A random mutation library was const

A random mutation library was constructed using error-prone
PCR according to the Genemorph II Random Mutagenesis Kit manual
with the plasmid pET28a-xyl7 as template. For the second round
of error-prone PCR, the plasmid corresponding to the thermostable
mutant obtained from thefirst round was used as template. The PCR
products and plasmid pET28a were double-digested and ligated
with T4 DNA ligase, and the resulting plasmid was used to transform
E. coli DH10B using the MicroPulser Electroporator 165-2100
(Bio-Rad Laboratories, Veenendaal, The Netherlands). The transformants
were spread on LB plates with 50 g/ml of kanamycin
and incubated at 37 ◦C. The plasmids were extracted and used to
transform E. coli BL21 to produce a mutant library.
Colonies from the mutant library were picked and cultured
overnight in 96-well plates with LB medium containing 50 g/ml
kanamycin and 0.8 mM isopropyl -d-1-thiogalactopyranoside
(IPTG). Cell pellets were collected by centrifugation, resuspended
in 100-l pH 7.0 Na2HPO4/NaH2PO4 buffer and split equally into
two 96-well plates. One plate was heated at the designated temperature
for 2 h and the other plate served as an untreated control.
After heat treatment, 50 l of 2% xylan (w/v) were added into each
well. The plates were incubated at 37 ◦C and the enzyme reaction
was stopped by heating at 100 ◦C for 20 min with 100-l 3,5-
dinitrosalicylic acid (DNS). Enzyme activity was measured by the
absorbance value at 540 nm. Through this process, clones from the
library that retained more than 50% enzyme activity relative to the
control were saved as potential positive clones [17,1

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไลบรารีการกลายพันธุ์แบบสุ่มถูกสร้างขึ้นโดยใช้ข้อผิดพลาดได้ง่ายPCR ตามคู่มือชุด Mutagenesis สุ่ม II Genemorphกับ plasmid pET28a-xyl7 เป็นต้น ในรอบที่สองของข้อผิดพลาดเฉพาะ PCR, plasmid ที่สอดคล้องกับ thermostablemutant ได้จากรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบ PCRผลิตภัณฑ์และ plasmid pET28a ถูก ต้องคู่ และควบกับ T4 DNA ligase และ plasmid ได้ถูกใช้ในการแปลงE. coli DH10B ใช้การ MicroPulser Electroporator 165-2100(ไบโอ-Rad ห้องปฏิบัติการ Veenendaal เนเธอร์แลนด์) Transformantsมีแพร่กระจายบนแผ่นปอนด์กับ 50 g/ml ของกานามัยซินและ incubated ที่ 37 ◦C Plasmids ถูกสกัด และใช้แปลง E. coli BL21 ผลิตรีกลายพันธุ์อาณานิคมจากไลบรารีกลายพันธุ์เบิก และอ่างนอนในแผ่นดี 96 กับปอนด์กลางประกอบด้วย 50 g/mlกานามัยซินและ 0.8 มม. isopropyl -d-1-thiogalactopyranoside(IPTG) ขี้เซลล์ถูกรวบรวม โดย centrifugation, resuspendedใน 100 l ค่า pH 7.0 Na2HPO4/NaH2PO4 บัฟเฟอร์และการแบ่งเท่า ๆ กันเป็นสองแผ่น 96-ดี จานหนึ่งมีความร้อนที่อุณหภูมิที่กำหนด2 h และจานอื่น ๆ ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมไม่ถูกรักษาหลังจากชุบแข็ง เพิ่ม xylan 2% (w/v) 50 ลิตรลงในแต่ละดี แผ่นก็ incubated ที่ 37 ◦C และปฏิกิริยาเอนไซม์ได้หยุดลงโดยความร้อนที่ 100 ◦C สำหรับ 20 นาทีกับ 3,5 100-l-dinitrosalicylic กรด (DNS) เอนไซม์ถูกวัดโดยการค่า absorbance ที่ 540 nm ผ่านขั้นตอนนี้ clones จากการไลบรารีที่ถูกเก็บไว้มากกว่า 50% เอนไซม์กับ การตัวควบคุมถูกบันทึกเป็นศักยภาพบวกโคลน [17,1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ห้องสมุดกลายพันธุ์แบบสุ่มที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ข้อผิดพลาดได้ง่าย
PCR ตาม Genemorph II คู่มือการกลายพันธุ์แบบสุ่มชุด
ที่มีพลาสมิด pET28a-xyl7 เป็นแม่แบบ สำหรับรอบที่สอง
ของ PCR ผิดพลาดได้ง่าย, พลาสมิดที่สอดคล้องกับการทนต่อความร้อน
ที่ได้จากการกลายพันธุ์รอบ thefirst ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบ PCR
ผลิตภัณฑ์และพลาสมิด pET28a เป็นสองย่อยและ ligated
กับลิกาเซดีเอ็นเอ T4 และพลาสมิดที่เกิดขึ้นได้รับการใช้ในการแปลง
อี coli DH10B ใช้ MicroPulser Electroporator 165-2100
(ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Veenendaal, เนเธอร์แลนด์) transformant ที่
กระจายอยู่บนจาน LB 50 g / ml ของ KANAMYCIN
และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦C พลาสมิดที่ถูกสกัดและใช้ในการ
แปลงเชื้อ E. coli BL21 การผลิตห้องสมุดกลายพันธุ์.
อาณานิคมจากห้องสมุดกลายพันธุ์ได้รับเลือกและการเพาะเลี้ยง
ค้างคืนในแผ่น 96 หลุมที่มีขนาดกลางที่มี LB 50 g / ml
KANAMYCIN และ 0.8 มิลลิ isopropyl -d-1 -thiogalactopyranoside
(IPTG) เม็ดมือถือที่ได้จากการหมุนเหวี่ยง resuspended
ในค่า pH 100 ลิตร 7.0 Na2HPO4 / บัฟเฟอร์ NaH2PO4 และแบ่งเท่า ๆ กันเป็น
แผ่นเปลือกโลกสองแผ่น 96 หลุม แผ่นหนึ่งที่ถูกความร้อนที่อุณหภูมิที่กำหนด
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและแผ่นอื่น ๆ ที่ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมการรับการรักษา.
หลังจากการรักษาความร้อน 50 ลิตร 2% ไซแลน (w / v) ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละ
ดี แผ่นบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cและปฏิกิริยาเอนไซม์
ก็หยุดด้วยความร้อนที่ 100 ◦Cเป็นเวลา 20 นาทีกับ 100 ลิตร 3,5-
กรด dinitrosalicylic (DNS) กิจกรรมของเอนไซม์โดยวัดจาก
ค่าการดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตร ผ่านขั้นตอนนี้โคลนมาจาก
ห้องสมุดที่สะสมมากขึ้นกว่า 50% เมื่อเทียบการทำงานของเอนไซม์ที่จะ
ควบคุมได้รับการบันทึกเป็นโคลนที่มีศักยภาพในเชิงบวก [17.1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ห้องสมุดการกลายพันธุ์แบบสุ่มที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธี PCR มักจะผิดพลาด
ตามการ genemorph II การสุ่มชุดคู่มือ
กับ pet28a-xyl7 พลาสมิดเป็นแม่แบบ สำหรับรอบสอง
ข้อผิดพลาด PCR มักจะ , สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ที่ได้จากความร้อน
1 รอบ มาใช้เป็นแม่แบบ การตรวจและผลิตภัณฑ์พลาส pet28a เป็นคู่

ตัดและผูกกับดีเอ็นเอไลเกส T4 ,และผลของพลาสมิดที่ใช้เพื่อแปลง
E . coli dh10b ใช้ micropulser electroporator 165-2100
( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , วีเนนดาล , เนเธอร์แลนด์ ) พลาสมิด
ถูกแพร่กระจายในปอนด์แผ่น 50 กรัม / มิลลิลิตรและ kanamycin
บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสและ◦พลาสมิดที่ใช้ E . coli BL21
แปลงผลิต
ห้องสมุดที่กลายพันธุ์อาณานิคมจากห้องสมุดกลายพันธุ์ที่ถูกเลือกและเพาะเลี้ยง
ค้างคืนใน 96 ดีจานกับปอนด์ขนาดกลางที่มี 50 กรัม / มิลลิลิตร และ ไอโซน
-
d-1-thiogalactopyranoside 0.8 มม. ( โปรตีน ) เซลล์เม็ดมีจำนวน 3 resuspended
, ใน 100-l pH 7.0 na2hpo4 / nah2po4 บัฟเฟอร์และแยกกัน
2 96 ด้วยแผ่น 1 จาน ก็อุ่นในเขตอุณหภูมิ
2 H และจานอื่น ๆ ในฐานะที่เป็นควบคุม untreated
หลังจากการรักษาความร้อน , 50 ลิตรไซ 2 % ( w / v ) ถูกเพิ่มลงในแต่ละ
ดี จานถูกบ่มที่ 37 ◦ C และเอนไซม์ปฏิกิริยา
ถูกหยุดโดยความร้อนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที ◦ 100-l 3.5 -
dinitrosalicylic acid ( DNS ) เอนไซม์ คือ วัดค่าการดูดกลืนแสงโดย
540 นาโนเมตร ผ่านกระบวนการนี้ โคลนจาก
ห้องสมุดที่สะสมมากกว่า 50 % เมื่อเทียบกับเอนไซม์
ควบคุมบันทึกเป็นศักยภาพเชิงบวกโคลน [ 17,1