Western blotting. Cells were washed

Western blotting. Cells were washed with ice-cold phosphate saline buffer (PBS) and lysed with 200 ll of lysis buffer [50 mM Tris HCl (pH 7.4)), 1% NP-40, 40 mM NaF, 10 mM NaCl, 10 mM Na3VO4, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 10 mM dithiothreitol (DTT), and EDTA-free Roshe protease inhibitor tablets per 20 ml buffer]. The cell lysates were centrifuged at 10,000g for 15 min. Total protein, determined by the Bio-Rad protein assay, was mixed with 6 loading buffer and boiled at 100 C for 3 min. Samples at 40 lg/lane were resolved by SDS–PAGE and separated proteins were transferred onto nitrocellulose membranes by the wet transfer method using a Bio-Rad electrotransfer apparatus. Following transfer, the blots were blocked with 5% nonfat milk in Tris buffer saline containing 0.1% Tween 20 and then incubated with primary antibodies followed by secondary antibodies. Proteins were visualized by using the enhanced chemiluminescence system. Western blot data presented are representative of those obtained in at least three separate experiments.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การ blotting วิธีตะวันตก ล้าง ด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟตฉ่ำ saline (PBS) และนาทีที่ 37uc กับ 200 เซลล์ lysis บัฟเฟอร์ ll [50 มม.ทริสเรทติ้ง HCl (pH 7.4)), 1% NP-40, 40 มม. NaF, NaCl 10 มม. 10 มม. Na3VO4, 1 มม.ฟีนิล methyl sulfonyl ฟลูออไรด์ (PMSF), dithiothreitol 10 มม. (DTT), และแท็บเล็ตยับยั้งโปรติเอส EDTA ฟรีค้นหาต่อบัฟเฟอร์ 20 ml] เซลล์ lysates ได้จากที่ 10,000 กรัมโปรตีนรวม 15 นาที ถูกกำหนด โดยการทดสอบโปรตีน Bio-ล้อ ผสมกับ 6 โหลดบัฟเฟอร์ และต้มที่ 100 C ตัวอย่าง 3 นาทีที่ 40 lg/เลน ถูกแก้ไข โดย SDS – หน้า และถ่ายโอนแยกโปรตีนบนเยื่อไนโตรเซลลูโลส โดยวิธีการถ่ายโอนที่เปียกโดยใช้อุปกรณ์ electrotransfer Bio-ล้อ ต่อโอนย้าย จัดที่ถูกบล็อกในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้งประกอบด้วย 0.1% นม nonfat 5% 20 โลกของวัยรุ่น และได้รับการกกแล้ว ด้วยตาม ด้วยรองแอนติบอดีแอนติบอดีหลัก โปรตีนถูกแสดงเป็นภาพ โดยใช้ระบบ chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้น น้าตะวันตกข้อมูลที่นำเสนอเป็นตัวแทนของผู้รับการทดลองแยกต่างหากสามน้อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ซับตะวันตก เซลล์ที่ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์น้ำเกลือเย็นฟอสเฟต (PBS) และ lysed กับ 200 LL ของบัฟเฟอร์สลาย [50 มิลลิ Tris HCl (pH 7.4)), 1% NP-40, ขนาด 40 มม NaF 10 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 10 มิลลิ Na3VO4, 1 มิลลิ phenyl methyl sulfonyl ลูออไรด์ (PMSF), 10 มิลลิ dithiothreitol (DTT) และ EDTA ฟรี Roshe แท็บเล็ตน้ำย่อยยับยั้งละ 20 มล. บัฟเฟอร์] lysates เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000g นาน 15 นาที โปรตีนรวมที่กำหนดโดยการทดสอบโปรตีน Bio-Rad ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ 6 ขุดและต้มที่ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที ตัวอย่างที่ 40 LG / เลนได้รับการแก้ไขโดยวิธี SDS-PAGE และโปรตีนแยกถูกโอนไปยังเยื่อ nitrocellulose โดยวิธีการโอนเปียกโดยใช้เครื่องมือ electrotransfer Bio-Rad ต่อไปนี้การถ่ายโอน blots ถูกปิดกั้นด้วยนมไม่มีน้ำมัน 5% ทริสบัฟเฟอร์ที่มีน้ำเกลือ 0.1% Tween 20 และบ่มกับแอนติบอดีหลักตามด้วยแอนติบอดี้รองแล้ว โปรตีนที่ได้รับการมองเห็นโดยใช้ระบบ chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้น ข้อมูลดวงตะวันนำเสนอเป็นตัวแทนของผู้ที่ได้รับอย่างน้อยการทดลองสามแยกต่างหาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blotting . เซลล์มีการล้างด้วยน้ำเกลือเย็น ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( PBS ) และ lysed 200 จะของการสลายบัฟเฟอร์ [ 50 มม. โดย HCl ( pH 7.4 ) , 1% np-40 นาฟ , 40 มม. ขนาด 10 มม. 10 มม. na3vo4 1 มม. ) เมทิล sulfonyl ฟลูออไรด์ ( PMSF ) , 10 mm บัตรแข็ง ( DTT ) และ EDTA ฟรี roshe โปรตีเ นฮิบิเตอร์เม็ดต่อ ] กันชน 20 ml . เซลล์ lysates เป็นระดับที่ 10000g เป็นเวลา 15 นาที รวมโปรตีน กําหนดโดย ไบโอ ราดโปรตีนโดยผสมกับ 6 โหลดบัฟเฟอร์ และต้มที่ 100 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ที่อุณหภูมิ 40 LG / เลนถูกแก้ไขโดย SDS - หน้า และแยกโปรตีนที่ถูกย้ายไปยังไนโตรเยื่อโดยวิธีโอนเปียกโดยใช้ไบแร็ด electrotransfer อุปกรณ์ ต่อไปนี้การ blots ที่ถูกบล็อกด้วย 5 % ไขมันต่ำหรือนมในบัฟเฟอร์ที่มีเกลือ 0.1% Tween 20 แล้วตามด้วยการบ่มด้วยแอนติบอดีต่อรอง โปรตีนถูกมองเห็นโดยการใช้นโยบายแรงงานปรับปรุงระบบ ข้อมูล Western blot แสดงเป็นตัวแทนของผู้ที่ได้รับในการทดลองแยกอย่างน้อยสามคน