2.2 DNA extraction, amplification a

2.2 DNA extraction, amplification and sequencing

Total genomic DNA was extracted from leaf material using a cetyltrimethylammonium bromide (CTAb) procedure (Doyle and Doyle, 1987) modified using primers phyc515f-br AAG CCC TTY TAC GCT ATC CTG CAC CG and phyc1699r-br ATW GCA TCC ing (phyc974f-br GCT CCT CAC GGC TGC CAC GCT CA and phyc1145r-mo CCT GMA RCA RGA ACT CAC AAG CAT ATC).The trnL-trnF and trnH-psbA regions were amplified using universal primers described in Shaw et al. (2005) and Sang et al. (1997). respectively. The two plastid regions and the nuclear gene were chosen because they have proven to be most informative markers for Bromeliaceae (e.g. Barfuss et al. 2005: trnL-trnF; Givnish et al. 2011: trnL-trnF, trnH-psbA; Jabaily and Sytsma, 2010: PHYC). Amplifications were carried out in aVeriti Thermal Cycler (Applied Biosystem Corp., Foster City. California). Plastid regions were amplified with 10 µL reactions following Palma-Silva et al, (2009). The nuclear region PHYC was amplified with 10 µL as follows: 1x taq buffer (Fermentas), 1.5 mM MgCl2 (Fermentas), 100 µmol deoxynucleotide triphosphate, 10 pmol of each primer, 1 U Taq DNA polymerase (Fermentas) and 10-20 ng of DNA template, using a standard cycling program: 2 min denaturation at 95 °C denaturation for 30 s, 30 s annealing at 59 °C, and 2 min. The PCR products were cleaned using ExoSAP-IT (USB Corp., Cleveland, Ohio) following the manufacturer’s protocol. Cycle sequencing was carried out with the Big Dye Terminaator kit v.3.1 (Applied Biosystem Corp., Foster City. California) with an initial 60 s denaturation at 95 °C, followed by 30 cycles at 96 °C denaturation for 10 s, 10 s annealing at 50 °C, and 2 min extension at 60 °C. The sequences were generated on an ABI 3730 DNA Analyzer seqencer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2 ดีเอ็นเอแยก ขยาย และจัดลำดับ Total genomic DNA was extracted from leaf material using a cetyltrimethylammonium bromide (CTAb) procedure (Doyle and Doyle, 1987) modified using primers phyc515f-br AAG CCC TTY TAC GCT ATC CTG CAC CG and phyc1699r-br ATW GCA TCC ing (phyc974f-br GCT CCT CAC GGC TGC CAC GCT CA and phyc1145r-mo CCT GMA RCA RGA ACT CAC AAG CAT ATC).The trnL-trnF and trnH-psbA regions were amplified using universal primers described in Shaw et al. (2005) and Sang et al. (1997). respectively. The two plastid regions and the nuclear gene were chosen because they have proven to be most informative markers for Bromeliaceae (e.g. Barfuss et al. 2005: trnL-trnF; Givnish et al. 2011: trnL-trnF, trnH-psbA; Jabaily and Sytsma, 2010: PHYC). Amplifications were carried out in aVeriti Thermal Cycler (Applied Biosystem Corp., Foster City. California). Plastid regions were amplified with 10 µL reactions following Palma-Silva et al, (2009). The nuclear region PHYC was amplified with 10 µL as follows: 1x taq buffer (Fermentas), 1.5 mM MgCl2 (Fermentas), 100 µmol deoxynucleotide triphosphate, 10 pmol of each primer, 1 U Taq DNA polymerase (Fermentas) and 10-20 ng of DNA template, using a standard cycling program: 2 min denaturation at 95 °C denaturation for 30 s, 30 s annealing at 59 °C, and 2 min. The PCR products were cleaned using ExoSAP-IT (USB Corp., Cleveland, Ohio) following the manufacturer’s protocol. Cycle sequencing was carried out with the Big Dye Terminaator kit v.3.1 (Applied Biosystem Corp., Foster City. California) with an initial 60 s denaturation at 95 °C, followed by 30 cycles at 96 °C denaturation for 10 s, 10 s annealing at 50 °C, and 2 min extension at 60 °C. The sequences were generated on an ABI 3730 DNA Analyzer seqencer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การสกัดดีเอ็นเอขยายและลำดับดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากวัสดุใบใช้โบรไมด์cetyltrimethylammonium (CTAB) ขั้นตอน (ดอยล์และดอยล์ 1987) ปรับเปลี่ยนโดยใช้ไพรเมอร์ phyc515f-br AAG CCC TTY TAC GCT ATC CTG CAC CG และ phyc1699r-br ATW GCA ทีซีซีไอเอ็นจี (phyc974f-br จีซีทีซีซีที CAC CAC GGC TGC GCT CA และ phyc1145r โมซีซีทีอาร์ซีเอย่า RGA ACT CAC AAG CAT ATC) ได้โดยเริ่มต้น trnL-trnF และภูมิภาค trnH-psbA ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากลที่อธิบายไว้ในชอว์, et al (2005) และซาง et al, (1997) ตามลำดับ ทั้งสองภูมิภาค plastid และยีนนิวเคลียร์ได้รับการแต่งตั้งเพราะพวกเขาได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องหมายของข้อมูลมากที่สุดสำหรับ Bromeliaceae (เช่น Barfuss et al, 2005:. trnL-trnF; Givnish et al, 2011. trnL-trnF, trnH-psbA; Jabaily และ Sytsma 2010: PHYC) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการใน aVeriti Thermal Cycler (ประยุกต์ Biosystem คอร์ป, ฟอสเตอร์ซิตี. แคลิฟอร์เนีย) ภูมิภาค plastid ถูกขยายด้วยปฏิกิริยาต่อไปนี้ 10 ไมโครลิตร Palma-ซิลวา, et al, (2009) PHYC ภูมิภาคนิวเคลียร์ถูกขยาย 10 ไมโครลิตรดังนี้บัฟเฟอร์ 1x Taq (Fermentas) 1.5 มิลลิ MgCl2 (Fermentas) 100 ไมโครโมล deoxynucleotide triphosphate 10 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ 1 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Fermentas) และ 10-20 นาโนกรัม แม่แบบดีเอ็นเอโดยใช้โปรแกรมการขี่จักรยานมาตรฐาน: 2 นาที denaturation ที่ 95 ° C denaturation 30 วินาที, 30 วินาทีการอบที่ 59 องศาเซลเซียสและ 2 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำความสะอาดโดยใช้ ExoSAP-IT (USB คอร์ป, คลีฟแลนด์, โอไฮโอ) ดังต่อไปนี้โปรโตคอลของผู้ผลิต ลำดับวงจรได้ดำเนินการกับย้อมบิ๊ก Terminaator ชุด v.3.1 (ประยุกต์ Biosystem คอร์ป, ฟอสเตอร์ซิตี. แคลิฟอร์เนีย) ที่มีการสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้น 60 s ที่ 95 ° C ตามด้วย 30 รอบที่ 96 ° C denaturation 10 วินาที, 10 หลอม s ที่ 50 ° C และ 2 นาทีส่วนขยายที่ 60 ° C ลำดับถูกสร้างขึ้นบน ABI 3730 วิเคราะห์ดีเอ็นเอ seqencer

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 การสกัดดีเอ็นเอ ( ลำดับ , และ

รวม genomic DNA ที่สกัดจากใบวัสดุที่ใช้ cetyltrimethylammonium โบรไมด์ ( ctab ) ขั้นตอน ( ดอยล์และดอยล์ , 1987 ) การใช้ไพรเมอร์ phyc515f br AAG CCC tty TAC GCT ATC CTG CAC และ CG phyc1699r br ATW GCA TCC ไอเอ็นจี ( phyc974f br GCT CCT the ggc TGC the GCT ซีเอ และ phyc1145r โม CCT GMA RCA rga แสดง the AAG แมว ATC )การ trnl trnf trnh psba ภูมิภาคและเป็นสากลของไพรเมอร์ใช้อธิบายใน Shaw et al . ( 2005 ) และ ซัง et al . ( 1997 ) ตามลำดับ สองพลาสติดภูมิภาคและยีนนิวเคลียร์ถูกเลือกเพราะพวกเขาได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องหมายของข้อมูลมากที่สุดสำหรับโบรมีเลียซีอี้ ( เช่น barfuss et al . 2005 : trnl trnf ; givnish et al . 2011 : trnl trnf trnh psba ; และ , jabaily sytsma 2010 : phyc )amplifications ได้ดําเนินการใน averiti Thermal cycler ( ใช้ biosystem . Foster City แคลิฟอร์เนีย ) ภูมิภาคของพลาสติดเป็น 10 µ L ปฏิกิริยาต่อไปนี้ พาล ซิลวา et al , ( 2009 ) นิวเคลียร์ภาค phyc ถูกขยายด้วย 10 µผมดังนี้ : 1x ทัค บัฟเฟอร์ ( fermentas ) 1.5 มม. ( fermentas MgCl2 ) 100 µโมล ขอขมาลาโทษ ไตรฟอสเฟต 10 pmol แต่ละไพรเมอร์ ,1 u แท็ค DNA polymerase ( fermentas ) และ 10-20 นาโนแม่แบบดีเอ็นเอ โดยใช้โปรแกรมจักรยานมาตรฐาน : 2 นาที ( 95 องศา C ( 30 วินาที , 30 วินาที annealing ที่ 59 ° C และ 2 มิน ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกล้างการใช้ exosap ( USB คอร์ป , Cleveland , Ohio ) ทำตามขั้นตอนของ ผู้ผลิต ลำดับวงจรออกมาด้วยความใหญ่ terminaator ย้อมชุด v.3.1 ( biosystem ประยุกต์ .Foster City แคลิฟอร์เนีย ) เริ่มต้นที่ 60 ( 95 องศา C ตามด้วย 30 รอบ 96 ° C ( 10 , 10 วินาที annealing ที่ 50 ° C และ 2 มิน ส่วนขยายที่ 60 องศา ลำดับถูกสร้างขึ้นในปลาย 940 ดีเอ็นเอวิเคราะห์ seqencer .