2.1. Ethics statementThe animals we

2.1. Ethics statement
The animals were treated in accordance with the Regulations of Experimental Animal Administration issued by State Committee of Science
and Technology of the People′s Republic of China on November 14,
1988. All animal experiments were carried out following protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the
Shandong Agriculture University. Rats were kept at an ambient temperature of 22 ± 2 °C and relative humidity of 55 ± 5% withfixed 12 h
light-dark cycle and free access to standard rodent pellet diet and tap
water. After the experiments, rats were sacrificed by CO2inhalation.
2.2. Chemicals and reagents
Mouse monoclonal antibodies to the B-cell leukaemia/lymphoma 2
(Bcl-2) and glucokinase (GCK), and rabbit monoclonal antibodies to
the Bcl2-associated X protein (Bax), cleaved caspase-3, pancreatic duodenal homeobox-1 (PDX-1), insulin, and glucose transporter 2 (GLUT2)
andβ-actin were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA, USA). Goat anti-rabbit tetramethylrhodamine isothiocyanate
(TRITC)-conjugated IgG and goat anti-mousefluorescein isothiocyanate
(FITC)-conjugated IgG were obtain from Invitrogen (Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA, USA). 4′, 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) nuclear stain
was from Biostatus (Loughborough, UK). An enhanced chemiluminescence western blots detection reagent was obtained from Amersham
(Buckinghamshire, UK). All other chemicals were from sigma-Aldrich
(St Louis, MO, USA).
2.3. Preparation and characterization of MLPII
MLPII was prepared by extraction from mulberry (Morus Multicaulis
Perr.) leaves and purified as previously described[25].Briefly, mulberry
leaf powder (100 g) was refluxed with 95% ethanol for 1 h to remove
lipophilic compounds, and successively boiled in water 3 times (for
1.5, 1.5, and 1 h). The pooledfiltrate was concentrated to a minimal volume in a rotary evaporator, and then was precipitated with ethanol
(80%v/v). This precipitates was deproteinated by the Sevag method
[26] and the resulting aqueous fractions were further decolored by
resin AB-8 to obtain crude polysaccharide. Crude polysaccharide was
dissolved in distilled water and further purified by ultrafiltration (membrane MW cut-off: 10,000) under pressure (0.5 MPa). Products with
molecular weights estimated to be less than 10,000 were fractionated
on DEAE Sepharose Fast Flow column and eluted with a linear gradient
of NaCl (0-2 mol/L). The major fraction was pooled, concentrated,
lyophilized and MLPII was further purified using a Sephadex G-100
column eluted with distilled water. The content of determination in
MLPII was approximately 99.6% (w/w) through glucose serving as a reference standard.
High-performance size-exclusion chromatography (HPSEC) was
employed to determine the molecular weight of MLPIIon an Agilent
1200 system as described by Honda et al.[27]. T-series dextrans standards (Sigma; St Louis, MO, USA) and MLPII sample were dissolved
water at a concentration of 2.0 mg/mL. Then, the sample (20μL) was
injected and eluted with distilled water at aflow rate of 0.6 mL/min at
40 °C. The retention time was recorded, and data were collected to
make a specification curve for analyzing molecular weight of MLPII.
The results indicated that MLPII molecular weight was approximately
8.1 kDa.
The chemical analysis of monosaccharides in MLPII was determined
by high performance liquid chromatography (HPLC). MLPII was
hydrolyzed into component monosaccharides and subsequently labeled
with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) as described by Honda
et al.[28], and then the labeled monosaccharide derivatives were
analyzed on the Agilent 1100 HPLC system (Agilent Technologies
Wilmington, USA) equipped with an Agilent four-unit pump, a 7125 injector and a G1314A UV detector. The results represented that MLPII
consists mainly of D-arabinose (5.1%), D-xylose (11.1%), D-glucose
(33.6%), D-rhamnose (5.3%) and D-mannose (44.9%).
2.4. Animals and induction of diabetes
Adult male albino rats of the Wistar strain weighing 140–160 g were
obtained from the Experimental Animal Center in Shandong University,
Jinan, Shandong Province. Rats were kept at an ambient temperature of
22 ± 2 °C and relative humidity of 55 ± 5% withfixed 12 h light-dark
cycle and free access to standard rodent pellet diet and tap water.
After 7 days acclimation, the rats were divided into two groups: a normal control group and type 2 diabetic group (untreated diabetic
group). In this study, type 2 diabetic rats were induced by high diet fat
(HFD) and a low-dose STZ injection. In brief, rats in the type 2 diabetic group were given high-fat diet consisting of 20% sucrose, 10% lard,
2.0% cholesterol, 0.5% cholate and 67.5% normal food. Even though
there was some minor difference among the contents of vitamins,
minerals and other alimentary components, it didn’taffecttheestablishment of type 2 diabetes model. Rats in the normal control group
containing 20 rats were continually fed normal food. After 5 weeks
of the high-fat diet, rats were fasted for 12 h (free access to tap
water) and each rat was injected intraperitoneally with 35 mg/kg
STZ (Sigma, St. Louis, MO, USA) in 0.1 M citrate buffer, pH 4.5, whereas rats in the normal control group were injected with only the buffer
solution. Seven days after the injection, rats were fasted for 12 h (free
access to tap water) and treated with glucose (2 g/kg, p.o.). The
blood glucose levels at 0 min and 120 min after the glucose treatment were determined using an One-Touch Ultra blood glucose
meter (LifeScan, Milpitas, CA, USA). Rats with blood glucose level
≥7.8 mmol/L at 0 min and≥11.1 mmol/L at 120 min were considered to be diabetic.
2.5. Experimental design
From the above high fat diet treated rats, 50 rats that have developed
diabetes were randomly divided into two groups: an untreated diabetic
group (UD, n = 25) and a MLPII- treated (200 mg/kg body weight/day)
diabetic group (MD, n = 25). The MLPII-treated diabetic rats received
the MLPII dissolved in 2 mL of distilled water, while rats in the normal
control group (NC, n = 25) and untreated diabetic group received an
equal volume of distilled water. The treatment was given daily through
oral gavage for 5 weeks. In addition, the rats in the normal control group
were continually given normal food, while rats in the untreated diabetic
group and MLPII-treated diabetic group received the high-fat diet for
the whole duration of the experiment.
249 Y. Zhang et al. / International Immunopharmacology 22 (2014) 248–257
2.6. Oral glucose tolerance test
An oral glucose tolerance test (OGTT) was carried out at the end of
the experiment. After fasting for 12 h, rats were gavaged with 2 g/kg
body weight of D-glucose (200 mg/mL). Blood samples were taken
fromthesamemainveinat0,15,30,60,90,and120minafterglucose
treatment, respectively. The blood glucose and insulin levels were determined using an One-Touch Ultra blood glucose meter and radioimmunoassay kits (Bejing Chemclin Biotech, Beijing, China) respectively.
2.7. Collection of serum and pancreas
After 5 weeks of treatment, 10 rats of each group were fasted for
12 h (free access to water). Then, blood samples (1 ml from each rat)
were collected on tubes treated with 0.1 M EDTA as anticoagulant,
and centrifuged at 3,000 g for 10 min at 4 °C to separate the plasma
and serum. The serum was immediately stored at -80 °C until use.
After blood withdrawing, the pancreas was also excised immediately
and rinsed in ice-chilled normal saline. Pancreas from 5 rats of each
group were preserved in 10% neutral buffered formalin and then embedded in paraffin for light and confocal microscopy. The pancreas
from another 5 rats of each group was cut into 1 mm cubes and immersed in 2.5% glutaraldehyde (primaryfixative) overnight for electron microscopy.
2.8. Determination of serum insulin and pancreas insulin
Levels of serum insulin were determined with HH6003γradioimmunoassay analyzer (Chinese Nuclear Instrument and Equipment, Co.,
Beijing, China) using radioimmunoassay kits purchased from Bejing
Chemclin Biotech (Beijing, China). Pancreas were grinded and centrifuged, the supernatant was used for insulin determine using radioimmunoassay kits as well.
2.9. Pancreatic morphological techniques
Each piece of pancreas embedded in paraffin was sectioned at 4μm.
To detect insulin, sections were incubated with a rabbit anti-insulin
monoclonal antibody (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco,
CA) followed by the avidin-biotin peroxidase complex method of visualization. Apoptoticβ-cells in pancreatic islets were stained using the
terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP nick-end labeling
(TUNEL) method according to the manufacturer′instructions (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) as previously described
[29]. The apoptosis index was expressed as a percentage ratio of the
number of apoptotic cells to the total number of cells in a minimum of
six islets from the pancreas of each group of rats (n = 5/group). For
electron microscopy, small fragments of pancreatic tissue werefixed
with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, post-fixed
in 1% osmium tetroxide solution (pH 7.4) for 2 hours, and processed
into resin. Semithin sections were cut and stained with toluidine blue.
Ultrathin sections were cut and stained with uranyl acetate and lead citrate, and then examined under an transmission electron microscope
(JEM 1200 EX; JEOL, Tokyo, Japan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1. จริยธรรมงบสัตว์ได้รับการรักษาตามที่ระเบียบของทดลองสัตว์บริหารออก โดยคณะกรรมการวิทยาศาสตร์รัฐและเทคโนโลยีของ People′s สาธารณรัฐจีนบน 14 พฤศจิกายน1988 ได้ดำเนินการทดลองสัตว์ทั้งโพรโทคออนุมัติ โดยสถาบันสัตว์ดูแลและใช้คณะกรรมการมหาวิทยาลัยเกษตรมณฑลซานตง หนูที่ถูกเก็บไว้ที่มีอุณหภูมิของ 22 ± 2 ° C และความชื้นสัมพัทธ์ของ withfixed 55 ± 5% 12 hวงจรไฟมืดและมีเม็ด rodent มาตรฐานอาหาร และเคาะน้ำ หลังจากทดลอง หนูถูกนำไปบูชายัญ ด้วย CO2inhalation2.2. เคมีและ reagentsแอนตี้ monoclonal เมาส์เพื่อ leukaemia/คอ ลลาจากเซลล์ B 2(Bcl-2) และ glucokinase (GCK), และแอนตี้ monoclonal กระต่ายไปการ Bcl2 สัมพันธ์ X caspase-3 โปรตีน (Bax), แหวก ตับอ่อน duodenal homeobox-1 (PDX-1), อินซูลิน และการขนส่งกลูโคส 2 (GLUT2)แอกติน andβ ซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ซานตาครูซCA, USA) แพะกระต่ายป้องกัน tetramethylrhodamine isothiocyanate(TRITC) -กลวง isothiocyanate ต้าน mousefluorescein IgG และแพะ(FITC) -IgG กลวงได้รับจาก Invitrogen (Invitrogen Corp.คาร์ลส CA สหรัฐอเมริกา) 4′ คราบนิวเคลียร์ 6-diamino-2-phenylindole (DAPI)ได้จาก Biostatus (Loughborough สหราชอาณาจักร) รีเอเจนต์ตรวจกันบล็อทตะวันตก chemiluminescence พิเศษได้รับจาก Amersham(บักกิงแฮมเชอร์ สหราชอาณาจักร) สารเคมีอื่น ๆ ได้จากซิก Aldrich(Louis เซนต์ MO สหรัฐอเมริกา)2.3 การเตรียมและสมบัติของ MLPIIMLPII ถูกจัดทำ โดยสกัดจากใบหม่อน (Morus MulticaulisPerr) ใบ และบริสุทธิ์เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย [25] สั้น ๆ ใบหม่อนผง (100 กรัม) คือ refluxed กับเอทานอล 95% สำหรับ h 1 เอาสาร lipophilic และน้ำต้มติด ๆ กันใน 3 ครั้ง (สำหรับ1.5, 1.5 และ 1 h) Pooledfiltrate มีความเข้มข้นให้ปริมาณน้อยที่สุดใน evaporator โรตารี่ แล้ว ถูกตกตะกอน ด้วยเอทานอล(80%v/v) Precipitates นี้ถูก deproteinated โดยวิธี Sevag[26] และเศษอควีได้ถูก decolored โดยเพิ่มเติมresin AB-8 รับ polysaccharide ดิบ Polysaccharide น้ำมันถูกละลายในน้ำกลั่น และเติม บริสุทธิ์ โดย ultrafiltration (ตัดเยื่อ MW: 10000) ภายใต้ความดัน (0.5 แรง) ผลิตภัณฑ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณจะ น้อยกว่า 10000 ถูกแบ่งในคอลัมน์ DEAE Sepharose เร็วไหล และ eluted ด้วยการไล่ระดับสีแบบเส้นตรงของ NaCl (0-2 โมล/L) ส่วนใหญ่ถูกทางถูกพู เข้มข้นlyophilized และ MLPII ที่บริสุทธิ์ใช้ Sephadex G-100 เพิ่มเติมคอลัมน์ eluted ด้วยน้ำกลั่น เนื้อหาของความมุ่งมั่นในMLPII ประมาณ 99.6% (w/w) ผ่านกลูโคสที่ให้บริการเป็นมาตรฐานอ้างอิงได้มีประสิทธิภาพสูงขนาดแยก chromatography (HPSEC)การกำหนดน้ำหนักโมเลกุลของ MLPIIon Agilentระบบ 1200 ตามด้วยฮอนด้าร้อยเอ็ด al. [27] ชุด T dextrans มาตรฐาน (ซิก เซนท์ Louis, MO สหรัฐอเมริกา) และได้ส่วนยุบตัวอย่าง MLPIIน้ำที่ความเข้มข้นของ 2.0 mg/mL แล้ว เป็นตัวอย่าง (20μL)น้ำกลั่นฉีด และ eluted กับ aflow อัตรา 0.6 mL/นาที ที่40 องศาเซลเซียส บันทึกเวลาการเก็บรักษา และถูกใช้ในการรวบรวมข้อมูลทำให้เส้นโค้งจำเพาะสำหรับวิเคราะห์น้ำหนักโมเลกุลของ MLPIIผลระบุว่า น้ำหนักโมเลกุล MLPII มีประมาณ8.1 kDaกำหนดการวิเคราะห์เคมี monosaccharides ใน MLPIIด้วยประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography (HPLC) MLPII ถูกhydrolyzed เป็นคอมโพเนนต์ monosaccharides และป้ายชื่อในเวลาต่อมากับ 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) ตามที่อธิบายไว้ โดยฮอนด้าal. ร้อยเอ็ด [28], และอนุพันธ์ monosaccharide ป้ายได้วิเคราะห์ระบบ HPLC Agilent 1100 (Agilent เทคโนโลยีวิลมิ สหรัฐอเมริกา) พร้อม กับตัวปั๊ม 4 หน่วย Agilent อัด 7125 จับ G1314A UV MLPII ที่แสดงผลประกอบด้วยส่วนใหญ่ของ D-arabinose (5.1%), D xylose (11.1%) D-กลูโคส(33.6%), D-rhamnose (5.3%) และ D-mannose (44.9%)2.4. สัตว์และการเหนี่ยวนำของโรคเบาหวานหนู albino ผู้ใหญ่ชายของพันธุ์ Wistar ชั่ง 140 – 160 g ได้ได้รับจากตัวสัตว์ Experimental ในมณฑลซานตงมหาวิทยาลัยจี่หนาน มณฑล หนูที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิแวดล้อม22 ± 2 ° C และความชื้นสัมพัทธ์ของ 55 ± 5% withfixed 12 h ไฟมืดวงจรและมีมาตรฐานหนูเม็ดอาหารและน้ำประปาหลังจาก 7 วัน acclimation หนูได้แบ่งเป็น 2 กลุ่ม: กลุ่มควบคุมปกติและกลุ่มโรคเบาหวานชนิดที่ 2 (ไม่ถูกรักษาโรคเบาหวานกลุ่ม) ในการศึกษานี้ หนูเบาหวานชนิดที่ 2 ได้เกิดจากไขมันสูงอาหาร(HFD) และที่ปริมาณรังสีต่ำ STZ ฉีด สังเขป หนูในกลุ่มเป็นโรคเบาหวานชนิดที่ 2 ได้รับอาหารไขมันสูงประกอบด้วยซูโครส 20%, 10% น้ำมันหมู2.0% ไขมัน cholate 0.5% และอาหารปกติ 67.5% ถึงแม้ว่ามีบางความแตกต่างเล็กน้อยระหว่างเนื้อหาของวิตามินแร่ธาตุและองค์ประกอบอื่น ๆ ทางเดินอาหาร มัน didn'taffecttheestablishment รุ่นเบาหวานชนิดที่ 2 หนูในกลุ่มควบคุมปกติหนูมี 20 ได้อย่างต่อเนื่องเลี้ยงอาหารปกติ หลังจาก 5 สัปดาห์ของอาหารไขมันสูง หนูก็อดสำหรับ 12 h (ฟรีถึงเคาะน้ำ และหนูแต่ละถูกฉีด intraperitoneally กับ 35 มิลลิกรัม/กิโลกรัมSTZ (ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ใน 0.1 M ซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 4.5 ขณะหนูในกลุ่มควบคุมปกติถูกฉีด ด้วยบัฟเฟอร์เท่านั้นการแก้ปัญหา เจ็ดวันหลังจากฉีด หนูก็อดสำหรับ h (ฟรี 12เข้าไปแตะน้ำ) และกลูโคส (2 กรัม/กก. p.o.) รับ ที่ระดับน้ำตาลในเลือด ที่ 0 นาที และ 120 นาทีหลังจากการรักษาระดับน้ำตาลในถูกกำหนดใช้เป็นน้ำตาลในเลือดระบบ One-Touchเมตร (LifeScan ลปิตา CA, USA) หนูกับระดับน้ำตาลในเลือด≥7.8 mmol/L ที่ 0 นาที and≥11.1 mmol/L ใน 120 นาทีได้ถือเป็นโรคเบาหวาน2.5 การทดลองออกแบบจากข้อมูลข้างต้นถือว่าอาหารไขมันสูงหนู หนู 50 ที่มีพัฒนาโรคเบาหวานถูกสุ่มแบ่งเป็นสองกลุ่ม: เป็นโรคเบาหวานไม่ถูกรักษากลุ่ม (อุด n = 25) และ MLPII แบบรักษา (200 มิลลิกรัม/กิโลกรัมร่างกายน้ำหนัก/วัน)กลุ่มเป็นโรคเบาหวาน (MD, n = 25) MLPII ถือว่าเป็นโรคเบาหวานหนูรับMLPII ละลายใน 2 mL ของน้ำกลั่น ขณะหนูในปกติกลุ่มควบคุม (NC, n = 25) และไม่ถูกรักษาเบาหวานได้รับการน้ำกลั่นปริมาตรเท่ากัน การรักษาให้ทุกวันผ่านgavage ปาก 5 สัปดาห์ นอกจากนี้ หนูในกลุ่มควบคุมปกติได้รับอาหารปกติ ในขณะที่หนูในโรคเบาหวานไม่ถูกรักษาอย่างต่อเนื่องกลุ่มและกลุ่มโรคเบาหวาน MLPII ถือว่าได้รับอาหารไขมันสูงในระยะเวลาทั้งหมดของการทดลอง249 Y. Zhang et al. นานาชาติ Immunopharmacology 22 (2014) 248-2572.6 ทดสอบกลูโคสพูดยอมรับการทดสอบยอมรับปากกลูโคส (OGTT) ได้ดำเนินการจบการทดลอง หลังจากการถือศีลอดสำหรับ 12 h ไม่ gavaged กับ 2 กรัม/กก.น้ำหนักของ D-กลูโคส (200 mg/mL) มีนำตัวอย่างเลือดfromthesamemainveinat0, 15, 30, 60, 90, and120minafterglucoseรักษา ตามลำดับ เลือดน้ำตาลกลูโคสและอินซูลินระดับถูกกำหนดโดยใช้การสัมผัสหนึ่ง Ultra เลือดน้ำตาลกลูโคสเมตรและ radioimmunoassay ชุด (Bejing Chemclin เทคโนโลยีชีวภาพ ปักกิ่ง จีน) ตามลำดับ2.7 การเก็บซีรั่มและตับอ่อนหลังจาก 5 สัปดาห์ของการรักษา หนู 10 ของแต่ละกลุ่มก็อดสำหรับ12 h (ฟรีถึงน้ำ) แล้ว เลือดตัวอย่าง (1 ml จากหนูแต่ละ)ถูกรวบรวมไว้ในท่อรับ 0.1 M EDTA เป็น anticoagulantและ centrifuged ที่ 3000 g สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C เพื่อแยกพลาสม่าและซีรั่ม ทันทีเซรั่มถูกเก็บที่-80 ° C จนกว่าจะใช้หลังจากถอนเลือด ตับอ่อนถูกยัง excised ทันทีและ rinsed ในน้ำแข็งแช่น้ำเกลือปกติ ตับอ่อนจากหนู 5 ของแต่ละกลุ่มอยู่ใน 10% formalin ถูกบัฟเฟอร์กลางแล้ว ฝังในพาราฟินสำหรับแสง และ confocal microscopy ในตับอ่อนจากหนูอีก 5 ของแต่ละกลุ่ม ถูกตัดไป 1 มม.ยกกำลังสาม แล้วสัมผัส 2.5% glutaraldehyde (primaryfixative) ค้างคืนสำหรับ microscopy อิเล็กตรอน2.8 การกำหนดเซรั่มอินซูลินและอินซูลินตับอ่อนระดับอินซูลินในซีรั่มถูกกำหนด ด้วยวิเคราะห์ HH6003γradioimmunoassay (เครื่องจีนนิวเคลียร์และอุปกรณ์ จำกัดปักกิ่ง จีน) ใช้ radioimmunoassay ชุดซื้อจาก BejingChemclin เทคโนโลยีชีวภาพ (ปักกิ่ง จีน) ตับอ่อนถูก grinded และ centrifuged ใช้สำหรับอินซูลิน supernatant กำหนดใช้ radioimmunoassay ชุดเช่นกัน2.9. ตับอ่อนของเทคนิคแต่ละชิ้นส่วนของตับอ่อนฝังในพาราฟินถูกจัดแบ่งเป็นส่วน ๆ ที่ 4μmตรวจพบอินซูลิน ส่วนที่ incubated กับอินซูลินการป้องกันกระต่ายmonoclonal แอนติบอดี (Zymed Laboratories Inc. ใต้ San FranciscoCA) ตามวิธีซับซ้อน peroxidase avidin-ไบโอตินการแสดงภาพประกอบเพลง Apoptoticβ-เซลล์ในตับอ่อนเกาะมีสีโดยใช้การติดฉลากเทอร์มินัล deoxynucleotide transferase mediated dUTP นิคสิ้นสุดวิธีการ (TUNEL) ตาม manufacturer′instructions (โรชมันน์ไฮม์ ประเทศเยอรมนี Biochemicals โมเลกุล) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[29] การ apoptosis ดัชนีที่แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์อัตราส่วนของการจำนวนเซลล์ apoptotic จำนวนเซลล์ในขั้นต่ำหมู่ 6 จากตับอ่อนของแต่ละกลุ่มของหนู (n = 5/กลุ่ม) สำหรับอิเล็กตรอน microscopy ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ของเนื้อเยื่อตับอ่อน werefixedด้วยการ glutaraldehyde 2.5% ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 ที่หลังคงใน 1% ออสเมียมเทโตรไซด์โซลูชัน (pH 7.4) 2 ชั่วโมง และประมวลผลในยาง ส่วน semithin ถูกตัด และสี ด้วย toluidine สีฟ้าส่วน ultrathin ถูกตัดสีกับ uranyl acetate และนำซิเตรต และจากนั้น ตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนการส่ง(JEM 1200 อดีต JEOL โตเกียว ญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 คำสั่งจริยธรรมสัตว์ที่ได้รับการรักษาให้สอดคล้องกับข้อบังคับของการบริหารงานสัตว์ทดลองที่ออกโดยรัฐคณะกรรมการวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งสาธารณรัฐประชาชนจีนที่14 พฤศจิกายนปี1988 ทั้งหมดสัตว์ทดลองได้ดำเนินการดังต่อไปนี้โปรโตคอลรับการอนุมัติจากสถาบันการดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการของมณฑลซานตงมหาวิทยาลัยเกษตรกรรม หนูถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 22 ± 2 องศาเซลเซียสและความชื้นสัมพัทธ์ 55 ± 5% withfixed 12 ชั่วโมงวงจรไฟมืดและอิสระที่จะเข้าถึงอาหารเม็ดหนูมาตรฐานและแตะน้ำ หลังจากการทดลองหนูถูกเสียสละโดย CO2inhalation. 2.2 สารเคมีและสารเคมีเมาส์โคลนอลแอนติบอดีกับโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว B-cell / โรคมะเร็งต่อมน้ำเหลืองที่ 2 (Bcl-2) และ glucokinase (GCK) และโคลนอลแอนติบอดีกระต่ายBcl2 เกี่ยวข้องโปรตีน X (แบ็กซ์), ตัด caspase-3, homeobox- ลำไส้ตับอ่อน 1 (PDX- 1) อินซูลินและการขนย้ายน้ำตาลกลูโคส 2 (GLUT2) andβ-โปรตีนที่ซื้อมาจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ซานตาครูซ, CA, USA) แพะต่อต้านกระต่าย tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) -conjugated IgG แพะต่อต้าน mousefluorescein isothiocyanate (FITC) IgG -conjugated ถูกได้รับจาก Invitrogen (Invitrogen คอร์ป, คาร์ลส, CA, USA) 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) รอยเปื้อนนิวเคลียร์จากBiostatus (Loughborough สหราชอาณาจักร) ที่เพิ่มขึ้น chemiluminescence ตะวันตก blots สารการตรวจสอบที่ได้รับจาก Amersham (Buckinghamshire สหราชอาณาจักร) สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดมาจาก Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). 2.3 การเตรียมและลักษณะของ MLPII MLPII ถูกจัดทำขึ้นโดยการสกัดจากใบหม่อน (Morus Multicaulis Perr.) ใบและบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] .Briefly หม่อนผงใบ(100 กรัม) ถูก refluxed กับเอทานอล 95% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อเอาสารlipophilic และต้มในน้ำอย่างต่อเนื่อง 3 ครั้ง (สำหรับ1.5, 1.5 และ 1 ชั่วโมง) pooledfiltrate ที่ได้รับความเข้มข้นที่จะมีปริมาณน้อยที่สุดในเครื่องระเหยแบบหมุนและจากนั้นได้รับการตกตะกอนด้วยเอทานอล(80% v / v) ตกตะกอนนี้ถูก deproteinated โดยวิธี Sevag [26] และผลเศษส่วนน้ำถูก decolored ต่อไปโดยเรซินAB-8 ที่จะได้รับ polysaccharide น้ำมันดิบ polysaccharide น้ำมันดิบถูกละลายในน้ำกลั่นบริสุทธิ์ต่อไปโดยการกรอง(เมมเบรนเมกะวัตต์ตัด: 10,000 บาท) ภายใต้ความกดดัน (0.5 MPa) ผลิตภัณฑ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลคาดว่าจะน้อยกว่า 10,000 คนถูก fractionated ในคอลัมน์ DEAE Sepharose ไหลอย่างรวดเร็วและมีชะลาดเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์(0-2 โมล / ลิตร) ส่วนใหญ่ได้รับการรวบรวมเข้มข้นแห้งและ MLPII บริสุทธิ์ต่อไปโดยใช้ Sephadex G-100 คอลัมน์ชะด้วยน้ำกลั่น เนื้อหาของการกำหนดในMLPII อยู่ที่ประมาณ 99.6% (w / w) ผ่านกลูโคสให้บริการเป็นมาตรฐานอ้างอิง. ที่มีประสิทธิภาพสูงโคขนาดยกเว้น (HPSEC) ถูกใช้ในการตรวจสอบน้ำหนักโมเลกุลของMLPIIon Agilent 1200 ระบบตามที่อธิบายไว้โดยฮอนด้า et al. [27] เสื้อชุดมาตรฐาน dextrans (ซิกม่า; St Louis, MO, USA) และตัวอย่าง MLPII ละลายน้ำที่ความเข้มข้น2.0 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร จากนั้นกลุ่มตัวอย่าง (20μL) ได้รับการฉีดและชะด้วยน้ำกลั่นในอัตราaflow 0.6 มิลลิลิตร / นาทีที่40 ° C เวลาการเก็บรักษาได้รับการบันทึกและเก็บรวบรวมข้อมูลที่จะทำให้โค้งสเปคสำหรับการวิเคราะห์น้ำหนักโมเลกุล MLPII. ผลการวิจัยพบว่าน้ำหนักโมเลกุล MLPII ประมาณ8.1 กิโลดาลตัน. การวิเคราะห์ทางเคมีของ monosaccharides ใน MLPII ถูกกำหนดโดยมีประสิทธิภาพสูงของเหลวchromatography (HPLC ) MLPII ถูกไฮโดรไลซ์เข้าmonosaccharides ส่วนประกอบและติดป้ายต่อมา1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) ตามที่อธิบายไว้โดยฮอนด้าet al. [28] และจากนั้นอนุพันธ์โมโนแซ็กคาไรด์ที่มีข้อความถูกวิเคราะห์ในระบบAgilent 1100 HPLC ( Agilent Technologies Wilmington, USA) พร้อมกับ Agilent ปั๊มสี่หน่วยหัวฉีด 7125 และเครื่องตรวจจับรังสียูวี G1314A ผลการแสดงที่ MLPII ประกอบด้วยส่วนใหญ่ของ D-arabinose (5.1%) D-ไซโลส (11.1%) D-กลูโคส(33.6%) D-แรมโนส (5.3%) และ D-mannose (44.9%). 2.4 สัตว์และการเหนี่ยวนำของโรคเบาหวานผู้ใหญ่หนูเผือกชายของสายพันธุ์วิสตาร์ที่มีน้ำหนัก 140-160 กรัมได้รับจากศูนย์สัตว์ทดลองในมหาวิทยาลัยชานตงจี่หนานมณฑลซานตง หนูถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ22 ± 2 องศาเซลเซียสและความชื้นสัมพัทธ์ 55 ± 5% withfixed 12 ชั่วโมงแสงมืดวงจรและอิสระที่จะเข้าถึงอาหารเม็ดหนูมาตรฐานน้ำประปา. หลังจากที่ปรับตัว 7 วันหนูถูกแบ่งออกเป็น สองกลุ่มคือกลุ่มควบคุมปกติและชนิดที่ 2 กลุ่มที่เป็นโรคเบาหวาน (โรคเบาหวานได้รับการรักษากลุ่ม) ในการศึกษานี้ชนิดที่ 2 หนูเบาหวานที่เกิดจากการได้รับไขมันในอาหารสูง(HFD) และขนาดต่ำฉีด STZ ในช่วงสั้น ๆ หนูในชนิดที่ 2 โรคเบาหวานกลุ่มที่ได้รับอาหารที่มีไขมันสูงซึ่งประกอบด้วยน้ำตาลซูโครส 20%, น้ำมันหมู 10% คอเลสเตอรอล 2.0%, 0.5% และ 67.5 cholate% อาหารปกติ แม้ว่าจะมีบางความแตกต่างเล็ก ๆ น้อย ๆ ในหมู่เนื้อหาของวิตามินแร่ธาตุและองค์ประกอบทางเดินอาหารอื่นๆ ก็ didn'taffecttheestablishment ประเภทรุ่น 2 โรคเบาหวาน หนูในกลุ่มควบคุมตามปกติมี 20 หนูได้รับการเลี้ยงดูอย่างต่อเนื่องอาหารปกติ หลังจากที่สัปดาห์ที่ 5 ของอาหารที่มีไขมันสูงหนูถูกอดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมง (บริการฟรีที่จะแตะน้ำ) และหนูแต่ละคนเข้า intraperitoneally 35 mg / kg STZ (Sigma, เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) ใน 0.1 M ซิเตรต บัฟเฟอร์ pH 4.5 ในขณะที่หนูในกลุ่มควบคุมตามปกติถูกฉีดมีเพียงบัฟเฟอร์การแก้ปัญหา เจ็ดวันหลังจากฉีดหนูถูกอดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมง (ฟรีเข้าถึงน้ำประปา) และรับการรักษาด้วยกลูโคส (2 กรัม / กิโลกรัม, ปอ) ระดับน้ำตาลในเลือดที่ 0 นาทีและ 120 นาทีหลังการรักษากลูโคสได้รับการพิจารณาโดยใช้ One-Touch น้ำตาลในเลือดอัลตร้าเมตร(LifeScan, ซานโฮเซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) หนูที่มีระดับน้ำตาลในเลือด≥7.8มิลลิโมล / ลิตรที่ 0 นาทีand≥11.1มิลลิโมล / ลิตรที่ 120 นาทีได้รับการพิจารณาให้เป็นโรคเบาหวาน. 2.5 การออกแบบการทดลองจากการรับประทานอาหารที่มีไขมันสูงดังกล่าวข้างต้นได้รับการรักษาหนู 50 หนูที่มีการพัฒนาโรคเบาหวานถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่มคือผู้ป่วยโรคเบาหวานได้รับการรักษากลุ่ม(UD, n = 25) และได้รับการรักษา MLPII- (200 มิลลิกรัม / กิโลกรัมน้ำหนักตัว / วัน) กลุ่มผู้ป่วยโรคเบาหวาน (MD, n = 25) หนูเบาหวาน MLPII รับการรักษาที่ได้รับMLPII ละลายใน 2 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นในขณะที่หนูปกติในกลุ่มควบคุม(NC, n = 25) และกลุ่มผู้ป่วยโรคเบาหวานได้รับการรักษาที่ได้รับปริมาณที่เท่ากันของน้ำกลั่น การรักษาที่ได้รับในชีวิตประจำวันผ่านการติดชื้อนานในช่องปากเป็นเวลา 5 สัปดาห์ที่ผ่านมา นอกจากนี้หนูในกลุ่มควบคุมตามปกติที่ได้รับอย่างต่อเนื่องอาหารตามปกติในขณะที่หนูในผู้ป่วยโรคเบาหวานได้รับการรักษาของกลุ่มและกลุ่มผู้ป่วยโรคเบาหวานMLPII รับการรักษาที่ได้รับอาหารที่มีไขมันสูงสำหรับระยะเวลาทั้งหมดของการทดลอง. 249 วาย Zhang et al, / นานาชาติ Immunopharmacology 22 (2014) 248-257 2.6 ช่องปากการทดสอบความทนทานต่อกลูโคสปากกลูโคสทดสอบความทนทานต่อ (OGTT) ได้ดำเนินการในตอนท้ายของการทดลอง หลังจากอดอาหาร 12 ชั่วโมงหนูถูก gavaged 2 กรัม / กิโลกรัมน้ำหนักตัวของD-กลูโคส (200 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ตัวอย่างเลือดถูกนำfromthesamemainveinat0,15,30,60,90, and120minafterglucose การรักษาตามลำดับ กลูโคสในเลือดและอินซูลินในระดับที่ได้รับการพิจารณาโดยใช้ One-Touch เมตรระดับน้ำตาลในเลือดและอัลตร้าชุด radioimmunoassay (Bejing Chemclin ไบโอเทค, ปักกิ่ง, จีน) ตามลำดับ. 2.7 คอลเลกชันของซีรั่มและตับอ่อนหลังจาก 5 สัปดาห์ของการรักษา 10 หนูของแต่ละกลุ่มได้รับการอดอาหาร 12 ชั่วโมง (ฟรีเข้าถึงน้ำ) จากนั้นตัวอย่างเลือด (1 มล. จากหนูในแต่ละ) ที่ถูกรวบรวมไว้ในท่อรับการรักษาด้วย 0.1 M EDTA เป็นสารกันเลือดแข็ง, และหมุนเหวี่ยงที่ 3,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 ° C ถึงแยกพลาสมาและซีรั่ม ซีรั่มเก็บไว้ทันทีที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งาน. หลังจากถอนเลือด, ตับอ่อนถูกตัดยังทันทีและล้างในน้ำเกลือน้ำแข็งแช่เย็น ตับอ่อนจาก 5 หนูของแต่ละกลุ่มได้รับการเก็บรักษาไว้ในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์กลาง10% และฝังตัวอยู่แล้วในพาราฟินสำหรับแสงและกล้องจุลทรรศน์ confocal ตับอ่อนจากอีก 5 หนูของแต่ละกลุ่มถูกตัดเป็นก้อน 1 มิลลิเมตรและแช่อยู่ใน 2.5% glutaraldehyde (primaryfixative) ในชั่วข้ามคืนสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน. 2.8 ความมุ่งมั่นของอินซูลินในซีรั่มและอินซูลินตับอ่อนระดับของอินซูลินในซีรั่มได้รับการพิจารณาที่มีการวิเคราะห์HH6003γradioimmunoassay (จีนนิวเคลียร์เครื่องมือและอุปกรณ์ จำกัด กรุงปักกิ่งประเทศจีน) โดยใช้ชุด radioimmunoassay ซื้อจาก Bejing Chemclin ไบโอเทค (กรุงปักกิ่งประเทศจีน) ตับอ่อนถูกบดและปั่น, ใสที่ใช้สำหรับตรวจสอบการใช้อินซูลินชุด radioimmunoassay เช่นกัน. 2.9 เทคนิคก้านตับอ่อนชิ้นส่วนของตับอ่อนที่ฝังอยู่ในแต่ละพาราฟินถูกแบ่งที่4μm. เพื่อตรวจสอบอินซูลินส่วนถูกบ่มกับกระต่ายต่อต้านอินซูลินแอนติบอดี (Zymed Laboratories Inc. , เซาท์ซานฟรานซิสโก) ตามด้วย peroxidase avidin-ไบโอตินที่ซับซ้อน วิธีการของการสร้างภาพ Apoptoticβเซลล์ในตับอ่อนเกาะเล็กเกาะน้อยมีการย้อมโดยใช้ขั้ว deoxynucleotide dUTP transferase พึ่งการติดฉลากกรงขังสิ้น (TUNEL) วิธีการตาม manufacturer'instructions นี้ (Roche โมเลกุลสารชีวเคมีและไฮม์, เยอรมนี) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[29] ดัชนีการตายของเซลล์ได้รับการแสดงเป็นอัตราส่วนร้อยละของจำนวนของเซลล์ที่เกิด apoptosis กับจำนวนของเซลล์ในอย่างน้อยหกเกาะเล็กเกาะน้อยจากตับอ่อนของแต่ละกลุ่มของหนู(n = 5 / กลุ่ม) สำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน, ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ของเนื้อเยื่อตับอ่อน werefixed กับ glutaraldehyde 2.5% ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 โพสต์คงที่1% วิธีการแก้ปัญหาออสเมียม tetroxide (pH 7.4) 2 ชั่วโมงและประมวลผลลงในเรซิน ส่วน Semithin ถูกตัดและย้อมด้วยสีฟ้า toluidine. ส่วน Ultrathin ถูกตัดและย้อมด้วยสีอะซิเตท uranyl และนำซิเตรตและการตรวจสอบแล้วภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนส่ง(JEM 1200 EX; JEOL โตเกียวประเทศญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . จริยธรรมงบ
สัตว์ได้รับการปฏิบัติตามกฎระเบียบของสัตว์ทดลองการบริหารที่ออกโดยคณะกรรมการวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีของรัฐ
คน’ s สาธารณรัฐจีนเมื่อ 14 พฤศจิกายน
1988 สัตว์ทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการดังต่อไปนี้โปรโตคอลได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการของสถาบัน และดูแลสัตว์ใช้
Shandong การเกษตรมหาวิทยาลัย