวบรวมหลังจากที่ inoculation และใช้ในการศึกษาแสงและอิเล็กตรอน microscopy การ รากถูกตรวจสอบ โดยส่ง (ยการ) และสแกน (SEM) อิเล็กตรอน microscopy สำหรับการสังเกตแสง microscopy ราก cotyledons กอซพืชถูกตัด ด้วยใบมีดคม สีกับ 1% ละลายสีฟ้า toluidine ติดตั้งบนกระจกสไลด์ และสังเกต microscopically สำหรับ SEM กล้าไม้ที่ผ่านการฆ่าเชื้อออกจากหลอดที่ใช้คีมขนาดใหญ่ และ agar เกินถูกเอาออกอย่างระมัดระวังโดยใช้ใบมีด scalpel ตัวอย่างทั้งหมดถูกวางไว้บนพื้นผิวของเจ้าตัวอย่างทองแดง (16 29 1.5 mm) จำนวนการ cryo-กาว 'เนื้อเยื่อ Tek' ใช้ผิวติดยึดสิ่งส่งตรวจก่อนตำแหน่งของตัวอย่าง ผู้ที่ประกอบด้วยวัสดุตัวอย่างรวดเร็วได้ถูกวางไว้บนพื้นผิวของท่อโลหะทองเหลืองสี่เหลี่ยมก่อนระบายความร้อนด้วยในไนโตรเจนเหลว (196 C) ภายในกล่อง styrofoam ขั้นตอนการตรึงโปหยุดติดต่อทำตามตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ในการทดลอง ใส่ตัวเลข แช่แข็งอย่างถูกวางเป็นท่อทองเหลืองสี่เหลี่ยมเดียวกันสำหรับการจัดเก็บเก็บไนโตรเจนเหลว dewar จนเอาสำหรับการสังเกต ตัวอย่างที่เป็นผู้ขนส่งตัวอย่างปรับเปลี่ยน และโอนย้ายไประบบเตรียมการ cryo ออกซ์ฟอร์ด CT1500 HF ที่แนบกับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในการสแกนสำหรับฮิตาชิ S-4100 นี่ตัวอย่างอุณหภูมิขึ้นถึง 90 C สำหรับ 10 นาทีเพื่อที่กัดผิวน้ำจากพื้นผิวตัวอย่าง ตัวอย่างระบายความร้อนด้วยการล่าง 120 C แล้วเคลือบ ด้วย 5 – 10 nm โลหะแพลทินัม ใช้แบบ magnetron sputter coater แสดงพื้นผิวที่นำไฟฟ้า และผลตอบแทนเพิ่มเติมอิเล็กตรอนรองเมื่อสแกน ด้วยแสงอิเล็กตรอนในระหว่างเก็บข้อมูลในตัวอย่าง SEM. ถูกโอนย้ายไปยังขั้นตอนเย็นใน SEM ที่ 170 C และพบกับลำแสงอิเล็กตรอนเร่งแรง 2 kV Micrographs บันทึกชนิด Polaroid 55P / N ฟิล์ม บางส่วนถูกส่งกลับไประบบ cryopreparation หลังจากสังเกต และ fractured ที่ 170 C, (ใน vacuo), ใช้ใบมีด scalpel เย็น (196 C), เห็นภาพภายในโต้ตอบของ hyphae เชื้อรา cacao เซลล์ สำหรับการสังเกตยการ เนื้อเยื่อจากพืช cacao inoculated ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และควบคุมพืชถูกนำ h 2 ที่อุณหภูมิห้อง โดยแช่ใน 3% บัฟเฟอร์ cacodylate glutaraldehyde – 0.05 M โซเดียม pH 7.0 พวกเขาได้แล้วอยู่ในตู้เย็นที่ 4 C ค้างคืน นี้ถูกตามล้าง 6 ครั้งกว่า 1 h กับบัฟเฟอร์ที่ระบุข้างต้น ลงคงที่ 2% buffered ออสเมียมเทโตรไซด์สำหรับ 2 h, dehyd ใน ol อีธานและ infilt คะแนน มี scosity ต่ำ vi Spurrs ฝังเรซิน 100% บาง (10 นาโนเมตร) ส่วนทองอี wer เนื้อเยื่อตัดบน Riech ert/อ่าว Ult racut microtome กับ Diato ฉันมีดเพชร และ mo unted บนตาข่าย 200 Ni กริด พวกเขาถูกติด ed acetate uranyl 4% และ 3% รอซิเตรต และดูใน H-70 00 Hitach ไอยการที่ 75 เควี Micrographs ได้บันทึกไว้ในกล้องหลักอัล

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 แสงและการศึกษากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนรากและใบเลี้ยงของต้นกล้าโกโก้ uninoculated (ควบคุม) และสายพันธุ์เชื้อด้วย Am7 และ BA66 และเติบโตขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อที่ถูกเก็บรวบรวม 1 เดือนหลังการฉีดวัคซีนและใช้ในที่มีแสงและอิเล็กตรอนศึกษากล้องจุลทรรศน์
รากมีการตรวจสอบโดยการส่งผ่าน (TEM) และการสแกน (SEM) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน สำหรับการสังเกตกล้องจุลทรรศน์แสง, รากและใบเลี้ยงของพืชหมันถูกตัดด้วยใบมีดคมย้อมด้วย 1% สารละลายของ toluidine สีฟ้า, ติดตั้งอยู่บนสไลด์แก้วและสังเกตกล้องจุลทรรศน์ สำหรับ SEM ต้นกล้าฆ่าเชื้อที่ถูกถอดออกจากท่อโดยใช้คีมขนาดใหญ่และวุ้นส่วนที่เกินจะถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้ใบมีดผ่าตัด ตัวอย่างทั้งหมดถูกวางไว้บนพื้นผิวของชิ้นงานที่ผู้ถือทองแดง (16 29 1.5 มิลลิเมตร) จำนวนเงินที่เล็ก ๆ ของฝั่งกาว 'เนื้อเยื่อเต็ก' ถูกนำไปใช้กับพื้นผิวติดตั้งของเจ้าของชิ้นงานก่อนที่จะมีการวางตำแหน่งของกลุ่มตัวอย่าง ผู้ถือที่มีวัสดุชิ้นงานถูกวางไว้อย่างรวดเร็วบนพื้นผิวของตารางท่อโลหะทองเหลืองก่อนระบายความร้อนด้วยไนโตรเจนเหลว (196 C) ภายในกล่องโฟม กระบวนการของการตรึงติดต่อแช่แข็งนี้ได้รับการดำเนินการกับตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ในการทดลอง หมายเลขผู้ถือตัวอย่างถูกแช่แข็งอยู่ในท่อทองเหลืองตารางเหมือนกันสำหรับการจัดเก็บข้อมูลในการจัดเก็บไนโตรเจนเหลว Dewar จนถึงการกำจัดสำหรับการสังเกต ตัวอย่างถูกโอนย้ายไปให้บริการตัวอย่างการปรับเปลี่ยนและย้ายไปยังฟอร์ด CT1500 HF ระบบการเตรียมการแช่แข็งที่แนบมากับ บริษัท ฮิตาชิ S-4100 สแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน นี่คือตัวอย่างอุณหภูมิถูกยกขึ้นถึง 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อที่จะกัดน้ำผิวดินจากพื้นผิวของตัวอย่าง กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการระบายความร้อนแล้วให้ต่ำกว่า 120 ซีและเคลือบด้วย 5 10 นาโนเมตรของโลหะแพลทินัมใช้แมก Coater ปะทุที่จะทำให้พื้นผิวที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้าและผลผลิตอิเล็กตรอนรองมากขึ้นเมื่อสแกนด้วยลำแสงอิเล็กตรอนในระหว่างการสังเกตใน SEM ตัวอย่างถูกถ่ายโอนไปยังขั้นตอนเย็นใน SEM ที่ 170 C และข้อสังเกตที่มีลำแสงอิเล็กตรอนเร่งแรงดันไฟฟ้าของ 2 กิโลโวลต์ ไมโครได้รับการบันทึกไว้ในโพลารอยด์ประเภท 55P / N ฟิล์ม ตัวอย่างบางส่วนถูกส่งกลับไปยังระบบ cryopreparation หลังจากการสังเกตและร้าวที่ 170 C (ในสุญญากาศ) โดยใช้ใบมีดมีดผ่าตัดเย็น (196 C), การมีปฏิสัมพันธ์ที่จะเห็นภาพภายในของเส้นใยเชื้อรากับเซลล์ต้นโกโก้ สำหรับการสังเกต TEM เนื้อเยื่อจากพืชโกโก้เชื้อที่อธิบายข้างต้นและพืชควบคุมได้รับการแก้ไขเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยการแช่ใน 3% glutaraldehyde-0.05 M โซเดียมบัฟเฟอร์ cacodylate ค่า pH 7.0 พวกเขาถูกวางไว้แล้วลงในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน นี้ตามด้วยการซัก 6 ครั้งในช่วง 1 ชั่วโมงกับบัฟเฟอร์ระบุไว้ข้างต้นโพสต์การแก้ไขใน 2% ออสเมียม tetroxide บัฟเฟอร์เวลา 2 ชั่วโมง, dehyd จัดอันดับในเฒ่า 100% และอีธาน infilt จัดอันดับกับ Spurrs ต่ำ vi scosity ฝังเรซิน บาง (10 นาโนเมตร) ส่วนทองของเนื้อเยื่อ wer e ตัดบน Riech ert / AO Ult racut microtome กับ Diato ฉันมีดเพชรและโม unted บนเนื้อที่ 200 ตาข่าย Ni พวกเขาถูกคราบ ed ด้วยอะซิเตท uranyl 4% และซิเตรตนำ 3% และดูใน H-70 00 Hitach ฉัน TEM ที่ 75 กิโลโวลต์ ไมโครได้รับการบันทึกไว้ในกล้องหลักอัล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . แสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนและศึกษาการแสดงออกของโกโก้
รากต้นกล้าใส่ ( ควบคุม ) และเชื้อที่มีสายพันธุ์และ am7 ba66 และเติบโตภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ จำนวน 1 เดือน หลังจากปลูกเชื้อและใช้ในแสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนศึกษา รากถูกตรวจสอบโดยการส่งผ่าน ( TEM ) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ( SEM ) .สำหรับการสังเกตกล้องจุลทรรศน์แสง , รากและการแสดงออกของพืชปลอดเชื้อถูกตัดด้วยใบมีดคม ย้อมด้วยสารละลาย 1% ของโทลูอิดีนสีฟ้า ติดบนกระจกสไลด์และสังเกตผล . สำหรับ SEM , ต้นกล้าปลอดเชื้อถูกลบออกจากหลอดใช้คีมขนาดใหญ่ และวุ้นส่วนเกินถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้มีดใบมีดตัวอย่างทั้งหมดจะถูกวางไว้บนพื้นผิวของทองแดง ตัวยึด ( 16 29 1.5 มม. ) จำนวนเล็กน้อยของกาวเนื้อเยื่อแช่แข็ง ' ไปยัง ' ถูกนำมาใช้เพื่อยึดติดกับพื้นผิวของชิ้นงานก่อนการใส่ตัวอย่าง ผู้ที่มีวัสดุชิ้นงานได้อย่างรวดเร็ววางไว้บนพื้นผิวของท่อโลหะทองเหลืองสี่เหลี่ยมก่อนลงในไนโตรเจนเหลว ( 196 C ) ภายในกล่องโฟม .กระบวนการตรึงตรึงนี้มีการติดต่อทั้งหมด กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ในการทดลอง หมายเลข , แช่แข็งตัวอย่างผู้ถืออยู่เป็นเหมือนท่อทองเหลืองสี่เหลี่ยมเพื่อเก็บในไนโตรเจนเหลวกระเป๋า ดีวาร์จนถึงการกำจัด เพื่อสังเกตอาการจำนวนโอนเข้ามาแก้ไข ตัวอย่างผู้ให้บริการและย้ายไป Oxford ct1500 HF แช่แข็ง การเตรียมระบบแนบกับบริษัท ฮิตาชิ s-4100 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ที่นี่ตัวอย่างที่อุณหภูมิ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทียก etch น้ำผิวดินจากผิวตัวอย่าง ตัวอย่างก็เย็นแล้วกว่า 120 องศาเซลเซียส และเคลือบด้วยทองคำขาว 5 – 10 nm ของโลหะใช้แมกนิตรอนละล่ำละลักเครื่องเคลือบพื้นผิวด้วยระบบไฟฟ้า เพื่อให้เอื้อต่ออิเล็กตรอนทุติยภูมิเพิ่มเติมเมื่อสแกนด้วยลำแสงอิเล็กตรอนในการสังเกตใน SEM ตัวอย่างที่ถูกโอนไปยังเวทีเย็นใน SEM ที่ 170 องศาเซลเซียส และสังเกตด้วยลำแสงอิเล็กตรอนเร่งแรงดัน 2 KV . micrographs ที่ถูกบันทึกไว้ในกล้องประเภท 55p / n ภาพยนตร์ตัวอย่างบางส่วนถูกส่งกลับไปยังระบบ cryopreparation หลังจากการสังเกตและการหักที่ 170 องศาเซลเซียส ( ใน vacuo ) , ใช้มีดเย็นใบมีด ( 196 C ) เห็นภาพปฏิสัมพันธ์ภายในเส้นใยรา กับ คาเซลล์ สำหรับเต็มๆ สังเกต เนื้อเยื่อพืชที่ปลูกจากเมล็ดของต้นโกโก้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและการควบคุมพืชถูกกำหนดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยการแช่ใน 3 % glutaraldehyde - 005 M โซเดียมจากนั้นนำ buffer , pH 7.0 . พวกเขาถูกวางไว้แล้วในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ในชั่วข้ามคืน นี้ตามด้วยการล้าง 6 ครั้งกว่า 1 ชั่วโมงข้างต้น บัฟเฟอร์ โพสต์คงที่ 2% ในออสเมียม tetroxide 2 H , dehyd สูงสุด 100% และอีธาน ol infilt คะแนน spurrs ต่ำ 6 scosity ฝังเรซิ่นบาง ( 10 nm ) ทอง ส่วน ของ เนื้อเยื่อ คือ E ตัดบน riech ERT / อ่าว ult racut เครื่องตัดชิ้นเนื้อด้วย diato ผมเพชร มีด และ โม unted บนตาข่าย 200 ผมกริด พวกคราบเอ็ดกับยูเรนิลอะซิเตต 4 % และซิเตรทตะกั่ว 3 % และดูใน h-70 00 hitach ผมเตมที่ 75 KV . micrographs ถูกบันทึกโดยกล้องดิจิตอล .