A number of labeling and detection

A number of labeling and detection methods can be employed for multiplexed sandwich assays (Fig. 1). They all have in common that a set of antibodies are immobilized to the surface and specifically “capture” their respective analytes. A second antibody, recognizing a different epitope on the antigen, then detects analyte binding. In the first approach (Fig. 1A), the signal is generated by fluorescently labeled detection antibodies (for example, Nielsen et al., 2003). This approach requires chemical labeling of all secondary detection antibodies, but the assay is a simple two-step procedure that does not require a separate staining step. Using a species-specific fluorescently labeled tertiary antibody (Fig. 1B) avoids the use of a large number of chemically modified detection antibodies but, on the other hand, limits the species of the capture antibodies. Alternatively and more commonly used are signal generation schemes that take advantage of commercially available, biotinylated detection antibodies. The detection occurs after staining of the sandwich complex with Cy3-labeled streptavidin or other streptavidin variants such as Texas Red conjugates (for example, Wang et al., 2002) or streptavidin–R-phycoerythrin (SAPE) (for example, Huang et al., 2001; Tam et al., 2002) (Fig. 1C). Limits of detection (not theoretical sensitivities) in the tens of picograms per milliliter range can readily be achieved. The fluorescent signal can be further amplified using a second layer of SAPE coupled to the first layer via an anti-SAPE antibody (similar to staining of Affymetrix DNA chips; Wodicka et al., 1997) yielding typically a fourfold signal increase (Geierstanger et al., unpublished results) (Fig. 1D). Alternatively, the number of biotin labels on the antibody spot can be increased via thyramide signal amplification (Woodbury et al., 2002)(Fig. 1E). Horseradish peroxidase will generate a thyramide radical that cross-links a biotin (or a fluorophore; Fig. 1F) to all exposed tyrosine residues of any protein near the recognition event. In our hands, however, the approach can lead to steep response curves limiting the assay range (Saviranta and Geierstanger, unpublished results). A classical ELISA approach uses streptavidin–horseradish peroxidase (HRP) (Fig. 1G) or a species-specific antibody conjugated with HRP or alkaline phosphatase (Fig. 1H) and chemiluminescence substrates. The light generated around the antibody spot upon enzymatic cleavage of the chemiluminescence substrate is recorded with a CCD camera. Multiplexed sandwich assays have been implemented using chemiluminescence Moody et al., 2001 and Wiese et al., 2001. Because the size of the light halo increases with analyte concentration using streptavidin–HRP (Fig. 1G)Moody et al. (2001) used a spot-to-spot spacing of 1.25 mm to achieve a wide dynamic range for their assay. Similarly, antibody microarrays using anti-rabbit antibody–alkaline phosphatase conjugate (Fig. 1H) for signal generation have been developed (Wiese et al., 2001). Although the sensitivity and accuracy of the chemiluminescence measurements mirror that of plate ELISA, the achievable spot density limits the multiplexing capability of the approach. Typically, chemiluminescence is more sensitive than standard fluorescence applications. The notable exceptions are when the long lifetime of lanthanides such as europium allows time-delayed measurements after the auto-fluorescence of glass has decayed. A polymer decorated with streptavidin and europium chelates has been employed for state-of-the-art microplate measurements as well as for microarray measurements (Scorilas et al., 2000).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จำนวนวิธีการติดฉลากและการตรวจสอบสามารถนำมาใช้สำหรับแซนด์วิช multiplexed assays (1 รูป) พวกเขาทั้งหมดมีเหมือนกันว่า ชุดของแอนติบอดีจะตรึงกับพื้นผิว และโดยเฉพาะ "จับ" analytes ของพวกเขาเกี่ยวข้อง แอนติบอดีที่สอง ตระหนัก epitope แตกต่างกันใน antigen แล้วตรวจพบ analyte ผูก ในวิธีการแรก (รูปที่ 1A), สัญญาณสร้างขึ้น โดยติดป้าย fluorescently การตรวจหาแอนติบอดี (เช่น นีล et al. 2003) วิธีนี้จำเป็นต้องติดฉลากสารเคมีของทั้งหมดรองการตรวจหาแอนติบอดี แต่การทดสอบเป็นกระบวนการสองขั้นตอนง่าย ๆ ที่ไม่ต้องเป็นอีกขั้นตอนที่ผม ใช้เป็นสายติดป้าย fluorescently ระดับอุดมศึกษาแอนติบอดี (รูปที่ 1B) หลีกเลี่ยงการใช้แอนติบอดีตรวจแก้ไขสารเคมีจำนวนมาก แต่ คง จำกัดชนิดของแอนติบอดีจับ อีกวิธีหนึ่ง และโดยทั่วไป ใช้เป็นแบบแผนการสร้างสัญญาณที่ใช้ประโยชน์จาก biotinylated มีจำหน่ายทั่วไป การตรวจหาแอนติบอดี การตรวจจับที่เกิดขึ้นหลังจากย้อมสีของแซนวิซับซ้อนกับป้าย Cy3 streptavidin streptavidin ย่อยเช่นเท็กซัสแดง conjugates (เช่น วัง et al. 2002) หรือ streptavidin – R-phycoerythrin (SAPE) (เช่น Huang et al. 2001 ทัม et al. 2002) (รูปที่ 1C) ขีดจำกัดของการตรวจสอบ (ความไวทางทฤษฎีไม่ได้) หลายสิบพิโกกรัมต่อช่วงมิลลิเมตรพร้อมสามารถทำได้ สัญญาณฟลูออเรสเซนต์สามารถเพิ่มเติม ขยายโดยใช้ชั้นสองของ SAPE ควบคู่ไปกับชั้นแรกผ่านแอนติบอดีต้าน SAPE (คล้ายกับการย้อมสีของ Affymetrix ดีเอ็นเอชิ Wodicka et al. 1997) โดยทั่วไปเป็น fourfold สัญญาณเพิ่มขึ้น (Geierstanger et al. ยกเลิกประกาศผล) ผลผลิต (มะเดื่อ 1D) อีกวิธีหนึ่งคือ หมายเลขของป้ายชื่อไบโอตินบนจุดแอนติบอดีจะเพิ่มขึ้นผ่านเครื่องขยายสัญญาณสัญญาณ thyramide (วูดบิวรี et al. 2002) (รูปที่ 1E) ดิชฮอสจะสร้าง thyramide รุนแรงที่มีไบโอติน (หรือ fluorophore; cross-links รูป 1F) ทั้งหมดตกไทโรซีนโปรตีนใด ๆ ใกล้เหตุการณ์การรับรู้สัมผัส ในมือของเรา อย่างไรก็ตาม วิธีสามารถนำไปสู่เส้นโค้งตอบสนองสูงชันจำกัดช่วงทดสอบ (Saviranta และ Geierstanger ยกเลิกประกาศผล) วิธีการ ELISA คลาสสิกใช้ฮอส streptavidin – ดิช (HRP) (รูปที่ 1G) หรือมีแอนติบอดีสายผัน HRP หรืออัลคาไลน์ฟอสฟา (รูปที่ 1 H) และ chemiluminescence พื้นผิว แสงที่สร้างขึ้นรอบจุดแอนติบอดีเมื่อเอนไซม์ความแตกแยกของ chemiluminescence พื้นผิวจะถูกบันทึก ด้วยกล้อง CCD แซนวิ multiplexed assays มีการดำเนินการใช้ chemiluminescence มูดดี้ et al. 2001 และ Wiese et al. 2001 เนื่องจากขนาดของรัศมีแสงเพิ่มขึ้นกับความเข้มข้นของ analyte ใช้ streptavidin – HRP (มะเดื่อ 1G) มูดดี้ et al. (2001) ใช้ระยะห่างในจุดที่จะจุดของ 1.25 มม.เพื่อให้ได้ช่วงไดนามิกกว้างสำหรับทดสอบของพวกเขา ในทำนองเดียวกัน microarrays แอนติบอดีที่ใช้ป้องกันกระต่ายแอนติบอดี – อัลคาไลน์ฟอสฟา conjugate (รูปที่ 1 H) สำหรับสร้างสัญญาณที่มีการพัฒนา (Wiese et al. 2001) แม้ว่าความไวและความแม่นยำของการวัด chemiluminescence กระจกที่จาน ELISA ความหนาแน่นของจุดทำได้จำกัดความสามารถในวิธีการ multiplexing โดยทั่วไป chemiluminescence มีความไวกว่าใช้งานเรืองแสงมาตรฐาน ข้อยกเว้นสำคัญคือเมื่ออายุการใช้งานที่ยาวนานของ lanthanides เช่นยูโรเพียมช่วยให้การวัดเวลาที่ล่าช้าหลังจากเรืองแสงอัตโนมัติกระจกมีเสื่อม ลิเมอร์ streptavidin และยูโรเพียมรวดเร็วหมดจดด้วยการใช้ microplate ศิลปะของการวัดเช่นสำหรับวัด microarray (Scorilas et al. 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จำนวนของการติดฉลากและการตรวจสอบวิธีการที่สามารถใช้สำหรับการตรวจแซนวิชมัลติเพล็ก (รูปที่ 1). พวกเขาทุกคนมีเหมือนกันว่าชุดของแอนติบอดีจะถูกตรึงกับพื้นผิวและโดยเฉพาะ "จับ" วิเคราะห์ของตน แอนติบอดีสองตระหนักถึง epitope แตกต่างกันในแอนติเจนจากนั้นตรวจพบการวิเคราะห์ที่มีผลผูกพัน ในวิธีแรก (รูป. 1A) สัญญาณจะถูกสร้างขึ้นโดยมีป้ายกำกับ fluorescently แอนติบอดีการตรวจสอบ (เช่นนีลเซ่น et al., 2003) วิธีนี้ต้องติดฉลากสารเคมีทุกแอนติบอดีการตรวจสอบรอง แต่การทดสอบเป็นขั้นตอนสองขั้นตอนง่ายๆที่ไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอนการย้อมสีที่แยกต่างหาก โดยใช้สายพันธุ์เฉพาะที่มีป้ายกำกับ fluorescently แอนติบอดีในระดับอุดมศึกษา (รูปที่ 1B.) หลีกเลี่ยงการใช้ของจำนวนมากของแอนติบอดีตรวจจับการดัดแปรทางเคมี แต่ในมืออื่น ๆ ที่ จำกัด ชนิดของแอนติบอดีจับภาพ หรืออีกทางหนึ่งและใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสัญญาณรูปแบบรุ่นที่ใช้ประโยชน์จากใช้ได้ในเชิงพาณิชย์, ไบโอตินแอนติบอดีการตรวจสอบ การตรวจสอบเกิดขึ้นหลังจากการย้อมสีที่ซับซ้อนแซนวิชกับสเต Cy3 ที่มีข้อความหรือรูปแบบสเตอื่น ๆ เช่นคอนจูเกตเท็กซัสแดง (ตัวอย่างเช่นวัง et al., 2002) หรือสเต-R-phycoerythrin (SAPE) (ตัวอย่างเช่น Huang et al, ., 2001;.. Tam, et al, 2002) (รูปที่ 1C) ข้อ จำกัด ของการตรวจสอบ (ไม่เปราะบางทฤษฎี) ในสิบของ picograms ต่อช่วงมิลลิลิตรสามารถพร้อมที่จะประสบความสำเร็จ สัญญาณเรืองแสงสามารถขยายเพิ่มเติมได้โดยใช้ชั้นที่สองของ SAPE คู่กับชั้นแรกผ่านแอนติบอดีต่อต้าน SAPE (คล้ายกับการย้อมสีของชิป Affymetrix ดีเอ็นเอ. Wodicka, et al, 1997) ผลผลิตมักจะเพิ่มขึ้นสัญญาณจาตุรงค์ (Geierstanger et al, . ผลที่ไม่ถูกเผยแพร่) (รูป. 1D) อีกวิธีหนึ่งคือจำนวนของป้ายไบโอตินในจุดแอนติบอดีสามารถเพิ่มขึ้นผ่านทาง thyramide ขยายสัญญาณ (Woodbury et al., 2002) (รูป. 1E) peroxidase พืชชนิดหนึ่งที่จะสร้าง thyramide หัวรุนแรงที่เชื่อมโยงข้ามไบโอติน (หรือสารเรืองแสงนั้น. รูป 1F) ทุกตกค้างซายน์สัมผัสของโปรตีนใด ๆ ที่อยู่ใกล้กับเหตุการณ์ได้รับการยอมรับ อยู่ในมือของเรา แต่วิธีการที่จะนำไปสู่​​การตอบสนองของเส้นโค้งสูงชัน จำกัด ช่วงทดสอบนี้ (Saviranta และ Geierstanger ผลที่ไม่ถูกเผยแพร่) วิธี ELISA คลาสสิกใช้สเต-มะรุม peroxidase (HRP) (รูป. 1G) หรือแอนติบอดีชนิดเฉพาะผันกับ HRP หรือด่าง phosphatase (รูป. 1H) และพื้นผิว chemiluminescence แสงที่เกิดขึ้นรอบ ๆ จุดแอนติบอดีเมื่อความแตกแยกเอนไซม์ของพื้นผิว chemiluminescence จะถูกบันทึกไว้ด้วยกล้องวงจรปิด Multiplexed ตรวจแซนวิชได้รับการดำเนินการโดยใช้ chemiluminescence Moody, et al., 2001 และ Wiese et al., 2001 เพราะขนาดของการเพิ่มขึ้นของรัศมีแสงที่มีความเข้มข้นวิเคราะห์โดยใช้สเต-HRP (รูป. 1G) Moody et al, (2001) ใช้ระยะห่างระหว่างจุดต่อจุด 1.25 มิลลิเมตรเพื่อให้บรรลุช่วงไดนามิกกว้างสำหรับการทดสอบของพวกเขา ในทำนองเดียวกัน microarrays แอนติบอดีที่ใช้ป้องกันกระต่ายแอนติบอดีอัลคาไลน์ฟอสฟาคอนจูเกต (รูป. 1H) สำหรับการสร้างสัญญาณได้รับการพัฒนา (Wiese et al., 2001) แม้ว่าความไวและความถูกต้องของการวัด chemiluminescence กระจกที่ของแผ่น ELISA, ความหนาแน่นของจุดที่ทำได้ จำกัด ความสามารถมัลติของวิธีการ โดยปกติ chemiluminescence มีความสำคัญมากกว่าการใช้งานมาตรฐานการเรืองแสง ที่น่าสังเกตข้อยกเว้นเมื่ออายุการใช้งานที่ยาวนานของ lanthanides เช่นยูโรเพียมช่วยให้การวัดเวลาล่าช้าหลังจากอัตโนมัติเรืองแสงของกระจกได้ผุ พอลิเมตกแต่งด้วยสเตและยูโรเพียม chelates ได้รับการว่าจ้างสำหรับรัฐของศิลปะวัด microplate เช่นเดียวกับวัด microarray (Scorilas et al., 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หมายเลขของการติดฉลากและวิธีการตรวจสอบสามารถใช้มัลติเพลกซ์หรือแซนด์วิช ( รูปที่ 1 ) พวกเขาทั้งหมดมีเหมือนกันว่าชุดของแอนติบอดีจะถูกตรึงกับพื้นผิว และโดยเฉพาะ " จับภาพ " ของแต่ละสาร . เป็นแอนติบอดีที่สองตระหนักถึงไวรัสชนิดที่แตกต่างกันแล้วตรวจสอบครูที่มีผลผูกพัน ในวิธีแรก ( รูปที่ 1A ) , สัญญาณจะถูกสร้างขึ้น โดย fluorescently ป้ายตรวจหาแอนติบอดี ( ตัวอย่างเช่น Nielsen et al . , 2003 ) วิธีการนี้ต้องมีการติดฉลากรองตรวจหาแอนติบอดีสารเคมี แต่ใช้เป็นแบบสองขั้นตอน ขั้นตอนง่าย ๆที่ไม่ต้องแยกจากขั้นตอน ใช้เฉพาะ - ขยายพันธุ์ fluorescently ป้าย ( รูปที่สาม ) 1B ) หลีกเลี่ยงการใช้เป็นจำนวนมากและการดัดแปรทางเคมี แต่ในมืออื่น ๆที่ จำกัด ของจับชนิดแอนติบอดี อีกวิธีหนึ่งคือใช้บ่อยและเป็นสัญญาณสร้างโครงร่างที่ใช้ประโยชน์ในเชิงพาณิชย์ที่มีไลแอนติบอดี , การตรวจสอบ การตรวจสอบเกิดขึ้นหลังจากคราบของแซนวิชที่ซับซ้อนกับ cy3 ข้อความหรือตัวแปรอื่น ๆเช่น streptavidin streptavidin เท็กซัสแดงสารประกอบ ( ตัวอย่างเช่น , Wang et al . , 2002 ) หรือ streptavidin – r-phycoerythrin ( SAPE ) ( ตัวอย่างเช่น หวง et al . , 2001 ; ตำ et al . , 2002 ) ( ภาพที่ 1c ) ขอบเขตของการตรวจสอบ ( ไม่ใช่ทฤษฎีความไว ) ในช่วงสิบ picograms ต่อมิลลิลิตร สามารถพร้อมที่จะประสบความสำเร็จ สัญญาณฟลูออเรสเซนต์สามารถต่อขยายการใช้เลเยอร์ที่สองของ SAPE คู่กับชั้นก่อนผ่านการต่อต้าน SAPE แอนติบอดี ( คล้ายกับการย้อมสีของ affymetrix ดีเอ็นเอชิป ; wodicka et al . , 1997 ) หยุ่นโดยปกติเพิ่มสัญญาณจาตุรงค์ ( geierstanger et al . , ประกาศผล ) ( ภาพดี ) อีกวิธีหนึ่งคือ หมายเลขของไบโอติน ป้ายจุดแอนติบอดีสามารถเพิ่มขึ้นผ่านการขยายสัญญาณ thyramide ( วูดเบอรี et al . , 2002 ) ( ภาพที่ 1e ) เอนไซม์มะรุมจะสร้าง thyramide หัวรุนแรงที่ข้ามการเชื่อมโยงไบโอติน ( หรือ fluorophore ; รูปที่ชั้น 1 ) กับทุกสัมผัสของโปรตีนตกค้างใด ๆซีนใกล้รับรู้เหตุการณ์ ในมือของเรา แต่วิธีการที่สามารถนำไปสู่การตอบสนองช่วงโค้งชัน จำกัด การใช้และเผยแพร่ geierstanger saviranta , ผล ) คลาสสิกแบบใช้วิธี streptavidin –เอนไซม์มะรุม ( HRP ) ( รูปที่ 1 ) หรือโดยเฉพาะ - ขยายพันธุ์ conjugated ด้วย HRP หรืออัลคาไลน์ ฟอสฟาเตส ( รูปที่ 1 ) และนโยบายแรงงานท แสงที่สร้างขึ้นรอบ ๆจุดบนความแตกแยกเอนไซม์แอนติบอดีของนโยบายแรงงานพื้นผิวเป็นบันทึกด้วยกล้อง CCD . มัลติเพลกซ์หรือแซนด์วิชได้ถูกพัฒนาโดยใช้เคมีลูมิเนสเซนต์ Moody et al . , 2001 และวีส et al . , 2001 เพราะขนาดของแสงรัศมีเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นที่ใช้ streptavidin –ครูช ( รูปที่ 1 ) Moody et al . ( 2001 ) ใช้จุดไปจุด ระยะห่างของ 1.25 มม. เพื่อให้บรรลุกว้างช่วงต่อของพวกเขา ในทำนองเดียวกันแอนติบอดีแอนติบอดีต่อต้านการแสดงโดยใช้กระต่าย–วันวาเลนไทน์ ) ( รูปที่ 1 ) สำหรับรุ่นสัญญาณได้รับการพัฒนา ( วีเซอร์ et al . , 2001 ) แม้ว่าความไวและความแม่นยำของการวัดนโยบายแรงงานกระจกจาน Elisa , ความหนาแน่นของจุดได้ จำกัด การมัลติเพล็กซ์ในแนวทาง โดยปกติแล้วนโยบายแรงงานมีความไวมากกว่าการใช้งาน การมาตรฐาน ข้อยกเว้นที่น่าสังเกตมีเมื่ออายุการใช้งานที่ยาวนานของแลนทาไนด์เช่นยูโรเปียมช่วยให้เวลาล่าช้าวัดหลังอัตโนมัติเรืองแสง แก้วมีผุ . พอลิเมอร์และตกแต่งด้วย streptavidin ยูโรเปียมคีเลตได้รับการวัดพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยที่ใช้รัฐ - of - the - art รวมทั้งการวัด microarray ( scorilas et al . , 2000 )