DGGE and cloning. amoA gene fragmen

DGGE and cloning. amoA gene fragments were amplified using a seminested approach in which products of an initial round of PCR with primers AmoA-1F and AmoA-2R-TC (31, 36) were agarose purified and used as template for a second round of PCR using the same primers, except that the forward primer(AmoA-1F) had a GC clamp attached to its 5 end. Agarose purification of PCR
products was performed by coring bands of the correct size using a sterile plastic pipette tip and transferring the excised core into a sterile PCR tube for the second round of PCR. Amplifications were performed using 0.5 M of each primer, 25 l of FailSafe PCR system reaction mix E (Epicenter Technologies,Madison, WI), 1 l DNA extract, and sterile pure water to a total reaction volume of 50 l. PCR was performed using a thermal cycler (Eppendorf Scientific Inc., Westbury, NY) under the following conditions: 94°C for 5 min; 28 cycles of 92°C for 1.0 min, 58°C for 1.0 min, and 72°C for 1.0 min; and a final extension at 72°C for 45 min.
Amplified amoA gene fragments (491 bp) were separated on 8% (wt/vol) acrylamide-bisacrylamide gels with a denaturant gradient of 20 to 60% ureaformamide at 60°C and 80 V for 16 h using a D-Code System (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA). The gels were stained with SYBR Gold (Molecular
Probes, Inc., Eugene, OR), visualized with a Dark Reader transilluminator (Clare Chemical Research, Inc., Dolores, CO), and photographed with a Canon Powershot A70 digital camera (Canon USA, Inc., Chesapeake, VA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

DGGE และการโคลน บางส่วนของยีน amoA ถูกขยายโดยใช้วิธีการ seminested ในผลิตภัณฑ์ใดของการ PCR รอบแรกกับไพรเมอร์ AmoA ชั้น 1 และ AmoA-2R-TC (31, 36) ได้ agarose บริสุทธิ์ และใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบสองของ PCR โดยใช้ไพรเมอร์เดียวกัน ยกเว้นว่า primer(AmoA-1F) ไปข้างหน้าได้ยึด GC ที่แนบท้าย 5 ของ ทำให้บริสุทธิ์ของ Agarose ของ PCRผลิตภัณฑ์ที่ดำเนินการ โดยวงดนตรีจากขนาดถูกต้องใช้คำปิเปตพลาสติกที่ผ่านการฆ่าเชื้อ และโอนหลักสรรพสามิตเข้าหลอด PCR เป็นหมันสำหรับรอบสองของ PCR Amplifications ดำเนินการโดยใช้ 0.5 ม.รองพื้น 25 l ของ PCR เลือกระบบปฏิกิริยาผสม E (ศูนย์กลางเทคโนโลยี เมดิสัน WI), สกัดดีเอ็นเอ 1 ลิตร และน้ำบริสุทธิ์ผ่าน 50 ระดับปฏิกิริยาทั้งหมดดำเนิน l. PCR โดยใช้ cycler ร้อน (Eppendorf วิทยาศาสตร์ Inc. เดอะโซโห NY) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 94° C 5 นาที รอบ 28 92° c 1.0 นาที 58° C 1.0 นาที และ 72° C 1.0 นาที และส่วนขยายสุดท้าย 72° c สำหรับ 45 นาทีขยายส่วนของยีน amoA (491 bp) แยกจากกันบนเจอะคริลาไมด์ bisacrylamide 8% (wt/vol) ด้วยการไล่ระดับสี denaturant ของ ureaformamide 20-60% ที่ 60° C และ 80 V ที่ 16 ชม.โดยใช้ระบบรหัส D (เชื้อ เฮอร์คิวลิส CA) เจลถูกย้อม ด้วย SYBR ทอง (โมเลกุลหัว Inc., Eugene, OR), มองเห็นกับ transilluminator มืดอ่าน (วิจัยเคมีแคลร์ Inc. โล CO), และการถ่ายภาพ ด้วยกล้องดิจิตอลแคนนอน Powershot A70 (สหรัฐอเมริกา แคนนอน เชสปีก VA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

DGGE และการโคลน AMOA ยีนเศษถูกขยายโดยใช้วิธีการ seminested ซึ่งผลิตภัณฑ์ของรอบแรกของ PCR กับไพรเมอร์ AMOA-1F และ AMOA-2R-TC (31, 36) เป็นบริสุทธิ์ agarose และใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สองของ PCR โดยใช้แบบเดียวกัน ไพรเมอร์ยกเว้นว่าไพรเมอร์ไปข้างหน้า (AMOA-1F) ได้ยึดติดอยู่กับ GC 5 ของตนหรือไม่ ปลาย การทำให้บริสุทธิ์ของ Agarose PCR
ผลิตภัณฑ์ได้ดำเนินการโดยเจาะวงดนตรีของขนาดที่ถูกต้องโดยใช้ปลายหมันพลาสติกปิเปตและถ่ายโอนหลักพอเข้าไปในหลอด PCR หมันสำหรับรอบที่สองของ PCR เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการโดยใช้ 0.5? M ของแต่ละไพรเมอร์ 25? ลิตร FailSafe PCR ผสมปฏิกิริยาระบบ E (เทคโนโลยี Epicenter, Madison, WI) 1 สารสกัดดีเอ็นเอ L และน้ำบริสุทธิ์ผ่านการฆ่าเชื้อปริมาณปฏิกิริยารวม 50? L PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ Cycler ความร้อน (Eppendorf วิทยาศาสตร์อิงค์นิวยอร์กซิตี้) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 94 ° C เป็นเวลา 5 นาที; 28 รอบ 92 ° C เป็นเวลา 1.0 นาที, 58 ° C เป็นเวลา 1.0 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.0 นาที; และขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 นาที.
ขยาย AMOA เศษยีน (491 bp) ถูกแยกออกเมื่อวันที่ 8% (น้ำหนัก / ปริมาตร) เจลริลาไมด์-bisacrylamide กับการไล่ระดับสี denaturant 20 ถึง 60% ureaformamide ที่ 60 องศาเซลเซียสและ 80 V for 16 ชั่วโมงโดยใช้ระบบ D-Code (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, Hercules, CA) เจลถูกย้อมด้วยสี SYBR ทอง (Molecular
Probes, Inc Eugene, OR) มองเห็นด้วยความมืดอ่าน transilluminator (แคลร์วิจัยเคมี, Inc โดโลเรส, CO) และถ่ายภาพด้วยกล้องดิจิตอล Canon Powershot A70 (Canon สหรัฐอเมริกา , Inc เวอร์จิเนีย)