Western Blot Assay of Cellular Prot

Western Blot Assay of Cellular Proteins. Cellular proteins
extracted from control and drug treated THP-1 cells can
also be measured. The washed cell pellets will be resuspended
in extraction lysis buffer (50 mM HEPES pH 7.0,
250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.5 mM dithiothreitol, 5 mM
NaF, and 0.5 mM Na orthovanadate) containing 5 μg/mL
each of leupeptin and aprotinin and incubated with 15 min
at 4◦C. After removal of cell debris by microcentrifugation,
supernatants can quickly freeze. Protein concentration will
be determined by protein assay reagent according to the
manufacture’s instruction. 40–50 μg of cellular proteins from
treated and untreated cell extracts will be electroblotted
onto nitrocellulose membrane following separation on a
10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis.
The immunoblot will be incubated overnight
with blocking solution (5% skim milk) at 4◦C, followed by
incubation for 4 h with a 1 : 500 dilution of monoclonal antiiNOS
and COX-2 antibody (Santacruz, CA, USA). Blots will
be washed twice with PBS and incubated with a 1 : 1000
dilution of horseradish peroxidase-conjugated goat antimouse
IgG secondary antibody (Santacruz, CA, USA) for
1 h at room temperature. Blots will be rewashed thrice in
Tween 20/Tris buffered saline (TTBS) and then developed
by enhanced chemiluminescence (Amersham Life Science,
Arlington Heights, IL, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาของโปรตีนเซลลูลาร์ เซลลูลาร์โปรตีนแยกจากการควบคุม และยาเสพติดถือว่า THP-1 เซลล์สามารถนอกจากนี้ยัง วัด จะ resuspended ขี้หินเซลล์ในบัฟเฟอร์การ lysis สกัด (50 มม. HEPES pH 7.0NaCl 250 mM, 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 1 มม.phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ dithiothreitol 0.5 mM, 5 mMNaF และ orthovanadate นา 0.5 mM) ประกอบด้วย 5 μg/mLของ leupeptin และ aprotinin และ incubated กับ 15 นาทีที่ 4◦C หลังจากเอาเศษเซลล์โดย microcentrifugationอย่างรวดเร็วสามารถตรึง supernatants โปรตีนเข้มข้นจะตามรีเอเจนต์ทดสอบโปรตีนตามคำแนะนำของผลิต Μg 40 – 50 ของโปรตีนที่เซลล์จากสารสกัดจากเซลล์บำบัด และไม่ถูกรักษาจะ electroblottedบนเยื่อ nitrocellulose ตามแยกในการ10% โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS) -electrophoresis polyacrylamide เจจะ incubated immunoblot ค้างคืนมีการบล็อคโซลูชัน (5% skim นม) ที่ 4◦C ตามด้วยคณะทันตแพทยศาสตร์สำหรับ h 4 กับเจือจาง 1:500 ของโมโน antiiNOSและแอนติบอดีค็อกซ์-2 (Santacruz, CA, USA) จะกันบล็อทล้าง ด้วย PBS สอง และ incubated 1:1000เจือจางของ horseradish peroxidase กลวงแพะ antimouseIgG รองแอนติบอดี (Santacruz, CA, USA) สำหรับh 1 ที่อุณหภูมิห้อง กันบล็อทจะเป็น rewashed เลยในTween 20/ทริ สเรทติ้ง buffered น้ำเกลือ (TTBS) และพัฒนาแล้วโดยเพิ่ม chemiluminescence (Amersham วิทยาศาสตร์อาร์ลิงตันไฮทส์ IL สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดวงตะวัน Assay ของโปรตีนเซลลูลาร์ เซลลูลาร์โปรตีนสกัดจากการควบคุมยาเสพติดและได้รับการรักษาเซลล์ THP-1 สามารถนอกจากนี้ยังมีการวัด เม็ดเซลล์ล้างจะถูก resuspended ในบัฟเฟอร์สลายสกัด (50 มิลลิ HEPES พีเอช 7.0, 250 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 5 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 1 มิลลิฟลูออไรphenylmethylsulfonyl, 0.5 มิลลิ dithiothreitol 5 มิลลิNaF และ 0.5 มิลลินา orthovanadate) ที่มี 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรแต่ละleupeptin และ Aprotinin และบ่มกับ 15 นาทีที่4◦C หลังจากที่กำจัดเศษเซลล์โดย microcentrifugation, supernatants ได้อย่างรวดเร็วสามารถตรึง ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนดโดยการทดสอบสารโปรตีนเป็นไปตามคำแนะนำของผู้ผลิต 40-50 ไมโครกรัมของโปรตีนจากโทรศัพท์มือถือได้รับการรักษาและสารสกัดจากเซลล์ได้รับการรักษาจะได้รับการelectroblotted บนเมมเบรน nitrocellulose ต่อไปนี้ในการแยกโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต10% (SDS) ข่าวคราว -polyacrylamide. immunoblot จะได้รับการบ่มค้างคืนกับการแก้ปัญหาการปิดกั้น(5% นมพร่องมันเนย ) ที่4◦Cตามด้วยการบ่มเป็นเวลา4 ชั่วโมงกับ 1: 500 ลดสัดส่วนของโมโนโคลนอล antiiNOS และแอนติบอดี COX-2 (ซานตากรูซ, CA, USA) blots จะได้รับการล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและบ่มด้วย1: 1000 การลดสัดส่วนของพืชชนิดหนึ่งแพะ peroxidase-ผัน antimouse แอนติบอดี IgG รอง (ซานตากรูซ, CA, USA) สำหรับ1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง blots จะ rewashed สามครั้งในTween 20 / ทริสบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (TTBS) และจากนั้นได้รับการพัฒนาโดยchemiluminescence เพิ่มขึ้น (Amersham วิทยาศาสตร์ชีวภาพ, อาร์ลิงตันไฮทส์, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot assay ของโปรตีนในเซลล์ โปรตีนสกัดจากเซลล์และการควบคุมยา

thp-1 เซลล์สามารถจะวัดได้ การล้างเซลล์เม็ดจะ resuspended
ในการสกัดการสลายบัฟเฟอร์ ( 50 มิลฮีเปส pH 7.0 ,
250 มม. ขนาด 5 mM EDTA , 0.1% nonidet p-40 1 mm
phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 0.5 มม. บัตรแข็ง , 5 mm
นาฟและ 0.5 มิลลิเมตร นา orthovanadate ) ประกอบด้วย 5 μ g / ml
แต่ละลูเพปตินกับ aprotinin บ่มด้วย 15 นาที
ที่ 4 ◦ C หลังจากการกำจัดเศษเซลล์โดย microcentrifugation
, supernatants สามารถตรึง ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนดโดยระดับโปรตีนต่อ

ตามคำสั่งของการผลิต 40 – 50 μกรัมของโปรตีนจากเซลล์และสารสกัดจากเซลล์
ถือว่าดิบจะ electroblotted
ลงบนแผ่นไนโตรเซลลูโลสตามแยกใน
10% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS - polyacrylamide gel electrophoresis
มมูโนบล็จะบ่มค้างคืน
กับบล็อกโซลูชั่น ( 5% skim milk ) ที่ 4 ◦ C ,
4 H ตามด้วยการบ่มด้วย 1 : 500 ( โมโนโคลนอลแอนติบอดี ( cox-2 antiinos
และ ซานตาครูซ , CA , USA ) ไม้จะ
ล้างสองครั้งกับ PBS บ่มด้วย 1 : 1000
2 . มี antimouse
IgG conjugated แพะระดับแอนติบอดี ( ซานตาครูซ , CA , USA )
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ไม้จะ rewashed สามครั้งใน Tween 20 / บริษัทเกลือนี้

( ttbs ) แล้วพัฒนาโดยนโยบายแรงงานเพิ่มขึ้น ( ที่ชีวิตวิทยาศาสตร์
Arlington Heights , IL , USA )