In situ hybridization was performed

In situ hybridization was performed directly on poly-l-Lysineprecoated
microscope slides (Polysine microscope slides; VWR,
Vienna; Klug et al., 2011). Up to 8 sections of paraformaldehydeethanol-
fixed sample material were placed on the slide. The lichen
thallus sections and the soil fragments were carefully flattened
out on the slide under a dissecting microscope (Zeiss, Vienna)
by using two sterile thin needles in order to preserve samples
structure. The samples were dried for 15 min at 46 ◦C. In order to
facilitate the penetration of the FISH probes in the bacterial cells
the samples were treated with 1 mg/ml lysozyme (Sigma–Aldrich,
Teinheim, Germany) for 10 min at room temperature. Thereafter,
the slides were briefly rinsed with 500 l of sterile water. An
ethanol series (50%, 80%, 96% ethanol, each for 3 min) was applied
to dehydrate the samples. The samples were subsequently dries
for few minutes at 46 ◦C after that 100 l of hybridization buffer
(5 M NaCl, 1 M Tris/HCl, 2% SDS, formamide, water) containing fluorescent
labelled oligonucleotide probes (100 ng/l) was applied.
In order to prevent the evaporation of the hybridization buffer,
the slides were enclosed in an incubation chamber for two hours
in the dark at 46 ◦C. Afterwards samples were washed for 15 min
in washing buffer at 37 ◦C and rinsed briefly with cold water
2–3 times to remove residual washing buffer. The FISH probes
required formamide concentrations of the hybridization buffer in
a range between 10 and 45%, and only probes with the same stringency
requirements were applied simultaneously. Probes requiring
different stringency conditions were applied sequentially: the
hybridization was performed first with the FISH probes requiring
the highest stringency, and secondly, after the washing, with
the probe requiring the lower stringency conditions. After the
final washing with water, the slides were quickly air-dried with
compressed air. Samples were mounted with the ProLong Gold
antifadent solution (Molecular Probes, Vienna) to avoid the fading
of the fluorescence of the probes. A cover slip was placed on top
and the samples were stored overnight in the dark and then sealed
with nail polish.
FISH experiments

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำใน situ hybridization บนโพลี-l-Lysineprecoatedภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ (ภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ Polysine VWRเวียนนา Klug et al., 2011) ถึง 8 ส่วนของ paraformaldehydeethanol-วัสดุตัวอย่างถาวรถูกวางบนภาพนิ่ง ฝอยส่วน thallus และบางส่วนของดินได้อย่างรอบคอบ flattenedออกบนภาพนิ่งภายใต้กล้องจุลทรรศน์ dissecting (Zeiss เวียนนา)โดยใช้เข็มบางใส่สองเพื่อเก็บตัวอย่างโครงสร้างการ ตัวอย่างที่แห้งใน 15 นาทีที่ 46 ◦C ในอันที่จะช่วยในการเจาะของคลิปปากตะเข้ปลาในเซลล์แบคทีเรียตัวอย่างได้รับการรักษา ด้วย lysozyme 1 mg/ml (ซิก-AldrichTeinheim เยอรมนี) ใน 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้นภาพนิ่งมีสั้น ๆ rinsed ด้วย l 500 กระบอกน้ำ มีชุดเอทานอล (50%, 80%, 96% เอทานอล ละ 3 นาที) ใช้การ dehydrate ตัวอย่าง ตัวอย่างดีในเวลาต่อมาแห้งไม่กี่นาทีที่ 46 ◦C หลัง l ที่ 100 hybridization บัฟเฟอร์(5 M NaCl, 1 M ตรี/HCl, 2% SDS, formamide น้ำ) ประกอบด้วยฟลูออเรสเซนต์มันคลิปปากตะเข้ oligonucleotide (100 ng / l) ถูกนำไปใช้เพื่อป้องกันการระเหยของบัฟเฟอร์ hybridizationภาพนิ่งที่อยู่ในห้องบ่มสองชั่วโมงในมืดที่ 46 ◦C หลังจาก ตัวอย่างถูกล้างใน 15 นาทีล้างบัฟเฟอร์ที่ 37 ◦C และ rinsed สั้น ๆ ด้วยน้ำเย็น2 – 3 ครั้งเพื่อเอาส่วนที่เหลือล้างบัฟเฟอร์ คลิปปากตะเข้ปลาformamide ต้องความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ hybridization ในช่วงระหว่าง 10 และ 45% และคลิปปากตะเข้เท่ากับ stringency เดียวกันความต้องถูกนำไปใช้กัน คลิปปากตะเข้ต้องใช้เงื่อนไข stringency แตกต่างกันตามลำดับ: การhybridization ทำก่อน ด้วยคลิปปากตะเข้ปลาที่ต้องการstringency สูงสุด และประการที่สอง ซัก ผ้า มีโพรบต้องการเงื่อนไข stringency ล่าง หลังจากสุดท้ายล้าง ด้วยน้ำ ภาพนิ่งถูก air-dried อย่างรวดเร็วด้วยอากาศอัด ตัวอย่างที่ติดกับทองทันโซลูชั่น antifadent (Probes โมเลกุล เวียนนา) เพื่อหลีกเลี่ยงการเลือนหายไปของ fluorescence ของคลิปปากตะเข้ ใบปกที่อยู่ด้านบนและตัวอย่างเก็บไว้ค้างคืนในมืดนั้นมียาทาเล็บปลาทดลอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในแหล่งกำเนิดพันธุ์ได้ดำเนินการโดยตรงบนโพลี l-Lysineprecoated
สไลด์กล้องจุลทรรศน์ (Polysine สไลด์กล้องจุลทรรศน์; VWR,
เวียนนา. Klug et al, 2011) ถึง 8 ในส่วนของ paraformaldehydeethanol-
วัสดุตัวอย่างคงที่ถูกวางไว้บนสไลด์ ตะไคร่
thallus
ส่วนและเศษดินบี้อย่างรอบคอบออกมาในสไลด์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์(ที่ Zeiss, เวียนนา) โดยใช้สองเข็มบางหมันเพื่อที่จะรักษาตัวอย่างโครงสร้าง กลุ่มตัวอย่างแห้งเป็นเวลา 15 นาทีที่ 46 ◦C เพื่อที่จะอำนวยความสะดวกในการเจาะของยานสำรวจปลาในเซลล์แบคทีเรียกลุ่มตัวอย่างได้รับการรักษา1 mg / ml ไลโซไซม์ (Sigma-Aldrich, Teinheim, เยอรมนี) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้นภาพนิ่งที่ถูกล้างในเวลาสั้น ๆ กับ 500 ลิตรน้ำหมัน ชุดเอทานอล (50%, 80% เอทานอล 96% แต่ละคนเป็นเวลา 3 นาที) ถูกนำมาใช้ในการคายน้ำตัวอย่าง กลุ่มตัวอย่างเป็นแห้งต่อมาไม่กี่นาทีที่ 46 หลังจากนั้น◦C 100 ลิตรบัฟเฟอร์ผสมพันธุ์ (5 M NaCl 1 M Tris / HCl, 2% SDS, formamide น้ำ) ที่มีการเรืองแสงฟิวส์oligonucleotide ติดป้าย (100 ng /? ลิตร ) ถูกนำมาใช้. เพื่อป้องกันการระเหยของบัฟเฟอร์พันธุ์ที่ภาพนิ่งที่ถูกปิดล้อมอยู่ในห้องบ่มสำหรับสองชั่วโมงในที่มืดที่46 ◦C หลังจากนั้นถูกล้างตัวอย่างนาน 15 นาทีในบัฟเฟอร์ซักผ้าที่อุณหภูมิ37 ◦Cสั้น ๆ และล้างด้วยน้ำเย็น2-3 ครั้งเพื่อเอาบัฟเฟอร์ซักผ้าที่เหลือ โพรบปลาที่ต้องการความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ formamide ผสมพันธุ์ในช่วงระหว่างวันที่10 และ 45% และโพรบเท่านั้นที่มีความเข้มงวดเดียวกันความต้องการถูกนำไปใช้ในเวลาเดียวกัน พร็อบที่ต้องใช้เงื่อนไขที่เข้มงวดที่แตกต่างกันถูกนำไปใช้ตามลำดับที่: พันธุ์เป็นครั้งแรกกับยานสำรวจปลาที่ต้องเข้มงวดสูงสุดและประการที่สองหลังจากที่ซักผ้าด้วยสอบสวนต้องต่ำกว่าเงื่อนไขที่เข้มงวด หลังจากที่ซักผ้าด้วยน้ำสุดท้ายสไลด์ได้อย่างรวดเร็วอากาศแห้งด้วยอากาศอัด ตัวอย่างที่ติดตั้งอยู่กับยืดทองแก้ปัญหา antifadent (Probes โมเลกุลเวียนนา) เพื่อหลีกเลี่ยงการซีดจางของการเรืองแสงของยานสำรวจที่ ลื่นฝาครอบที่วางอยู่ด้านบนและตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ค้างคืนในที่มืดและปิดผนึกแล้วกับยาทาเล็บ. ปลาทดลอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ใน situ hybridization แสดงโดยตรงบน poly-l-lysineprecoated
สไลด์กล้องจุลทรรศน์ ( Microscope polysine อนาคีเมีย เวียนนา , ภาพนิ่ง ;
; คลัก et al . , 2011 ) ถึง 8 ส่วนของ paraformaldehydeethanol -
คงที่ ตัวอย่างวัสดุที่ถูกวางไว้บนสไลด์ พวกไลเคน
แทลลัสส่วนและดินชิ้นส่วนถูกแบนออกอย่างระมัดระวัง
บนสไลด์ใต้ผ่ากล้องจุลทรรศน์ , เวียนนา )
โดยใช้สองเข็มบางหมัน เพื่อรักษาสภาพตัวอย่าง
โครงสร้าง ตัวอย่างแห้ง 15 นาทีที่ 46 ◦ C เพื่อความสะดวกในการซึมผ่านของปลา

) ในเซลล์แบคทีเรีย จำนวนรับ 1 มก. / มล. และไลโซไซม์ ( Sigma ) Aldrich
teinheim , เยอรมนี ) สำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้น
สไลด์ได้สั้น ๆล้างด้วย 500  ลิตรน้ำหมัน
เป็นชุดเอทานอล ( 50% , 80% , เอทานอล , 96% ละ 3 นาที ) คือใช้
dehydrate ตัวอย่าง ตัวอย่างต่อมาแห้ง
สำหรับไม่กี่นาทีที่ 46 ◦ C หลังจากนั้น 100  ลิตร ( บัฟเฟอร์
5 M NaCl 1 M โดย / HCl 2 % SDS , ฟอร์มาไมด์ , น้ำที่มีหลอด
ข้อความ ซึ่งวิธีการ ( 100 ng /  L ) คือใช้
เพื่อป้องกันการระเหย ของ hybridization buffer ,
สไลด์กำลังอยู่ในห้องฟักไข่เป็นเวลาสองชั่วโมง
ในความมืดที่ 46 ◦ C หลังจากนั้นจำนวนซัก 15 นาที
ล้างบัฟเฟอร์ ที่ 37 ใน◦ C และล้างด้วยน้ำเย็นๆ (
2 3 ครั้งเพื่อลบตกค้างล้างบัฟเฟอร์ ปลาวัดความเข้มข้นของสารที่ต้องการ Formamide

บัฟเฟอร์ในช่วงระหว่าง 10 และร้อยละ 45 และฟิวส์ด้วย
stringency เดียวกันความต้องการที่ถูกใช้พร้อมกัน จึงมีเงื่อนไขต่าง ๆที่ใช้เป็น stringency
:
( ทำครั้งแรกกับปลาจึงต้อง
stringency สูงสุด และประการที่สอง หลังจากล้างด้วย
stringency สอบสวนต้องสภาพลดลง หลังจาก
ล้างครั้งสุดท้ายกับน้ำภาพนิ่งได้อย่างรวดเร็วอากาศแห้งกับ
อากาศอัดตัวอย่างติดกับยืดโซลูชั่น antifadent ทอง
( โมเลกุลโพรบ , เวียนนา ) เพื่อหลีกเลี่ยงการซีดจาง
ของเรืองแสงของฟิวส์ . ปกใบถูกวางไว้บนด้านบน
และตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ค้างคืนในที่มืดและปิดผนึกแล้ว

ปลาทดลองกับยาทาเล็บ