IV. User Supplied Reagents and Equi

IV. User Supplied Reagents and Equipment:  96-well clear plate with flat bottom  Microplate reader
V. Storage and Handling: Store kit at -20°C, protected from light. Avoid repeated freeze/thaw for all non-buffer components. Briefly centrifuge small vials prior to opening. Read the entire protocol before performing the assay.
VI. Reagent Preparation & Storage  Tyrosinase Substrate: Dissolve the lyophilized tyrosinase substrate in 220 μl ddH2O. Use within two months. Keep on ice while in use.  Tyrosinase: Dissolve the lyophilized tyrosinase in 220 μl Tyrosinase Assay Buffer. Aliquot and store at -20°C. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Use within two months. Keep on ice while in use.  Tyrosinase Enhancer: Ready to use. Protect from light. Keep at room temperature while in use.  Inhibitor Control (Kojic Acid): Add 75 µl of ddH2O to make a stock solution of 10 mM Kojic Acid. Mix well. Make a 0.75 mM working solution of Kojic Acid by adding 92.5 µl of ddH2O to 7.5 µl of 10 mM Kojic Acid Stock solution. Use within two months.
VII. Tyrosinase Inhibitor Screening Protocol: 1. Screening compounds, Inhibitor control and Blank Control Preparations: Dissolve test inhibitors into proper solvent. Dilute to 5X the desired test concentration with Tyrosinase Assay Buffer before use. Add 20 μl diluted test inhibitors, Inhibitor Control working solution, or Tyrosinase Assay Buffer into wells assigned as test inhibitors (Sample, S), Inhibitor Control (IC), or Tyrosinase Enzyme Control (EC) wells, respectively. Additional wells with serial dilutions of the test inhibitors may be prepared at this time if desired, containing 20 µl in each candidate well. Note: Preferred final solvent concentration should not be more than 5% by volume. If solvent exceeds 5% include a Solvent Control to test the effect of the solvent on enzyme activity. 2. Tyrosinase Enzyme Solution Preparation: For each well, prepare 50 μl Tyrosinase Enzyme Solution. 48 μl Tyrosinase Assay Buffer 2 μl Tyrosinase Mix well & add 50 μl/well into wells containing test inhibitors, Inhibitor Control & Enzyme Control. Mix. Incubate for 10 min. at 25ºC. 3. Tyrosinase Substrate solution preparation: For each well, prepare 30 µl of Tyrosinase Substrate solution 23 μl Tyrosinase Assay Buffer 2 μl Tyrosinase Substrate 5 µl Tyrosinase Enhancer Mix and add 30 μl of Tyrosinase Substrate Solution into each well. Mix well. 4. Measurement: Measure the absorbance in kinetic mode for 30-60 min. at 510 nm. Choose two time points (T1 & T2) in the linear range of the plot and obtain the corresponding values for the Absorbance (Abs1 and Abs2). 5. Calculations: Calculate the slope for all samples, including Enzyme Activity Control (EC), by dividing the net ΔAbs (Abs2- Abs1) values by the time ΔT (T2-T1). Calculate % Relative Inhibition as follows:
II

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

IV รีเอเจนต์ของผู้ใช้และอุปกรณ์ที่มา:  96
หลุมจานชัดเจนกับด้านล่างแบนอ่านไมโครโวลต์ การจัดเก็บและการจัดการ: ชุดเก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสป้องกันจากแสง หลีกเลี่ยงการทำซ้ำแช่แข็ง / ละลายสำหรับทุกชิ้นส่วนที่ไม่บัฟเฟอร์ สั้น ๆ centrifuge ขวดเล็ก ๆ ก่อนที่จะเปิด อ่านโปรโตคอลทั้งหมดก่อนที่จะดำเนินการทดสอบได้.
พระมงกุฎเกล้าเจ้าอยู่หัว น้ำยาเตรียมและจัดเก็บ Tyrosinase พื้นผิว: ละลายสารตั้งต้นไทโรซิเนแห้งใน 220 ไมโครลิตร ddH2O ใช้ภายในสองเดือน เก็บในน้ำแข็งในขณะใช้งาน  Tyrosinase: ละลายไทโรซิเนแห้งใน 220 ไมโครลิตร Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ หารและจัดเก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส หลีกเลี่ยงการแช่แข็งซ้ำ / รอบละลาย ใช้ภายในสองเดือน เก็บในน้ำแข็งในขณะใช้งาน  Tyrosinase Enhancer: พร้อมใช้งาน ปกป้องจากแสง เก็บที่อุณหภูมิห้องในขณะใช้งาน การควบคุมยับยั้ง (Kojic Acid): เพิ่ม 75 ไมโครลิตรของ ddH2O ที่จะทำให้การแก้ปัญหาสต็อกของ 10 มิลลิ Kojic Acid ผสมให้เข้ากัน ทำให้การแก้ปัญหา 0.75 มิลลิทำงานของ Kojic Acid โดยการเพิ่ม 92.5 ไมโครลิตรของ ddH2O 7.5 ไมโครลิตร 10 มิลลิ Kojic Acid แก้ปัญหาสต็อก ใช้ภายในสองเดือน.
ปกเกล้าเจ้าอยู่หัว tyrosinase ยับยั้งการคัดกรองพิธีสาร 1. การคัดกรองสารควบคุมและยับยั้งการเตรียมการควบคุมเปล่า: ละลายสารยับยั้งการทดสอบออกเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสม เจือจางความเข้มข้น 5 เท่าการทดสอบที่ต้องการด้วย Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ก่อนการใช้งาน เพิ่ม 20 ไมโครลิตรเจือจางสารยับยั้งการทดสอบ, การควบคุมยับยั้งการแก้ปัญหาการทำงานหรือ Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ลงไปในหลุมที่ได้รับมอบหมายเป็นสารยับยั้งการทดสอบ (ตัวอย่าง S), การควบคุมยับยั้ง (IC) หรือเอนไซม์ Tyrosinase ควบคุม (EC) หลุมตามลำดับ หลุมเพิ่มเติมกับเจือจางอนุกรมของสารยับยั้งการทดสอบอาจจะต้องเตรียมในเวลาถ้าต้องการนี้มี 20 ไมโครลิตรในผู้สมัครแต่ละคนได้ดี หมายเหตุ: ความเข้มข้นของตัวทำละลายที่ต้องการสุดท้ายไม่ควรเกิน 5% โดยปริมาตร ถ้าตัวทำละลายเกินกว่า 5% รวมถึงการควบคุมตัวทำละลายในการทดสอบผลของตัวทำละลายในการทำงานของเอนไซม์ 2. เอนไซม์ Tyrosinase โซลูชั่นการเตรียมสำหรับแต่ละดีเตรียมความพร้อม 50 ไมโครลิตรเอนไซม์ Tyrosinase โซลูชั่น 48 ไมโครลิตร Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ 2 ไมโครลิตร Tyrosinase ผสมกันและเพิ่ม 50 ไมโครลิตร / ดีในหลุมที่มีสารยับยั้งการทดสอบ, การควบคุมยับยั้งเอนไซม์และการควบคุม การผสม ฟักไข่เป็นเวลา 10 นาที ที่ 25 องศาเซลเซียส 3. การเตรียม Tyrosinase วิธีการแก้ปัญหาของพื้นผิว: สำหรับแต่ละดีเตรียมความพร้อม 30 ไมโครลิตรของ Tyrosinase วิธีการแก้ปัญหาของพื้นผิว 23 ไมโครลิตร Tyrosinase Assay บัฟเฟอร์ 2 ไมโครลิตร Tyrosinase พื้นผิว 5 ไมโครลิตร Tyrosinase Enhancer ผสมและเพิ่ม 30 ไมโครลิตรของ Tyrosinase โซลูชั่นในแต่ละพื้นผิวได้ดี ผสมให้เข้ากัน 4. การวัด: การวัดการดูดกลืนแสงในโหมดการเคลื่อนไหวสำหรับ 30-60 นาที ที่ 510 นาโนเมตร เลือกสองจุดเวลา (T1 และ T2) ในช่วงเชิงเส้นของพล็อตและได้รับค่าที่สอดคล้องกันสำหรับการดูดกลืนแสง (Abs1 และ Abs2) 5. การคำนวณ: คำนวณลาดชันสำหรับตัวอย่างทั้งหมดรวมทั้งการควบคุมกิจกรรมของเอนไซม์ (EC) โดยการหารΔAbsสุทธิ (Abs2- Abs1) ค่าตามเวลาΔTนี้ (T2-T1) คำนวณ%
ยับยั้งญาติดังนี้ครั้งที่สอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

4 . ผู้ใช้จัดหาสารเคมีและอุปกรณ์ :  96 ดีล้างจานแบนด้านล่างพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยผู้อ่าน
V . การจัดเก็บและการจัดการ : เก็บที่อุณหภูมิ - 20 องศา C ชุดป้องกันจากแสง หลีกเลี่ยงการทำซ้ำแช่แข็ง / ละลายสำหรับองค์ประกอบทั้งหมดบัฟเฟอร์ไม่ เครื่องหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กหลอดสั้น ๆก่อนที่จะเปิด อ่านกฎทั้งหมดก่อนที่จะแสดงตามลำดับ
6 การเตรียมรีเอเจนต์&กระเป๋า ไทโรซิเนส ( :ละลายโปรตีนไทโรซีน ( ใน 220 μผม ddh2o ใช้ภายใน 2 เดือน เก็บบนน้ำแข็งในขณะที่ใช้ ไทโรซิเนส : ละลายโปรตีนไทโรซีนใน 220 μแอล ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ การเทศนาและเก็บที่อุณหภูมิ - 20 องศา หลีกเลี่ยงรอบแช่แข็ง / ละลายซ้ำ ใช้ภายในสองเดือน เก็บบนน้ำแข็งในขณะที่ใช้ ไทโรซิเนส Enhancer : พร้อมใช้งาน ป้องกันแสงเก็บที่อุณหภูมิห้องขณะใช้ ควบคุมการใช้กรดโคจิก ) : เพิ่มµ 75 ลิตร ddh2o ให้หุ้นโซลูชั่นโคจิก 10 มม. กรด ผสมให้เข้ากัน ให้ 0.75 มม. ทำงานแก้ปัญหาของกรดโคจิกโดยการเพิ่มชั้นของ ddh2o 92.5 µ 7.5 µ L 10 mm กรดโคจิกหุ้นโซลูชั่น ใช้ภายในสองเดือน
VII ยับยั้งการคัดเลือกโปรไทโรซิเนส : 1 สารประกอบการคัดกรองควบคุมยับยั้ง และการเตรียมการควบคุมว่าง : ละลายการทดสอบเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสม เจือจางกับ 5x ที่ต้องการทดสอบสมาธิกับ ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ก่อนใช้ เพิ่ม 20 μฉันเจือจางทดสอบ inhibitors ซึ่งควบคุมการทำงาน โซลูชั่น หรือ ไทโรซิเนส ( buffer ลงในหลุมมอบหมาย เช่น การทดสอบตัวอย่าง ( , s ) , การควบคุม ( IC ) หรือสารยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส ( EC ) บ่อควบคุมตามลำดับ เวลส์เพิ่มเติมด้วยวิธีการทดสอบอนุกรมของโปรตีนอาจจะจัดในเวลานี้ถ้าต้องการ ประกอบด้วย 20 µ L ในผู้สมัครแต่ละคนด้วย หมายเหตุ : ที่ต้องการสุดท้ายตัวทำละลายความเข้มข้นไม่ควรเกิน 5 % โดยปริมาตร ถ้าละลายเกิน 5% รวมถึงการควบคุมสารเคมี เพื่อทดสอบผลของตัวทำละลายต่อกิจกรรมของเอนไซม์ 2 . การเตรียมสารละลายเอนไซม์ไทโรซิเนส :แต่ละคนก็เตรียม 50 μ l สารละลายเอนไซม์ ไทโรซิเนส . 48 μแอล ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ 2 μ L ไทโรซีนผสมกัน&เพิ่ม 50 μ L / ในบ่อที่มีสารยับยั้งเอนไซม์&ทดสอบการควบคุมการควบคุมยับยั้ง . ผสม พัก 10 นาทีที่ 25 º C 3 . ไท โรซิเนสพื้นผิวการเตรียมสารละลายสำหรับแต่ละคือเตรียม 30 µลิตร ไทโรซิเนส ( โซลูชั่น 23 μผม ไทโรซิเนส ( บัฟเฟอร์ 2 μแอล ไทโรซิเนส ( 5 µ L ไทโรซิเนส Enhancer ผสมและเพิ่ม 30 μ L ของสารละลายตั้งต้นไทโรซิเนสกันด้วย ผสมให้เข้ากัน 4 . วัด : วัดการดูดกลืนแสงในโหมดจลน์สำหรับ 30-60 นาที ที่ 510 nm .เลือกสองจุดเวลา ( & T1 T2 ) ในช่วงเชิงเส้นของพล็อตและได้รับค่านิยมที่สอดคล้องกันสำหรับการดูดกลืนแสง ( abs1 และ abs2 ) 5 . คำนวณคำนวณความชันอย่างทั้งหมด รวมทั้งการควบคุมเอนไซม์ ( EC ) โดยแบ่ง ABS Δสุทธิ ( abs2 - abs1 ) ค่าโดยเวลาΔ T ( t2-t1 ) คำนวณ % เทียบยับยั้งดังนี้
II