Many factors are speculated to infl

Many factors are speculated to influence efficiency and detection sensitivity of a molecular probe, such as sample treatment methods, autofluorescence of chlorophyll, and physiological station of target cells. Firstly, several necessary steps are usually taken to deal with the samples prior to observing fluorescent labeled target cells under the epifluorescence microscope. Lots of target cells are likely to be lost in the sample treatment steps, such as repeated centrifugation, pipetting, and washing in the earlier studies [32], [39]. This is specifically not fit for the natural samples in which the target species is a minor component. However, the subsequent filtration methods for the capture of target cells in the field samples [9], [20], as being adopted in this study, have already overcome this problem, avoiding the loss of even single cell. Secondly, red autofluorescence from abundant chlorophylls in algal cells could interfere with observation of the green fluorescence of target cells, which would possibly result in an underestimation of target cells. Therefore, an additional decolorization is likely a prerequisite prior to FISH analysis. This is sometimes true for the cells fixed by paraformaldehyde, which need a further ethanol or acetone treatment to reduce autofluorescence [43], [44]. However, the cells treated with the more widely used saline ethanol fixative are often competent for direct FISH analysis, without additional decolorization, because ethanol in the fixative could well destruct the chlorophylls. Some harmful algae, such as P. micans and Karenia spp. are exceptional (data not shown). When performing FISH analysis on them, the further methanol treatment to remove intensive red autofluorescence is necessary. Fortunately, the autofluorescence of P. donghaiense cells fixed by ethanol-based fixative was entirely removed. Thirdly and finally, varying rRNA content at different stage of target cells has been speculated to cause the detection efficiency variation [39], [42], [45]. However, the previous studies have shown that the variability of rRNA content does not influence the practical application of rRNA-targeted DNA probe, since the defection efficiency is relatively stable regardless of a little change in the fluorescence signal within a growth cycle [9], [39], [42]. Despite that the relationship between the growth stage and the detection efficiency is not investigated in this study, it is surprising to find the PNA probe could but the DNA probe could not labeled the dying or dead cells (Fig. 3 B, C), in which rRNA may mostly be decomposed. This also suggests that algal physiology could cause variation in detection efficiency of P. donghaiense for DNA probe due to varying rRNA content. Given the long time often taken to ship samples to the laboratory rRNA in cells may gradually decompose which should lead to reduced fluorescent intensity of labeled cells [20]. However, the more sensitive PNA probe will work well despite of less rRNA content. Therefore, it could be inferred that the PNA probe should be more suitable than its DNA analog for FISH analysis of field samples preserved for a long time.

In summary, the hybridization protocol adopted in this study is competent, and the PNA probe is more sensitive that its DNA analog, and therefore is promising for the monitoring of P. donghaiense in the natural samples in the future

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มีปัจจัยหลายอย่างที่มีการคาดการณ์จะมีผลต่อประสิทธิภาพและการตรวจสอบความไวของการสอบสวนโมเลกุลเช่นวิธีการรักษาตัวอย่าง Autofluorescence ของคลอโรฟิลและสถานีทางสรีรวิทยาของเซลล์เป้าหมาย ประการแรกขั้นตอนที่จำเป็นหลายมักจะนำมาใช้เพื่อจัดการกับกลุ่มตัวอย่างก่อนที่จะมีการสังเกตการเรืองแสงที่มีป้ายกำกับเซลล์เป้าหมายภายใต้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence จำนวนของเซลล์เป้าหมายมีแนวโน้มที่จะหายไปในขั้นตอนการรักษาตัวอย่างเช่นการหมุนเหวี่ยงซ้ำปิเปตและซักผ้าในการศึกษาก่อนหน้า [32], [39] นี่คือโดยเฉพาะไม่เหมาะสำหรับกลุ่มตัวอย่างที่เป็นธรรมชาติซึ่งในสายพันธุ์เป้าหมายเป็นส่วนประกอบเล็ก ๆ น้อย ๆ อย่างไรก็ตามวิธีการกรองตามมาสำหรับการจับตัวของเซลล์เป้าหมายในตัวอย่างสนาม [9] [20] ในขณะที่ถูกนำมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีอยู่แล้วเอาชนะปัญหานี้หลีกเลี่ยงการสูญเสียของเซลล์แม้เพียงครั้งเดียว ประการที่สอง Autofluorescence สีแดงจาก chlorophylls มากมายในเซลล์สาหร่ายอาจรบกวนการสังเกตของการเรืองแสงสีเขียวของเซลล์เป้าหมายซึ่งอาจจะส่งผลให้เบาของเซลล์เป้าหมาย ดังนั้นการลดสีเพิ่มเติมน่าจะเป็นสิ่งที่จำเป็นก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ปลา นี่คือบางครั้งความจริงสำหรับเซลล์ในการแก้ไขโดย paraformaldehyde ซึ่งจำเป็นต้องมีเอทานอลต่อไปหรือการรักษาเพื่อลดอะซีโตน Autofluorescence [43], [44] อย่างไรก็ตามเซลล์รักษาได้ด้วยการใช้กันอย่างแพร่หลายมากขึ้นตรึงน้ำเกลือเอทานอลมักจะมีความรู้ความสามารถในการวิเคราะห์ปลาโดยตรงโดยไม่ต้องลดสีเพิ่มเติมเพราะเอทานอลในการตรึงดีสามารถทำลาย chlorophylls บางสาหร่ายที่เป็นอันตรายเช่นพี micans และ Karenia เอสพีพี เป็นพิเศษ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เมื่อดำเนินการวิเคราะห์ปลาพวกเขารักษาเมทานอลต่อไปที่จะลบ Autofluorescence สีแดงเข้มข้นเป็นสิ่งที่จำเป็น โชคดีที่ Autofluorescence ของเซลล์ donghaiense พีแก้ไขโดยการตรึงเอทานอลที่ใช้จะถูกลบออกทั้งหมด ประการที่สามและในที่สุดก็แตกต่างกันเนื้อหา rRNA ในขั้นตอนที่แตกต่างกันของเซลล์เป้าหมายได้รับการสันนิษฐานที่จะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพการตรวจสอบ [39] [42], [45] อย่างไรก็ตามการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าความแปรปรวนของเนื้อหา rRNA ไม่ได้มีอิทธิพลต่อการใช้ประโยชน์ของการสอบสวนดีเอ็นเอ rRNA กำหนดเป้าหมายตั้งแต่ประสิทธิภาพเอาใจค่อนข้างมีเสถียรภาพโดยไม่คำนึงถึงการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในสัญญาณเรืองแสงภายในวงจรการเจริญเติบโต [9] ที่ [39] [42] แม้จะมีความสัมพันธ์ระหว่างระยะการเจริญเติบโตและประสิทธิภาพการตรวจสอบจะไม่ได้รับการตรวจสอบในการศึกษาครั้งนี้มันเป็นเรื่องที่น่าแปลกใจที่จะหาการสอบสวน PNA ทำได้ แต่การสอบสวนดีเอ็นเอไม่สามารถติดป้ายที่กำลังจะตายหรือตายเซลล์ (รูปที่ 3. B, C) ​​ใน ซึ่งส่วนใหญ่ rRNA อาจจะแตก นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าสรีรวิทยาสาหร่ายอาจก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการตรวจสอบประสิทธิภาพของพี donghaiense สำหรับการสอบสวนดีเอ็นเอเนื่องจากเนื้อหา rRNA ที่แตกต่างกัน ได้รับเป็นเวลานานมักจะนำตัวอย่างส่งไปยังห้องปฏิบัติการ rRNA ในเซลล์อาจค่อยๆย่อยสลายซึ่งจะนำไปสู่การลดความเข้มของการเรืองแสงของเซลล์ที่มีป้ายกำกับ [20] อย่างไรก็ตามการสอบสวน PNA ความสำคัญมากขึ้นจะทำงานได้ดีแม้จะมีเนื้อหา rRNA น้อย ดังนั้นมันอาจจะเหมาเอาว่าการสอบสวน PNA ควรจะเหมาะสมกว่าอนาล็อกดีเอ็นเอสำหรับการวิเคราะห์ปลาตัวอย่างข้อมูลที่เก็บรักษาไว้เป็นเวลานาน. ในการสรุปโปรโตคอลผสมพันธุ์นำมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีอำนาจและการสอบสวน PNA เป็นความสำคัญมากขึ้น ที่อะนาล็อกดีเอ็นเอและดังนั้นจึงมีแนวโน้มสำหรับการตรวจสอบของพี donghaiense ในตัวอย่างธรรมชาติในอนาคต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มีปัจจัยหลายอย่างที่มีอิทธิพลต่อประสิทธิภาพและตรวจสอบให้ความไวของการสอบสวนระดับโมเลกุล เช่น วิธีการรักษาตัวอย่าง autofluorescence คลอโรฟิลล์ และสถานีทางสรีรวิทยาของเซลล์เป้าหมาย ประการแรก เป็นขั้นตอนที่จำเป็นหลายมักจะดำเนินการจัดการกับตัวอย่างก่อน ให้สังเกตป้ายเรืองแสงเป้าหมาย epifluorescence เซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ จํานวนเซลล์เป้าหมาย มีแนวโน้มที่จะหายไปในตัวอย่างการรักษาตามขั้นตอน เช่น ปั่น pipetting ซ้ำ , , และซักผ้าในการศึกษาก่อนหน้านี้ [ 32 ] , [ 39 ] นี้โดยเฉพาะไม่เหมาะอย่างธรรมชาติ ซึ่งเป้าหมายชนิดเป็นส่วนประกอบรอง อย่างไรก็ตาม ภายหลังการกรองวิธีการจับเซลล์เป้าหมายในเขตตัวอย่าง [ 9 ] , [ 20 ] เป็นลูกบุญธรรมในการศึกษานี้ ได้เอาชนะปัญหาที่หลีกเลี่ยงการสูญเสียแม้แต่เซลล์เดียว ประการที่สอง จากคลอโรฟิลล์ในสาหร่ายสีแดง autofluorescence ดาษดื่นเซลล์อาจรบกวนกับการสังเกตของการเรืองแสงสีเขียวของเซลล์เป้าหมาย ซึ่งอาจจะส่งผลในการการประเมินค่าต่ำไปที่เซลล์เป้าหมาย ดังนั้นการเพิ่มโอกาสการเป็นเบื้องต้นก่อน ปลา การวิเคราะห์ นี้บางครั้งจริงสำหรับเซลล์ถาวร โดยพาราฟอร์มาลดิไฮด์ ซึ่งต้องการเอทานอลเพิ่มเติมหรืออะซิโตนรักษาเพื่อลด autofluorescence [ 43 ] , [ 44 ] อย่างไรก็ตาม เซลล์ที่ได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายมากขึ้นด้วยเอทานอลฟิกเซทีฟมักจะเชี่ยวชาญในการวิเคราะห์ปลาโดยตรง ไม่มีการเพิ่ม เพราะเอทานอลในฟิกเซทีฟอาจทำลายทั้งคลอโรฟิลล์ . บางอย่างที่เป็นอันตรายสาหร่าย เช่น หน้า micans karenia spp . และพิเศษ ( ข้อมูลไม่แสดง ) เมื่อแสดงปลาการวิเคราะห์เกี่ยวกับพวกเขา การรักษาเพิ่มเติมเพื่อเอาเมทานอลเข้มข้นสีแดง autofluorescence ที่จําเป็น โชคดีที่ autofluorescence ของหน้า donghaiense เซลล์ถาวร โดยเอทานอลตามฟิกเซทีฟคือทั้งหมดออก ประการที่สามและสุดท้าย เปลี่ยนเนื้อหาในขั้นตอนที่แตกต่างกันของแบคทีเรียเซลล์เป้าหมายได้รับการสันนิษฐานสาเหตุประสิทธิภาพการตรวจจับการเปลี่ยนแปลง [ 39 ] , [ 42 ] , [ 45 ] อย่างไรก็ตาม การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า ความแปรปรวนของปริมาณแบคทีเรียไม่มีอิทธิพลต่อการประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติของ rRNA ดีเอ็นเอเป้าหมาย เนื่องจากการเอาใจออกห่างประสิทธิภาพค่อนข้างมั่นคง ไม่ว่าเล็ก ๆน้อย ๆในการเปลี่ยนสัญญาณภายในวงจรการเจริญเติบโต [ 9 ] , [ 39 ] , [ 42 ] แม้ว่าความสัมพันธ์ระหว่างระยะการเจริญเติบโตและการตรวจสอบประสิทธิภาพไม่ศึกษาในการศึกษานี้ มันเป็นที่น่าแปลกใจที่จะพบ PNA ตรวจสอบดีเอ็นเอได้ แต่ไม่อาจระบุว่าตายหรือเซลล์ที่ตายแล้ว ( รูปที่ 3 B , C ) , ที่สร้างขึ้นส่วนใหญ่อาจจะย่อยสลาย นอกจากนี้ยังพบว่าสาหร่ายสามารถก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในประสิทธิภาพของการตรวจสอบหน้า donghaiense สำหรับดีเอ็นเอตรวจสอบ เนื่องจากเนื้อหาที่สร้างขึ้น . ให้เวลานานมักจะจัดส่งตัวอย่างไปยังห้องปฏิบัติการแบคทีเรียในเซลล์จะค่อยๆ ย่อยสลาย ซึ่งจะนำไปสู่ การเรืองแสงเข้มติดป้ายเซลล์ [ 20 ] อย่างไรก็ตาม การสอบสวน PNA อ่อนไหวจะทำงานได้ดีแม้จะมีปริมาณแบคทีเรียน้อยลง ดังนั้น จึงอาจจะบอกได้ว่า PNA ตัวน่าจะเหมาะกว่าอนาล็อกสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างดีเอ็นเอของปลาเขตดองไว้นานสรุปได้ว่า สารที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นโปรโตคอลที่เชี่ยวชาญ และพีเอ็นเอโพรบมีความไวของดีเอ็นเอแบบแอนะล็อก และดังนั้นจึงเป็นสัญญาสำหรับการตรวจสอบหน้า donghaiense ในตัวอย่างธรรมชาติในอนาคต