incubated at 25 C for 24–72 h unti

incubated at 25 C for 24–72 h until colony development. The isolated
yeast colonies were streaked and transferred to YMA. Pure
cultures were kept as a glycerol stock at 80 C.
2.2. Identification of yeasts by rDNA sequence analysis
Genomic DNA was extracted from each isolate using the Bust n’
Grab method (Harju et al., 2004). The isolates were identified based
on the polymorphisms of the D2 expansion segment region of the
nuclear large subunit ribosomal RNA (28S rRNA) gene using the
MicroSeq D2 LSU rDNA Fungal Sequencing Kit (Applied
Biosystems). This kit provides all the reagents needed for the
amplification of the D2 region of 28S rRNA gene. PCR conditions
used were: 95 C for 10 min; (95 C for 30 s; 53 C for 30 s; 72 C
for 1 min)  35 cycles; 72 C for 10 min. The PCR products were
verified by electrophoresis on an agarose gel and then purified
with the MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Seven microliters
of the purified PCR product were used for the sequencing reaction
using either 13 ll of the Forward Sequencing Mix or of the Reverse
Sequencing Mix included in the MicroSeq kit. For each sample both
reactions were performed. For sequencing, the cycle sequencing
conditions were as follows: (96 C for 10 s; 50 C for 5 s; 60 C for
4 min)  25 cycles. PCR products were purified to eliminate excess
fluorescent dyes by NaOAc /EtOH precipitation and then analyzed
by the ‘‘3130 Genetic Analyzer’’ automatic sequencer (Applied
Biosystems). The sequencing output was analyzed using the
Sequencing Analysis Software version 5.4 (Applied Biosystems)
and sequences were compared and identified by a database similarity
search in the GENBANK Collection using the BLAST algorithm
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
2.3. Dual culture assay
All yeast isolates were tested in an in vitro preliminary screening
to select isolates showing antagonism against an ochratoxigenic
isolate of A. tubingensis (isolated previously from a Cyprus
vineyard, unpublished data). For this purpose, a loop of yeast cells
from 3-day-old cultures was streaked on a PDA plate (9 cm diameter)
at 2 cm from the rim of the plate. After 48 h, a conidial suspension
of A. tubingensis from a 5-day-old PDA culture was
inoculated at the distance of 5 cm from the yeast line. Plates with
only A. tubingensis were used as control. Petri dishes were incubated
at 25 C for 7 days for daily observation of the mycelial
growth of A. tubingensis in each plate. Each yeast isolate was tested
three times.
2.4. Detached berry assay
All yeast isolates were tested for antagonistic activity against A.
tubingensis (dominant species in Cyprus vineyards, unpublished
data) in a detached berry test as described previously
(Dimakopoulou et al., 2008). The yeasts were grown in liquid culture
of Yeast Malt extract (YM, containing 3 g yeast extract, 3 g
malt extract, 5 g bactopeptone and 10 g glucose per lt) in a rotary
shaker at 140 rpm for 48 h at 25 C. The yeast cells were centrifuged
at 3000 rpm for 3 min at 4 C and a suspension of cells
of each isolate was prepared (107 cells ml1) in SDW containing
0.01% Agral Syngenta (a wetting and spreading agent). Mature
grape berries of the Red Globe variety (available throughout the
year) were detached from bunches and surface-sterilized with 1%
commercial sodium hypochlorite for 5 min and rinsed three times
in SDW. Then the berries were immersed for 3 min in the yeast
suspension. Control berries were treated with SDW containing
0.01% Agral. The next day, a calibrated wound (about 2 mm diameter)
was made on each berry with a sterile needle. The wound was
spot-inoculated with 20 ll conidial suspension (104 conidia ml1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รับการกก 25 c เป็นเวลา 24 – 72 ชั่วโมงจนถึงพัฒนาอาณานิคม การแยกลาย และโอน YMA ยีสต์อาณานิคม เพียววัฒนธรรมที่ถูกเก็บไว้เป็นสต็อกเป็นกลีเซอรอลที่ 80 c2.2. รหัสของยีสต์โดย rDNA ลำดับวิเคราะห์ออกดีเอ็นเอที่ถูกแยกจากแต่ละ isolate ที่ใช้ n อก 'คว้าวิธี (Harju et al. 2004) การแยกระบุคะแนนบนความหลากหลายของภูมิภาค D2 ขยายเซ็กเมนต์ของการนิวเคลียร์ขนาดใหญ่ย่อย ribosomal RNA (28S rRNA) โดยใช้ยีนMicroSeq D2 LSU rDNA เชื้อราจัดลำดับชุด (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ชุดนี้ให้เปื้อนที่จำเป็นสำหรับการขยายภูมิภาค D2 ของยีน rRNA 28S เงื่อนไข PCRใช้ได้: 95 C 10 นาที (C 95 30 s; C 53 30 s; 72 C1 นาที) รอบ 35 C 72 สำหรับ 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCRจริง โดยอิในการเจล agarose และบริสุทธิ์แล้วด้วย MinElute PCR บริสุทธิ์ชุด (Qiagen) Microliters เจ็ดผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ใช้สำหรับปฏิกิริยาลำดับใช้ทั้ง 13 จะไปข้างหน้าการจัดลำดับส่วนผสม หรือย้อนกลับจัดลำดับส่วนผสมที่รวมอยู่ในชุด MicroSeq สำหรับแต่ละตัวอย่างทั้งสองปฏิกิริยาดำเนินการ สำหรับลำดับ ลำดับวงจรเงื่อนไขมีดังนี้: (96 C 10 s; 50 C สำหรับ 5 s; 60 C สำหรับ4 นาที) รอบ 25 ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์เพื่อกำจัดส่วนเกินฟลูออเรสเซนต์สีย้อม โดย NaOAc /EtOH ฝน และวิเคราะห์แล้วโดยที่ '' 3130 วิเคราะห์พันธุกรรม '' อัตโนมัติซีเควนเซอร์ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ผลผลิตลำดับถูกวิเคราะห์โดยใช้การซอฟต์แวร์วิเคราะห์รุ่น 5.4 (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ในการจัดลำดับและลำดับถูกเปรียบเทียบ และระบุความคล้ายคลึงกันในฐานข้อมูลค้นหาในคอลเลกชัน GENBANK ที่ใช้อัลกอริทึมระเบิด(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)2.3. ทดสอบสองวัฒนธรรมแยกยีสต์ทั้งหมดทดสอบในการคัดกรองเบื้องต้นในหลอดทดลองเลือกแยก antagonism กับ ochratoxigenic การแสดงแยกของ A. tubingensis (แยกต่างหากจากไซปรัสก่อนหน้านี้ไร่องุ่น ไม่เปิดเผยข้อมูล) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ การวนรอบของเซลล์ยีสต์จากวัฒนธรรม 3 วันเก่าเป็นลายบนจาน PDA (เส้นผ่าศูนย์กลาง 9 ซม.)ที่ 2 ซม.จากขอบจาน หลังจาก 48 ชั่วโมง ระงับ conidialของ tubingensis จาก PDA วัฒนธรรม 5 วันเก่าถูกinoculated ที่ระยะ 5 ซม.จากบรรทัดยีสต์ จานเฉพาะ A. tubingensis ถูกใช้เป็นตัวควบคุม เพาะอาหารได้รับการกก25 c เป็นเวลา 7 วันสำหรับตรวจสอบวันที่ mycelialเจริญเติบโตของ A. tubingensis ในแต่ละแผ่น ทดสอบโปรตีนยีสต์แต่ละสามครั้ง2.4. เดี่ยวเบอร์ assayแยกยีสต์ทั้งหมดได้รับการทดสอบสำหรับกิจกรรมที่เป็นปรปักษ์กับก.tubingensis (โดดเด่นชนิดในไร่องุ่นไซปรัส ยกเลิกประกาศข้อมูล) ในการทดสอบเดี่ยวเบอร์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Dimakopoulou et al. 2008) ยีสต์มีปลูกในวัฒนธรรมของเหลวของยีสต์มอลต์สกัด (YM ที่ประกอบด้วยสารสกัดจากยีสต์ 3 จี 3 จีมอลต์สกัด กลูโคส bactopeptone และ 10 กรัม 5 กรัมต่อลิตร) ในการหมุนปั่นที่ 140 rpm สำหรับ 48 ชั่วโมงที่ 25 c เซลล์ยีสต์ได้ผลิตภัณฑ์ที่ 3000 rpm เป็นเวลา 3 นาทีที่ 4 C และการระงับของเซลล์ของแต่ละ isolate คือเตรียม (เซลล์ 107 ml 1) ใน SDW ประกอบด้วย0.01% agral Syngenta (ที่เปียกและแพร่ตัวแทน) แก่ ๆเบอร์รี่องุ่นแดงโลกหลากหลาย (ตลอดการปี) ถูกแยกออกจากช่อ และฆ่า เชื้อพื้นผิวกับ 1%พาณิชย์การติดฉลากสำหรับ 5 นาทีและกระเด็นเมื่อจะสามเวลาใน SDW แล้ว เบอร์รี่ถูกแช่อยู่เป็นเวลา 3 นาทีในยีสต์ระงับ เบอร์รี่ควบคุมได้รับการรักษากับ SDW ประกอบด้วย0.01% Agral ในวันถัดไป แผลเทียบ (ประมาณ 2 มม.)ทำในแต่ละเบอร์ ด้วยเข็มปลอดเชื้อ แผลถูกจุด inoculated กับ 20 ll conidial ระงับ (104 conidia มิลลิลิตร 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24-72 ชั่วโมงจนการพัฒนาอาณานิคม ที่แยก
อาณานิคมยีสต์ถูกลายและย้ายไปที่นี่ เพียว
วัฒนธรรมถูกเก็บไว้เป็นหุ้นกลีเซอรอลที่? 80? C.
2.2 บัตรประจำตัวของยีสต์โดย rDNA วิเคราะห์ลำดับ
จีโนมดีเอ็นเอที่สกัดจากแต่ละแยกได้โดยใช้หน้าอก n '
วิธีการคว้า (Harju et al., 2004) สายพันธุ์ที่ถูกระบุตาม
ในความหลากหลายของภูมิภาค D2 ส่วนการขยายตัวของ
นิวเคลียร์ subunit ขนาดใหญ่อาร์เอ็นเอไรโบโซม (28S rRNA) โดยใช้ยีน
MicroSeq D2 LSU rDNA เชื้อราลำดับ Kit (Applied
Biosystems) ชุดนี้ยังมีการวิเคราะห์สารทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับ
การขยายของภูมิภาค D2 ของ 28S rRNA ยีน เงื่อนไข PCR
ใช้คือ: 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที; (95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที?; 53 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที; 72 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 1 นาที)? 35 รอบ; 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูก
ตรวจสอบโดย electrophoresis บน agarose gel ที่แล้วทำให้บริสุทธิ์
ด้วยชุดฟอก MinElute PCR (Qiagen) เซเว่นไมโครลิตร
ของผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ถูกนำมาใช้สำหรับการเกิดปฏิกิริยาลำดับ
โดยใช้ทั้ง 13 LL ของ Forward ลำดับผสมหรือย้อนกลับ
ลำดับผสมรวมอยู่ในชุด MicroSeq สำหรับแต่ละกลุ่มตัวอย่างทั้ง
ปฏิกิริยาได้ดำเนินการ สำหรับลำดับการเรียงลำดับวงจร
เงื่อนไขดังนี้ (? 96 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 s; 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
4 นาที)? 25 รอบ ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์เพื่อขจัดส่วนเกิน
สีย้อมเรืองแสงโดย NaOAc / EtOH ตกตะกอนแล้วนำมาวิเคราะห์
โดย '' 3130 พันธุกรรมวิเคราะห์ '' ซีเควนอัตโนมัติ (Applied
Biosystems) การส่งออกลำดับได้รับการวิเคราะห์โดยใช้
ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 5.4 การวิเคราะห์ลำดับ (Applied Biosystems)
และลำดับที่ได้มาเปรียบเทียบและระบุฐานข้อมูลที่คล้ายคลึงกัน
การค้นหาในคอลเลกชัน GenBank โดยใช้วิธีการระเบิด
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi).
2.3 ทดสอบวัฒนธรรมแบบ Dual
ทุกสายพันธุ์ยีสต์ได้รับการทดสอบในหลอดทดลองการคัดกรองในเบื้องต้น
เพื่อเลือกแยกแสดงเป็นปรปักษ์กับ ochratoxigenic
แยกของเอ tubingensis (แยกก่อนหน้านี้จากไซปรัส
ไร่องุ่นข้อมูลที่ไม่ถูกเผยแพร่) เพื่อจุดประสงค์นี้วงของเซลล์ยีสต์
จากวัฒนธรรม 3 วันเก่า ๆ ได้ถูกลายบนแผ่น PDA (9 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลาง)
ที่ 2 ซม. จากขอบของแผ่น หลังจาก 48 ชั่วโมง, การระงับเชื้อรา
ของเอ tubingensis จากวัฒนธรรม PDA 5 วันเก่า ๆ ได้ถูก
เชื้อที่ระยะ 5 ซม. จากบรรทัดยีสต์ แผ่นที่มี
เพียงเอ tubingensis ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม จานเลี้ยงเชื้อบ่ม
ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วันสำหรับการสังเกตประจำวันของเส้นใย
เจริญเติบโตของเอ tubingensis ในแต่ละแผ่น แต่ละแยกยีสต์ได้รับการทดสอบ
ครั้งที่สาม.
2.4 ทดสอบ Berry เดี่ยว
ทุกสายพันธุ์ยีสต์ได้มีการทดสอบว่าเป็นกิจกรรมที่เป็นปฏิปักษ์กับเอ
tubingensis (สายพันธุ์ที่โดดเด่นในไร่องุ่นไซปรัสที่ไม่ได้เผยแพร่
ข้อมูล) ในการทดสอบ Berry แฝดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
(Dimakopoulou et al., 2008) ยีสต์มีปลูกในวัฒนธรรมของเหลว
ของสารสกัดจากยีสต์มอลต์ (YM ที่มีสารสกัดจาก 3 กรัมยีสต์ 3 กรัม
สารสกัดจากมอลต์ 5 กรัม bactopeptone และ g น้ำตาลกลูโคส 10 ต่อ LT) ในแบบหมุน
ปั่นที่ 140 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เซลล์ยีสต์ถูกหมุนเหวี่ยง
ที่ 3000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 3 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสและระงับของเซลล์
ของแต่ละแยกถูกจัดทำขึ้น (107 มล. เซลล์? 1) ใน SDW ที่มี
0.01% Agral? ซินเจนทา (เป็นตัวแทนเปียกและการแพร่กระจาย) ผู้ใหญ่
เบอร์รี่องุ่นของความหลากหลายลูกโลกสีแดง (ให้บริการตลอดทั้ง
ปี) ถูกถอดออกจากช่อและพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วย 1%
โซเดียมไฮโปคลอไรต์ในเชิงพาณิชย์เป็นเวลา 5 นาทีและล้างสามครั้ง
ใน SDW แล้วผลเบอร์รี่แช่เป็นเวลา 3 นาทีในยีสต์
ระงับ ผลเบอร์รี่ควบคุมได้รับการรักษาด้วย SDW ที่มี
0.01% Agral ?. วันรุ่งขึ้นแผลสอบเทียบ (ประมาณ 2 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง)
ถูกสร้างขึ้นมาในแต่ละ Berry ด้วยเข็มผ่านการฆ่าเชื้อ แผลถูก
จุดเชื้อด้วย 20 LL ระงับเชื้อรา (104 มล. สปอร์? 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 และ 72 ชั่วโมงจนกระทั่งพัฒนานิคม การแยกโคโลนียีสต์ลายและย้ายไป yma . บริสุทธิ์วัฒนธรรมที่ถูกเก็บไว้เป็นกลีเซอรอลหุ้น 80 C2.2 . วินิจฉัยชนิดของยีสต์ โดยการวิเคราะห์ลำดับเบสด้วยจีโนมดีเอ็นเอจากแต่ละแยกใช้หน้าอก N ’คว้าวิธี ( estonia . kgm et al . , 2004 ) ที่แยกได้ถูกระบุตามบนความหลากหลายของ D2 ขยายเขตของกลุ่มนิวเคลียร์ขนาดใหญ่ซึ่งไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอ ( rRNA ยีน 28s ) โดยใช้microseq D2 LSU ด้วยเชื้อราลำดับชุดประยุกต์Biosystems ) ชุดนี้มีทั้งหมดของสารเคมีที่จำเป็นสำหรับการขยายของเขต D2 ของ 28s rRNA ยีน โดยเงื่อนไขที่ใช้ : 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ( 95 C 30 s ; 53 C 30 s ; 72 องศาเซลเซียส1 นาที ) 35 รอบ ; 72 C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR คือตรวจสอบโดยเอนไซม์บนเจล และบริสุทธิ์กับ minelute PCR ฟอก Kit ( เพิ่ม ) เจ็ดตัวเลขของโปรตีนดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์ที่ใช้สำหรับการเกิดปฏิกิริยาโดยใช้ทั้ง 13 จะส่งต่อหรือการผสมของย้อนกลับการผสมรวมอยู่ใน microseq kit สำหรับแต่ละตัวอย่างทั้งปฏิกิริยาการวิจัย สำหรับวงจรการจัดลำดับเงื่อนไขดังนี้ ( 96 C 10 s ; 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 s ; 60 C สำหรับ4 นาที ) 25 รอบ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกทำให้บริสุทธิ์ ขจัดส่วนเกินเรืองแสงสีโดย naoac / กลุ่มฝนแล้ววิเคราะห์โดย " "3130 พันธุกรรมวิเคราะห์ " อัตโนมัติ " ซีเควน ( ใช้Biosystems ) การจัดลำดับผลวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ลำดับซอฟต์แวร์รุ่น 5.4 ( Applied Biosystems )และลำดับระบุฐานข้อมูลเพื่อเปรียบเทียบความเหมือนค้นหาในคอลเลกชันนี้ขนาดใช้ระเบิด( http : / / ระเบิด ncbi . nlm . NIH . gov / ระเบิด CGI )2.3 วิธี dual cultureทั้งหมดทดสอบยีสต์ไอโซเลทในการคัดกรองเบื้องต้นการเลือกสายพันธุ์ที่แสดงการต่อสู้กับ ochratoxigenicแยกของ tubingensis ( แยกก่อนหน้านี้จาก ไซปรัสไร่องุ่น , ข้อมูลเผยแพร่ ) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ วงเซลล์ยีสต์จาก 3-day-old วัฒนธรรมเป็นลายบน PDA จาน ( 9 ซม. )ที่ 2 ซม. จากขอบของจาน หลังจาก 48 ชั่วโมง ระงับเดีย. tubingensis จาก 5-day-old PDA ทางวัฒนธรรมแต่ที่ระยะ 5 ซม. จากยีสต์ที่บรรทัด แผ่นด้วยแต่ . tubingensis ที่ใช้ควบคุม จานเพาะเลี้ยงเชื้อได้ที่ 25 C เป็นเวลา 7 วัน เพื่อสังเกตอาการของเส้นใยทุกวันการเจริญเติบโตของ tubingensis ในแต่ละจาน ยีสต์ที่แยกเป็นแต่ละการทดสอบสามครั้ง2.4 . บ้านเดี่ยว เบอร์รี่ การทดสอบทั้งหมดยีสต์ไอโซเลท มาทดสอบกิจกรรมปฏิปักษ์กับ ก.tubingensis ( ชนิดเด่นในไซปรัสสวนองุ่น อาคิโอะข้อมูลในการทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ : เบอร์รี่( dimakopoulou et al . , 2008 ) ส่วนยีสต์เติบโตในอาหารเหลวสารสกัดจากข้าวมอลต์ยีสต์ ( YM ที่มี 3 กรัมยีสต์สกัด , 3 จีสารสกัดจากข้าวมอลต์ , 5 กรัมและ 10 กรัม bactopeptone กลูโคสต่อมัน ) ในโรตารีเครื่องปั่นที่ 140 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสที่ระดับเซลล์ยีสต์คือที่ 3 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และระงับเซลล์ในแต่ละแยกที่เตรียมไว้ ( 107 เซลล์ ml1 ) ใน sdw ที่มี0.01 % agral ซินเจนต้า ( เปียกและการแพร่กระจายของตัวแทน ) ผู้ใหญ่องุ่นไวน์แดงที่หลากหลายของโลก ( ใช้ได้ตลอดปี ) ถูกแยกออกจากพวง และฆ่าเชื้อที่ผิวด้วย % 1โซเดียมไฮโปคลอไรต์พาณิชย์เป็นเวลา 5 นาทีและล้าง 3 ครั้งใน sdw . แล้วผลเบอร์รี่ถูกแช่นาน 3 นาทีในยีสต์ระงับ ผลเบอร์รี่ที่ได้รับการรักษาด้วย sdw ที่มีการควบคุม0.01 % agral . วันต่อมา มีขนาดแผล ( ประมาณ 2 มม. เส้นผ่าศูนย์กลาง )ถูกสร้างในแต่ละเบอร์ มีเข็มปลอดเชื้อ บาดแผลจุดที่ใส่ 20 จะระงับ ( 104 โคนิเดีย ml1 )