better fit of the experimental data

better fit of the experimental data and allowed the rate of cleavage
of the probe by DTT to be determined more accurately (lower
standard error). A calibration plot of the initial rate of increase in
fluorescence intensity versus time was constructed and was found
to be directly proportional to the amount of DTT added over at
least 4 orders of magnitude of FSSF concentration (Figure 2C).
This large dynamic range should make FSSF useful for the
determination of free thiol concentration in a variety of different
applications, such as the quantification of cysteine-containing
peptides (e.g., haptens) in solution or the determination of thiols
inside cells.
Fluorometric GR Assay. The fluorometric GR assay was
performed in essentially the same manner as the standard
colorimetric assay by simply exchanging DTNB with FSSF.
Solutions containing GSSG, FSSF, and NADPH were treated with
varying amounts of GR from 0.05 to 2 mU mL-1, and the
fluorescence intensity of each solution was recorded as a function
of time (Figure 3). The sigmoidal shape of the progress curves
results from the enzymatic production of GSH being considerably
faster than the subsequent cleavage of FSSF. However, the data
obtained were easily fitted to a five-component reaction model (2)
using nonlinear least-squares regression with the Dynafit program.
GSSG and NADPH were present in excess throughout all the
experiments, and hence, the enzymatic cleavage of GSSG by GR
to give GSH was approximated to a one-step reaction to simplify
the analysis. The cleavage of FSSF by GSH
was also approximated to a one-step reaction in a manner
analogous to the DTT cleavage reaction. The rate constants for
photobleaching of FSSG (kpb1) and FSSF (kpb2) were fixed to the
values obtained in the DTT cleavage experiments, thereby
allowing the values of kcat and k2 to be calculated by nonlinear
least-squares regression (Table 1). The overall fit of the model
was then further improved by including a reaction to account for
the slow denaturation of the enzyme during the course of the
experiment (kden).
Due to the lag phase at the beginning of the assay, the initial
rates of fluorescence increase after GR is added are unsuitable
for constructing a calibration plot to determine GR concentration.
However, as the concentration of GSH builds up following
enzymatic hydrolysis of GSSG, the maximum rate of increase in
fluorescence intensity is proportional to the concentration of GR
added. Double-reciprocal plots of the maximum rates of increase
in fluorescence intensity vs time (Figure 3B) were found to be
linear between 0.05 and 2 mU mL-1 of GR for all concentrations
of FSSF tested and hence are suitable calibration plots for
determining unknown GR concentrations within this range and
possibly well outside this range. The commercially available kit
Figure 2. Fluorescence intensity of (A) 10 íM and (B) 10 nM FSSF
in 100 mM K3PO4, 1 mM EDTA, pH 7.5, after addition of DTT at room
temperature. Calibration plot (C) showing the initial rate of increase
in fluorescence intensity of FSSF solutions in 100 mM K3PO4, 1 mM
EDTA, pH 7.5, after addition of DTT (0.1-10 mM) at room temperature.
Table 1. Rate Constants Obtained from Dynafit Partial
Least-Squares Regression Analysis of the GR Assay
Dataa
rate
constant value UNITS
k1 (1.1109 ( 0.0008)  10-7 L ímol-1 s-1
kcat 11.78 ( 0.04 L ímol-1 s-1
k2 (4.308 ( 0.004)  10-12 L2 ímol-2 s-1
kpb1 (9.07 ( 0.05)  10-6 s-1
kpb2 (1.97 ( 0.04)  10-6 s-1
kden (3.06 ( 0.01)  10-5 s-1
a The errors shown are standard errors for the rate constants, as
calculated by Dynafit.
GSSG + GR f 2 GSH + GR (kcat) (2)
2GSH + FSSF f 2 FSSG (k2)
FSSG f photobleached FSSG (kpb1)
FSSF f photobleached FSSF (kpb2)
GR f denatured GR (kden)
8772 Analytical Chemistry, Vol. 79, No. 22, November 15, 2007

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พอดีข้อมูลทดลองดีกว่า และอนุญาตให้อัตราของปริของโพรบโดย DTT จะแจ้งแม่นยำมาก (ต่ำกว่ามาตรฐานข้อผิดพลาด) พล็อตเทียบอัตราเริ่มต้นของเพิ่มขึ้นถูกสร้างขึ้น และพบความ fluorescence เมื่อเทียบกับเวลาเป็นสัดส่วนโดยตรงกับจำนวนของ DTT เพิ่มช่วงที่น้อยที่สุด 4 อันดับของขนาดของความเข้มข้น FSSF (รูปที่ 2C)ช่วงนี้ขนาดใหญ่ควรทำ FSSF มีประโยชน์สำหรับการกำหนดความเข้มข้น thiol ฟรีหลากหลายแตกต่างกันโปรแกรมประยุกต์ เช่นนับของที่ประกอบด้วย cysteineเปปไทด์ (เช่น haptens) ในการแก้ปัญหาหรือกำหนด thiolsภายในเซลล์Fluorometric GR วิเคราะห์ ถูกทดสอบ GR fluorometricทำเป็นอย่างเดียวกันเป็นมาตรฐานวิเคราะห์เทียบเคียง ด้วยการเพียงแค่แลกเปลี่ยน DTNB กับ FSSFประกอบด้วย GSSG, FSSF และ NADPH โซลูชั่นได้รับการรักษาด้วยแตกต่างกันที่จำนวนของ GR จาก 0.05 mL หมู่ 2-1 และfluorescence ความเข้มของแต่ละถูกบันทึกเป็นฟังก์ชันเวลา (รูปที่ 3) รูปร่างของเส้นโค้งความคืบหน้า sigmoidalผลจากการผลิตเอนไซม์ในระบบของ GSH ถูกมากเร็วกว่าปริต่อมาของ FSSF อย่างไรก็ตาม ข้อมูลรับไม่ได้พอดีกับแบบห้าส่วนปฏิกิริยา (2)ถดถอยกำลังสองน้อยสุดไม่เชิงเส้นด้วยโปรแกรม DynafitGSSG และ NADPH ปัจจุบันเหลือทั่วทุกการทดลอง และด้วยเหตุ นี้ ปริเอนไซม์ในระบบของ GSSG โดย GRให้ GSH ถูกเลียนแบบให้ปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวเพื่อลดความซับซ้อนการวิเคราะห์การ ความแตกแยกของ FSSF โดย GSHยังได้เลียนแบบการปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวอย่างคล้ายคลึงกับปฏิกิริยาปริ DTT ค่าคงที่อัตราการphotobleaching FSSG (kpb1) และ FSSF (kpb2) ก็คงต้องการค่าที่ได้ในการทดลองปริ DTT จึงทำให้ค่าของ kcat และ k2 จะคำนวณ โดยการไม่เชิงเส้นถดถอยกำลังสองน้อยสุด (ตารางที่ 1) พอดีโดยรวมของแบบจำลองถูกแล้วเพิ่มเติมขึ้นโดยปฏิกิริยาการdenaturation ช้าของเอนไซม์ในระหว่างการทดลอง (kden)เนื่องจากขั้นตอนความล่าช้าที่เริ่มต้นของการทดสอบ การเริ่มต้นราคาของ fluorescence ขึ้นหลังจากเพิ่ม GR จะไม่เหมาะสมการสร้างแผนการปรับเทียบการกำหนดความเข้มข้นของ GRอย่างไรก็ตาม เป็นความเข้มข้นของ GSH สร้างค่าต่อไปนี้ไฮโตรไลซ์เอนไซม์ในระบบของ GSSG เพิ่มขึ้นในอัตราสูงสุดfluorescence เข้มข้นเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของ GRเพิ่ม ผืนคู่ซึ่งกันและกันของราคาสูงสุดของเพิ่มขึ้นfluorescence ความเข้มเทียบกับเวลา (รูปที่ 3B) พบเป็นเชิงเส้นระหว่าง 0.05 และหมู่ 2 mL-1 ของ GR สำหรับความเข้มข้นทั้งหมดของ FSSF ทดสอบ และจึง มีผืนเทียบเหมาะสำหรับกำหนดความเข้มข้น GR ไม่รู้จักภายในช่วงนี้ และดีอาจอยู่นอกช่วงนี้ ชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์รูปที่ 2 Fluorescence ความเข้มของ íM 10 (A) และ (ข) 10 nM FSSFใน 100 มม. K3PO4, 1 mM EDTA, pH 7.5 หลังจากนี้ของ DTT ห้องอุณหภูมิ แผนการปรับเทียบ (C) แสดงอัตราเริ่มต้นขึ้นความเข้ม fluorescence โซลูชั่น FSSF ใน K3PO4, 1 mM 100 mMEDTA, pH 7.5 หลังจากนี้ของ DTT (0.1-10 mM) ที่อุณหภูมิห้องตารางที่ 1 ค่าคงที่อัตราที่ได้รับจาก Dynafit บางส่วนวิเคราะห์การถดถอยแบบกำลังสองน้อยสุดของทดสอบ GRDataaอัตราค่าคงหน่วยk1 (1.1109 (0.0008) 10-7 L ímol-1 s-1kcat 11.78 (0.04 L ímol-1 s-1k2 (4.308 (0.004) 10-12 L2 ímol 2 s-1kpb1 (9.07 (0.05) 10-6 s-1kpb2 (1.97 (0.04) 10-6 s-1kden (3.06 (0.01) 10-5 s-1มีข้อผิดพลาดที่แสดงเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าคงที่อัตราคำนวณ โดย DynafitGSSG + GR f 2 GSH + GR (kcat) (2)2GSH + FSSF f 2 FSSG (k2)FSSG f photobleached FSSG (kpb1)FSSF f photobleached FSSF (kpb2)GR f denatured GR (kden)เคมีวิเคราะห์ 8772 ปีที่ 79 หมายเลข 22, 15 พฤศจิกายน 2007

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พอดีที่ดีขึ้นของข้อมูลการทดลองและได้รับอนุญาตอัตราการแตกแยก
ของหัวด้วย DTT จะถูกกำหนดขึ้นอย่างถูกต้อง (ต่ำกว่า
ข้อผิดพลาดมาตรฐาน) พล็อตของการสอบเทียบอัตราการเริ่มต้นของการเพิ่มขึ้นในการ
เรืองแสงความเข้มเมื่อเทียบกับเวลาที่ถูกสร้างขึ้นและได้รับการค้นพบ
จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของ DTT เพิ่มมากกว่าที่
อย่างน้อย 4 คำสั่งของขนาดของความเข้มข้น FSSF (รูปที่ 2C).
นี้ช่วงแบบไดนามิกที่มีขนาดใหญ่ควรจะทำ FSSF ประโยชน์สำหรับ
ความมุ่งมั่นของความเข้มข้น thiol ฟรีในความหลากหลายของที่แตกต่างกัน
การใช้งานเช่นปริมาณของ cysteine ​​ที่มี
เปปไทด์ (เช่น haptens) ในการแก้ปัญหาหรือการตัดสินใจของ thiols
ภายในเซลล์.
ฟลูออโร GR Assay ทดสอบ GR ฟลูออโรได้รับการ
ดำเนินการในเป็นหลักเช่นเดียวกับมาตรฐาน
การทดสอบสีโดยเพียงแค่การแลกเปลี่ยน DTNB กับ FSSF.
โซลูชั่นที่มี GSSG, FSSF และ NADPH ได้รับการรักษาที่มี
จำนวนแตกต่างกันของ GR 0.05-2 mU mL-1, และ
เรืองแสง ความรุนแรงของการแก้ปัญหาแต่ละบันทึกเป็นฟังก์ชั่น
ของเวลา (รูปที่ 3) รูปร่าง sigmoidal ของความคืบหน้าโค้ง
ผลลัพธ์ที่ได้จากการผลิตเอนไซม์ของ GSH เป็นอย่างมาก
เร็วกว่าที่ตามมาของความแตกแยก FSSF อย่างไรก็ตามข้อมูล
ที่ได้มาติดตั้งได้อย่างง่ายดายเพื่อรูปแบบปฏิกิริยาห้าส่วน (2)
การใช้กำลังสองน้อยที่สุดแบบไม่เชิงเส้นถดถอยกับโปรแกรม Dynafit.
GSSG และ NADPH อยู่ในปัจจุบันในส่วนที่เกินมาตลอด
การทดลองและด้วยเหตุนี้ความแตกแยกของเอนไซม์ GSSG โดย GR
จะให้ GSH ถูกห้วงที่จะเกิดปฏิกิริยาขั้นตอนหนึ่งที่จะลดความซับซ้อนของ
การวิเคราะห์ ความแตกแยกของ FSSF โดย GSH
ก็ประมาณที่จะเกิดปฏิกิริยาขั้นตอนหนึ่งในลักษณะที่
คล้ายคลึงกับปฏิกิริยาความแตกแยก DTT ค่าคงที่สำหรับ
photobleaching ของ FSSG (kpb1) และ FSSF (kpb2) ได้รับการแก้ไขเพื่อให้
ค่าที่ได้ในการทดลองความแตกแยก DTT จึง
ช่วยให้ค่าของ kcat และ k2 จะคำนวณโดยไม่เชิงเส้น
อย่างน้อยสี่เหลี่ยมถดถอย (ตารางที่ 1) พอดีโดยรวมของรูปแบบ
จากนั้นก็ปรับตัวดีขึ้นต่อไปโดยรวมถึงการตอบสนองต่อบัญชีสำหรับ
denaturation ช้าของเอนไซม์ในระหว่างการ
ทดลอง (kden).
เนื่องจากขั้นตอนการล่าช้าที่จุดเริ่มต้นของการทดสอบที่เริ่มต้น
อัตราการเรืองแสง เพิ่มขึ้นหลังจากที่มีการเพิ่ม GR ไม่เหมาะสม
สำหรับการสร้างพล็อตการสอบเทียบเพื่อตรวจสอบความเข้มข้น GR.
แต่เป็นความเข้มข้นของ GSH สร้างขึ้นดังต่อไปนี้
ย่อยโปรตีนของ GSSG อัตราสูงสุดของการเพิ่มขึ้นในการ
เรืองแสงความเข้มเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของ GR
เพิ่ม แปลงคู่ซึ่งกันและกันของอัตราสูงสุดของการเพิ่ม
ความรุนแรงในการเรืองแสง vs เวลา (รูปที่ 3B) พบว่ามี
เส้นตรงระหว่าง 0.05 และ 2 mU ML-1 จาก GR สำหรับทุกความเข้มข้น
ของ FSSF ทดสอบและด้วยเหตุนี้จะแปลงการสอบเทียบที่เหมาะสมสำหรับ
การกำหนดที่ไม่รู้จัก GR ความเข้มข้นในช่วงนี้และ
อาจจะดีนอกช่วงนี้ ชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์
รูปที่ 2 เรืองแสงความเข้มของ (A) 10 IM และ (B) 10 นาโนเมตร FSSF
ใน 100 มิลลิ K3PO4, EDTA 1 มิลลิพีเอช 7.5 หลังจากที่การเพิ่มขึ้นของ DTT ณ ห้อง
อุณหภูมิ พล็อตการสอบเทียบ (C) แสดงให้เห็นถึงอัตราการเริ่มต้นของการเพิ่มขึ้น
ในการเรืองแสงความเข้มของการแก้ปัญหาใน FSSF 100 มิลลิ K3PO4 1 มิลลิ
EDTA, ค่า pH 7.5 หลังจากที่การเพิ่มขึ้นของ DTT (0.1-10 มิลลิเมตร) อุณหภูมิห้อง.
ตารางที่ 1 อัตราคงที่ที่ได้รับจาก Dynafit บางส่วน
อย่างน้อยสี่เหลี่ยมถดถอยวิเคราะห์ GR Assay
Dataa
อัตรา
หน่วยค่าคงที่
k1 (1.1109 (0.0008) 10-7 L-1 ชม s-1
kcat 11.78 (0.04 ชม L-1 s-1
k2 (4.308 (0.004) ? 10-12 L2 ชม-2 s-1
kpb1 (9.07 (0.05) 10-6 s-1
kpb2 (1.97 (0.04) 10-6 s-1
kden (3.06 (0.01)? 10-5 s-1
ข้อผิดพลาดที่แสดงเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐานสำหรับค่าคงที่ตามที่
คำนวณโดย Dynafit.
GSSG + GR F 2 GSH + GR (kcat) (2)
2GSH + FSSF F 2 FSSG (k2)
FSSG ฉ photobleached FSSG (kpb1)
FSSF ฉ photobleached FSSF (kpb2)
GR ฉเอทิลแอลกอฮอล์ GR (kden)
8772 เคมีวิเคราะห์ฉบับ. 79, ฉบับที่ 22, 15 พฤศจิกายน 2007

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีกว่า พอดีของการทดลองและให้คะแนนของความแตกแยก
ของโพรบ โดยส่วนที่จะตัดสินใจถูกต้องมากขึ้น ( ลด
ข้อผิดพลาดมาตรฐาน ) การสอบเทียบแปลงอัตราเริ่มต้นของการเพิ่มขึ้นในความเข้มเมื่อเทียบกับเวลาที่ผู้วิจัยสร้าง ขึ้น

ไปและพบว่าเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของส่วนเพิ่มที่
คำสั่งของขนาดของ fssf ความเข้มข้นอย่างน้อย 4 ( รูป
2C )ช่วงแบบไดนามิกที่มีขนาดใหญ่นี้ควรให้ fssf ประโยชน์สำหรับการหาปริมาณไทออลอิสระ

ในความหลากหลายของการใช้งานที่แตกต่างกัน เช่น ปริมาณของกรดอะมิโนเปปไทด์ประกอบด้วย
( เช่น haptens ) ในการแก้ปัญหาหรือการหา thiols

ภายในเซลล์ fluorometric กรัม ตามลำดับ ( GR fluorometric คือ
ดำเนินการในหลักเดียวกันลักษณะเป็นมาตรฐาน
โดย โดยเพียงแค่การแลกเปลี่ยน dtnb 7.4 กับ fssf .
โซลูชั่นที่มี gssg fssf , และได้รับการรักษาด้วย nadph
ตามจํานวนของ GR จาก 0.05 2 หมู่แน่นอน และความเข้มของแต่ละโซลูชั่น
การบันทึกเป็นฟังก์ชัน
เวลา ( รูปที่ 3 ) รูปร่างของเส้นโค้ง sigmoidal
ความคืบหน้าผลจากการผลิตเอนไซม์ของ GSH ถูกมาก
เร็วกว่าตัวที่ตามมาของ fssf . อย่างไรก็ตาม ข้อมูลที่ได้มีการติดตั้งได้อย่างง่ายดาย
5 องค์ประกอบปฏิกิริยาแบบ ( 2 )
โดยใช้วิธีการถดถอยเชิงเส้นด้วยโปรแกรม dynafit .
gssg และ nadph อยู่ในส่วนเกินตลอด
การทดลอง และดังนั้น โดยตัวของ gssg โดย GR
ให้ GSH คือโดยประมาณ เพื่อลดปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว
วิเคราะห์ลึกของ fssf โดย GSH
ก็โดยประมาณเป็นปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวในลักษณะคล้ายคลึงกับ DTT
ตัวปฏิกิริยา ค่าคงที่สำหรับ
photobleaching ของ fssg ( kpb1 ) และ fssf ( kpb2 ) มีค่าคงที่
ได้ในส่วนการการทดลองจึง
ให้คุณค่าของ kcat และ K2 จะคำนวณโดยวิธีสมการถดถอยเชิงเส้น
( ตารางที่ 1 )พอดีโดยรวมของรูปแบบ
แล้วปรับปรุงเพิ่มเติม โดยรวมถึงปฏิกิริยาบัญชี
( ช้าของเอนไซม์ในระหว่างการทดลอง ( kden )
.
เนื่องจากการ lag phase ที่จุดเริ่มต้นของการทดสอบ , อัตราการเพิ่มขึ้นหลังจากที่เริ่มต้น

สำหรับ GR เป็นไม่เหมาะสมการสอบเทียบการตรวจสอบความเข้มข้นของพล็อต GR .
อย่างไรก็ตามขณะที่ความเข้มข้นของ GSH สร้างขึ้นต่อไปนี้
การย่อยเอนไซม์ของ gssg , สูงสุดอัตราการเพิ่มขึ้นในความเข้ม
การเป็นสัดส่วนกับปริมาณ GR
เพิ่ม คู่ซึ่งกันและกันแปลงของอัตราสูงสุดของการเพิ่มขึ้นในความเข้ม VS
( รูปที่ 3B ) พบว่ามี
เชิงเส้นระหว่าง 0.05 และ 2 หมู่แน่นอนของ GR สำหรับความเข้มข้น
ของ fssf ทดสอบและด้วยเหตุนี้จะแปลงการกำหนดปริมาณที่เหมาะสมสำหรับ
GR ในระยะนี้อาจจะดีและ
นอกช่วงนี้ การใช้ในเชิงพาณิชย์ชุด
รูปที่ 2 ความเข้มของการเรืองแสง ( ) 10 í m และ ( ข ) 10 nm fssf
ใน k3po4 100 มม. , 1 mM EDTA pH 7.5 , หลังจากเพิ่มส่วนที่อุณหภูมิห้อง

พล็อตการสอบเทียบ ( C ) แสดงอัตราการเพิ่ม
ในเรือง ความเข้มของ fssf โซลูชั่นใน k3po4 100 มม. , 1 มม.
EDTA pH 7.5 , หลังจากเติม DTT ( 0.1-10 มม. ) ที่อุณหภูมิห้อง
โต๊ะ 1 ค่าคงที่อัตราที่ได้จากการวิเคราะห์การถดถอยกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน
dynafit ของ GR )


dataa อัตราคงที่ค่าหน่วย
K1 ( 1.1109 ( ยว )  10-7 L í mol-1 ที่สุด
kcat 11.78 ( 0.04 L í mol-1 ที่สุด
K2 ( 4.308 ( น้ำ )  10-12 L2 í mol-2 ที่สุด
kpb1 ( 9.07 ( 0 .05 ) สามารถ  ที่สุด
kpb2 ( 1.97 ( 0.04 ) สามารถ  ที่สุด
kden ( 3.06 ( 0.01 )  10-5 ที่สุด
เป็นข้อผิดพลาดที่แสดงข้อผิดพลาดมาตรฐานสำหรับค่าคงที่เป็นคำนวณโดย dynafit
.
gssg GR F 2 GSH GR ( kcat ) ( 2 )
2gsh fssf F fssg ( 2 K2 F )
fssg photobleached fssg ( kpb1 )
fssf fssf F photobleached ( kpb2 )
GR F ใช้ GR ( kden )
8772 เคมีวิเคราะห์ ฉบับที่ 79 , หมายเลข 22 , พฤศจิกายน 15 , 2007