2. Materials and methods2.1. Microo

2. Materials and methods
2.1. Microorganisms and media
The fungal strain Monascus purpureus NFCCI 1756 was used from the fungal collections maintained at the National Fungal Culture Collection of India (NFCCIWDCM 932) located at our institute. Strain preservation and spore formation were
performed on Potato Dextrose Agar (PDA) medium (Hi-Media, India). The seed culture medium comprised of (g/L) malt extract 2.5, yeast extract 1.5, and glucose 5.0. The fermentation medium used for pigment production was the previously used synthetic medium [15] except replacing (g/L) CaCl2 0.1 with KCl 0.5. Thus, the chemically defined fermentation medium contained (g/L) glucose 20.0, C5H8NNaO4·H2O (monosodium glutamate, MSG) 5.0, KH2PO4 5.0, K2HPO4 5.0, MgSO4·7H2O 0.5, FeSO4·7H2O0.01, ZnSO4·7H2O0.01, MnSO4·H2O0.03, KCl 0.5. The pH of the medium was adjusted at 6.5 prior to sterilization. The bacterial strains used to assess antimicrobial activity of the purified pigment comprised of Bacillus megaterium (MCM B-357), Bacillus mycoides (MCM B-358), Bacillus subtilis (B-310), Salmonella typhimurium(MCMB-303), which were obtained from MACS-Collection of Microorganisms (MCM-WDCM-561) at our institute, and Salmonella typhi MTCC 531 and Escherichia coli MTCC 443 that were procured from
Microbial Type Culture Collection, IMTECH, Chandigarh, India.
2.2. Cultivation
Selected strain was transferred to PDA slants from stock culture and incubated at 28 ◦C. After 7 days, spores were harvested with sterile phosphate buffer (50mM, pH 7.0) and used for preparation of seed culture. Seed culturing was carried outin Erlenmeyer flasks (100 mL) containing 20mL medium inoculated with 0.5mL spore suspension (1×108 CFU/mL) for 4 days at 30 ◦C before being transferred to fermentation medium.
2.3. Fermentation
Prepared seed culture was transferred to the fermentation medium (50mL in 250mL Erlenmeyer flasks) and fermented for 13 days at 32 ◦C on a rotary shaker (150 rpm) in complete darkness. Growth of culture and pigment production were
estimated and recorded at various time intervals to test the effect of fermentation duration on them. Similarly, to optimize temperature, pH, carbon and nitrogen sources of medium, indifferent experiments, range of temperature (25–40 ◦C), initial pH (2–8) (as shown in Fig. 1), glucose (10–40 g/L), various nitrogen containing compounds (at a concentration equivalent to 0.5% MSG) and MSG (0.1–1.0%) (as shownin Fig. 2) were used. Optimization experiments were conducted by varying a single parameter at a time and keeping others as constant. Data presented in Figs. 1 and 2 are the mean of three replicates in each case with standard error. To estimate the pigment the mycelia were separated from fermented broth by filtration through membrane (0.8mm pore size). The cell-free culture filtrate was centrifuged at 8000rpm for 15 min. The supernatant was decanted and the extracellular pigment concentration was determined by spectrophotometer. Results obtained were expressed in terms of specific absorbance, a value proportional to pigment concentration [16].
2.4. Isolation and purification of new red pigment
Cell-free fermented broth (4 L) was used for pigment purification. The filtrate wasconcentrated to 1 L by using rotary evaporator (Rotavapor R-210, Buchi, Switzerland).
Concentrated broth was lyophilized and powdered. The powder (5.5 g) was extracted using hexane (total 500 mL) for 1 h in agitation (120 rpm) and concentrated to 2.4 g by using vacuum rotary evaporator. The extracted crude pigment was loaded to silica gel (60–120 mesh) column. Hexane, followed by various ratios of hexane and ethyl acetate were used as eluent. Column eluted fractions read through spectrophotometer between 300 and 700nm were pooled together. Finally, ethanol was used to elute the target compound (with other polar compounds). To obtain high purity compound additional preparative TLC step in the purification protocol was incorporated. This ethanol fraction was concentrated and applied
to preparative TLC (20cm×20 cm, silica gel G). The running solvent was a mixture of ethyl acetate, formic acid, acetic acid and water (100:11:11:26). The target band (Rf 0.42) was scrapped off, dissolved in ethanol, and separated from silica through filtration (Whatman No. 1 filter paper, Whatman, England). The sample was concentrated to dryness at 45 ◦C under reduced pressure in a rotary evaporator (Rotavapor RE, with cooler bath Julabo F40, Buchi). To further check the purity of the pigment the purified product was analyzed on C18 column (Techsphere 5ODS 4m, 250mm×4.6mm)using an analytical HPLC (Waters, Milford, USA) equipped with a 2487 dual absorbance detector (Waters), set at 400 and 500 nm. The flow rate was 0.5mLmin−1 using the mobile phase of acetonitrile mixed with water (80:20, v/v). The red pigment obtained from preparative TLC was further purified by semi-preparative HPLC (Waters, USA) on a C18 column
(100mm×19mm, XBridge Prep, Waters, USA) by using a separation gradient of water mixed with methanol (80:20 to 0:100, v/v) over 30 min. The flow rate was 0.8mLmin−1.
2.5. Chemical characterization
Chemical characterization of pure active compound was performed through UV–vis spectra, IR, GC–MS and NMR analyses. UV-analysis was carried out using a Shimadzu UV–vis scanning spectrophotometer (Model No. UV-2101 PC). Scanning was performed in a range between 200 and 700nm wavelength. For IR analysis, the sample was kept in vacuum desiccators over KOH pellets for 48 h, followed by IRspectral analysis with 1mg sample in a FTIR (FT/IR-420 Jasco, USA). GC–MS analysis was carried out using Shimadzu QP5000 spectrometer fitted with a Supelcowax- 10 capillary column, having 0.32mmID, 30mlength, and 30mfilm thickness. The product obtained was compared to the molecules reported in the literature and NIST (National Institute of Science and Technology, USA) library that was installed for reference. NMR spectra were recorded in CDCl3 at room temperature using Bruker WM500 spectrometer [500MHz(1HNMR)and 125MHz(13CNMR)]. Chemical shifts were given in ı-scale and were referenced to the solvent and to the TMS as internal
standard.
2.6. Antibacterial plate assay
Antibacterial activities of red pigments were examined by solid media bioassay test. Assay plates were prepared using Muller-Hinton agar (25 mL) poured in 90mm×15mm Petri plates. The agar surface of the Petri plates was seeded with
0.1mL of saline suspension of a 24-h grown test bacteria. A paper disc impregnated with the sample compound was placed in the centre of the seeded agar plates and incubated at 37 ◦C. Size of inhibition zones around paper discs was measured after 24 h of incubation. Data presented in Table 1 were the mean value of three replicates

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. จุลินทรีย์และสื่อสายพันธุ์เชื้อรา Monascus purpureus NFCCI เวลาถูกใช้จากชุดเก็บรวบรวมเชื้อรารักษาชาติเชื้อราวัฒนธรรมคอลเลกชันของอินเดีย (NFCCIWDCM 932) ตั้งอยู่ที่สถาบันของเรา ต้องใช้อนุรักษ์และก่อตัวของสปอร์ได้ทำกับมันฝรั่งขึ้น Agar (PDA) กลาง (Hi Media อินเดีย) สื่อวัฒนธรรมเมล็ดข้าวมอลต์ (g/L) ประกอบด้วยสารสกัดจาก 2.5 สารสกัดจากยีสต์ 1.5 และกลูโคส 5.0 สื่อการหมักที่ใช้สำหรับการผลิตเม็ดสีได้ก่อนหน้านี้ใช้สังเคราะห์สื่อ [15] ยกเว้นแทน (g/L) CaCl2 0.1 กับ KCl 0.5 ดังนั้น สื่อกำหนดสารเคมีหมักประกอบด้วยกลูโคส (g/L) 20.0, C5H8NNaO4· H2O (เมต ผงชูรส) 5.0, KH2PO4 5.0, MgSO4·7H2O, K2HPO4 5.0 0.5, FeSO4·7H2O0.01, ZnSO4·7H2O0.01, MnSO4· H2O0.03, KCl 0.5 PH ของตัวกลางมีการปรับปรุงที่ 6.5 ก่อนฆ่าเชื้อ สายพันธุ์แบคทีเรียที่ใช้ในการประเมินกิจกรรมจุลินทรีย์ของผงบริสุทธิ์ตั้งแต่คัด megaterium (MCM B-357), คัด mycoides (MCM B-358) คัด subtilis (B-310), สาย typhimurium(MCMB-303) ซึ่งได้รับมาจากแม็คคอลเลกชันของจุลินทรีย์ (MCM WDCM 561) ของ สถาบัน และซัล typhi MTCC 531 และ Escherichia coli MTCC 443 ถูกค้นหาจากคอลเลกชัน IMTECH จุลินทรีย์ชนิดวัฒนธรรมจันดิการ์ฮ อินเดีย 2.2 การเพาะปลูกต้องเลือกใช้ถูกโอนย้ายไป PDA slants จากวัฒนธรรมหุ้น และ incubated ที่ 28 ◦C หลังจาก 7 วัน เพาะเฟิร์นถูกเก็บเกี่ยว ด้วยใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (50 มม. pH 7.0) และใช้สำหรับการเตรียมเมล็ดวัฒนธรรม เมล็ด culturing ถูกจำหน่าย outin Erlenmeyer น้ำ (100 มล.) ที่ประกอบด้วยขนาดกลาง 20mL inoculated กับระงับสปอร์ 0.5mL (1 × 108 CFU/mL) สำหรับ 4 วันที่ 30 ◦C ก่อนการโอนย้ายไปหมักกลาง2.3 การหมักเตรียมเมล็ดวัฒนธรรมถูกโอนย้ายไปกลางหมัก (50 มล.ในน้ำ 250mL Erlenmeyer) และหมักในความมืดที่สมบูรณ์ 13 วันที่ 32 ◦C ในเชคเกอร์โรตารี่ (150 rpm) เจริญเติบโตของวัฒนธรรมและผงผลิตได้ประเมิน และบันทึกไว้ในช่วงเวลาต่าง ๆ เพื่อทดสอบผลของระยะเวลาการหมักให้ ในทำนองเดียวกัน ปรับอุณหภูมิ pH แหล่งคาร์บอนและไนโตรเจนของกลาง สนใจทดลอง ช่วงอุณหภูมิ (25 – 40 ◦C), เริ่มต้น pH (2-8) (ตามที่แสดงใน Fig. 1), กลูโคส (10 – 40 g/L) สารประกอบที่ประกอบด้วยไนโตรเจนต่าง ๆ (ที่ความเข้มข้นเท่ากับ 0.5% ผงชูรส) และผงชูรส (0.1-1.0%) (เป็น shownin Fig. 2) ใช้ เพิ่มประสิทธิภาพได้ดำเนินการทดลอง โดยแตกต่างกันพารามิเตอร์หนึ่งครั้ง และการรักษาอื่น ๆ เป็นค่าคง ข้อมูลที่แสดงใน Figs. 1 และ 2 มีค่าเฉลี่ยของ 3 เหมือนกับในแต่ละกรณีมีข้อผิดพลาดมาตรฐาน ประเมินเม็ดสี mycelia ถูกจัดแยกจากซุปหมัก โดยการกรองผ่านเมมเบรน (0.8 มม.ขนาดรูขุมขน) วัฒนธรรมที่ปราศจากเซลล์สารกรองได้ centrifuged ที่ 8000 rpm สำหรับ 15 นาที มี decanted supernatant และความเข้มข้นเม็ด extracellular ถูกกำหนด โดยเครื่องทดสอบกรดด่าง ผลลัพธ์ที่ได้ถูกแสดงในเฉพาะ absorbance ค่าสัดส่วน pigment เข้มข้น [16]2.4 การแยกและการฟอกเม็ดสีแดงใหม่เซลล์ฟรีร้าซุป (4 ลิตร) ใช้สำหรับฟอกเม็ดสี การสารกรอง wasconcentrated ใน 1 L โดย evaporator โรตารี่ (Rotavapor R-210, Buchi สวิตเซอร์แลนด์)ซุปเข้มข้น lyophilized และผง ผง (5.5 กรัม) ถูกสกัดโดยใช้เฮกเซน (รวม 500 mL) สำหรับ h 1 ในอาการกังวลต่อ (120 รอบต่อนาที) และเข้มข้นกับ 2.4 g โดย evaporator สิวโรตารี่ ผงน้ำมันแยกถูกโหลดคอลัมน์ซิลิก้าเจล (60 – 120 ตาข่าย) เฮกเซน ตาม ด้วยอัตราส่วนต่าง ๆ ของเฮกเซนเอทิล acetate ถูกใช้เป็น eluent ส่วนคอลัมน์ eluted ที่อ่านผ่านเครื่องทดสอบกรดด่างระหว่าง 300 และ 700nm ถูกทางถูกพูกัน สุดท้าย เอทานอลถูกใช้ elute เป้าหมายผสมกับสารอื่น ๆ ขั้วโลก) เพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์สูงผสม preparative TLC ขั้นตอนเพิ่มเติมในโพรโทคอลฟอกถูกรวม เข้มข้น และใช้เศษส่วนนี้เอทานอลการ preparative TLC (20 ซม. × 20 ซม. ซิลิก้าเจล G) ตัวทำละลายที่ใช้มีส่วนผสมของเอทิล acetate กรด กรดอะซิติก และน้ำ (100:11:11:26) วงเป้าหมาย (Rf 0.42) คือซากปิด ละลายในเอทานอล และแยกออกจากซิลิก้าผ่านเครื่องกรอง (Whatman No. 1 กระดาษกรอง Whatman อังกฤษ) ตัวอย่างเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้านที่ ◦C 45 ภายใต้ความดันลดใน evaporator โรตารี่ (Rotavapor อีกครั้ง กับน้ำเย็น Julabo F40, Buchi) ได้ เพิ่มเติม ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของผงผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ถูกวิเคราะห์ในคอลัมน์ C18 (Techsphere 5ODS 4 m, 250 มม. × 4. 6mm) โดยใช้การวิเคราะห์ HPLC (น้ำ ลฟอร์ด สหรัฐอเมริกา) มีการจับคู่ absorbance 2487 (น้ำ), การตั้งค่าที่ 400 และ 500 nm อัตราการไหล 0.5mLmin−1 ใช้ระยะเคลื่อนของ acetonitrile ผสมกับน้ำ (80:20, v/v) รงควัตถุสีแดงที่ได้รับจาก preparative TLC ที่บริสุทธิ์ต่อไป โดยกึ่ง preparative HPLC (น้ำ สหรัฐอเมริกา) ในคอลัมน์ C18(100 มม. × 19 มม. เตรียม XBridge น้ำ สหรัฐอเมริกา) โดยใช้การไล่ระดับสีแยกน้ำผสมกับเมทานอล (80:20 เพื่อ 0:100, v/v) กว่า 30 นาที 0.8mLmin−1 อัตราการไหลได้2.5. เคมีจำแนกคุณสมบัติทางเคมีของสารประกอบบริสุทธิ์งานที่ดำเนินการผ่าน UV – vis แรมสเป็คตรา IR, NMR และ GC – MS วิเคราะห์ วิเคราะห์ UV ทำออกใช้กับ Shimadzu UV – vis สแกนเครื่องทดสอบกรดด่าง (หมายเลขรุ่น พี UV-2101) การสแกนถูกดำเนินการในช่วงระหว่าง 200 และ 700nm ความยาวคลื่น สำหรับการวิเคราะห์ IR ตัวอย่างถูกจัดเก็บใน desiccators สูญญากาศผ่านเกาะเกล็ดสำหรับ h 48 ตาม IRspectral วิเคราะห์กับตัวอย่าง 1 มิลลิกรัมใน FTIR (Jasco FT/IR-420 สหรัฐอเมริกา) วิเคราะห์ GC – MS ถูกดำเนินการโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ Shimadzu QP5000 กับ Supelcowax - 10 รูพรุนคอลัมน์ มี 0.32mmID, 30mlength และความหนาของ mfilm 30 ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับได้เมื่อเทียบกับโมเลกุลในวรรณคดีและไลบรารีของ NIST (สถาบันแห่งชาติวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา) ที่ติดตั้งสำหรับการอ้างอิง NMR แรมสเป็คตราถูกบันทึกไว้ใน CDCl3 ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ Bruker WM500 [500MHz (1HNMR) และ 125MHz(13CNMR)] ได้รับในขนาดıกะเคมี และถูกอ้างอิงในตัวทำละลาย และ TMS เป็นภายในมาตรฐาน2.6 การทดสอบจานต้านเชื้อแบคทีเรียกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของสีแดงถูกตรวจสอบ โดยสื่อแข็ง bioassay ทดสอบ แผ่นทดสอบที่เตรียมโดยใช้มูลเลอร์ Hinton agar (25 mL) poured ในจาน Petri 90 มม. × 15 มม. พื้นผิวของจาน Petri agar มี seeded ด้วยsaline ระงับแบคทีเรีย 24 h ปลูกทดสอบ 0.1 มล. แผ่นดิสก์กระดาษ impregnated กับสารประกอบอย่างวางในศูนย์กลางของแผ่น seeded agar และ incubated ที่ 37 ◦C ขนาดโซนยับยั้งทั่วดิสก์กระดาษที่วัดหลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ ข้อมูลที่แสดงในตารางที่ 1 มีค่าเฉลี่ยของ 3 เหมือนกับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 จุลินทรีย์และสื่อ
Monascus purpureus สายพันธุ์เชื้อรา NFCCI 1756 ถูกนำมาใช้จากคอลเลกชันของเชื้อรารักษาชาติเชื้อราวัฒนธรรมของสะสมของอินเดีย (NFCCIWDCM 932) ตั้งอยู่ที่สถาบันของเรา การเก็บรักษาสายพันธุ์และสร้างสปอร์ได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับมันฝรั่ง Dextrose Agar (PDA) กลาง (Hi-สื่ออินเดีย)
อาหารเลี้ยงเมล็ดประกอบด้วย (กรัม / ลิตร) สารสกัดจากมอลต์ 2.5 ยีสต์สกัด 1.5 และ 5.0 กลูโคส กลางหมักที่ใช้ในการผลิตเม็ดสีเป็นสื่อสังเคราะห์ที่ใช้ก่อนหน้านี้ [15] ยกเว้นเปลี่ยน (กรัม / ลิตร) CaCl2 0.1 กับ 0.5 KCl ดังนั้นสื่อที่กำหนดไว้หมักสารเคมีที่มีอยู่ (กรัม / ลิตร) น้ำตาลกลูโคส 20.0, C5H8NNaO4 · H2O (ผงชูรสผงชูรส) 5.0 KH2PO4 5.0 K2HPO4 5.0 MgSO4 · 7H2O 0.5, FeSO4 · 7H2O0.01, ZnSO4 · 7H2O0.01, MnSO4 · H2O0.03, โพแทสเซียมคลอไรด์ 0.5 ค่า pH ของกลางที่ได้รับการตั้งค่าที่ 6.5 ก่อนที่จะมีการฆ่าเชื้อ สายพันธุ์แบคทีเรียใช้ในการประเมินฤทธิ์ต้านจุลชีพของเม็ดสีบริสุทธิ์ประกอบด้วย megaterium Bacillus (MCM B-357) mycoides Bacillus (MCM B-358) เชื้อ Bacillus subtilis (B-310) แบคทีเรีย Salmonella typhimurium (MCMB-303) ซึ่งเป็น ที่ได้รับจากแม็คคอลเลกชันของจุลินทรีย์ (MCM-WDCM-561) ที่สถาบันของเราและ Salmonella typhi MTCC 531 และอีโค MTCC 443
ที่ได้รับการจัดหาจากจุลินทรีย์ประเภทวัฒนธรรมคอลเลกชันIMTECH, Chandigarh อินเดีย.
2.2 การเพาะปลูกสายพันธุ์ที่เลือกถูกย้ายไป slants PDA จากการเพาะเลี้ยงสต็อกและบ่มที่ 28 ◦C
หลังจากวันที่ 7 สปอร์เก็บเกี่ยวกับฟอสเฟตบัฟเฟอร์หมัน (50 มมค่า pH 7.0) และใช้สำหรับการเตรียมความพร้อมของเชื้อ เมล็ดพันธุ์เพาะเลี้ยงได้ดำเนิน outin Erlenmeyer ขวด (100 มิลลิลิตร) ที่มีขนาดกลาง 20 มลเชื้อด้วยสปอร์แขวนลอย 0.5mL (1 × 108 โคโลนี / มิลลิลิตร) เป็นเวลา 4 วันวันที่ 30 ◦Cก่อนที่จะถูกโอนไปยังกลางหมัก.
2.3 หมักเตรียมเมล็ดวัฒนธรรมถูกย้ายไปอยู่กลางหมัก (50mL ในขวด 250mL Erlenmeyer) และการหมัก 13 วันที่ 32 ◦Cในเครื่องปั่นหมุน (150 รอบต่อนาที) ในความมืดที่สมบูรณ์
การเจริญเติบโตของวัฒนธรรมและการผลิตเม็ดสีถูกประมาณและบันทึกไว้ในช่วงเวลาต่างๆในการทดสอบผลของระยะเวลาการหมักกับพวกเขา
ในทำนองเดียวกันเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิ pH คาร์บอนและแหล่งไนโตรเจนของสื่อการทดลองไม่แยแสช่วงของอุณหภูมิ (25-40 ◦C) pH เริ่มต้น (2-8) (ดังแสดงในรูป. 1) น้ำตาล (10-40 กรัม / ลิตร) ไนโตรเจนต่างๆที่มีสารประกอบ (ผงชูรสที่มีความเข้มข้นเท่ากับ 0.5%) และผงชูรส (0.1-1.0%) (ที่ shownin รูป. 2) ถูกนำมาใช้ การเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองโดยการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์เดียวที่เวลาและการรักษาคนอื่น ๆ อย่างต่อเนื่อง ข้อมูลที่นำเสนอในมะเดื่อ ที่ 1 และ 2 มีค่าเฉลี่ยของสามซ้ำกันในแต่ละกรณีที่มีข้อผิดพลาดมาตรฐาน ในการประมาณการเม็ดสีเส้นใยถูกแยกออกจากน้ำหมักโดยการกรองผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (0.8mm ขนาดรูขุมขน) กรองการเพาะเลี้ยงเซลล์ฟรีถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8000rpm นาน 15 นาที สารละลายถูก decanted และความเข้มข้นของสารเม็ดสีถูกกำหนดโดย spectrophotometer ผลที่ได้มาแสดงในรูปของการดูดกลืนแสงเฉพาะค่าสัดส่วนกับความเข้มข้นของเม็ดสี [16].
2.4 การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของเม็ดสีแดงใหม่น้ำซุปหมักเซลล์ฟรี (4 ลิตร) ถูกนำมาใช้สำหรับการทำให้บริสุทธิ์เม็ดสี
กรอง wasconcentrated 1 ลิตรโดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน (Rotavapor R-210, Buchi วิตเซอร์แลนด์).
น้ำซุปเข้มข้นได้แห้งและผง ผง (5.5 กรัม) ถูกสกัดโดยใช้เฮกเซน (รวม 500 มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในการกวน (120 รอบต่อนาที) และความเข้มข้น 2.4 กรัมโดยใช้เครื่องดูดฝุ่นเครื่องระเหยแบบหมุน เม็ดสีดิบที่สกัดได้โหลดไปซิลิกาเจล (60-120 ตาข่าย) คอลัมน์ เฮกเซนตามอัตราส่วนต่างๆของเฮกเซนและเอทิลอะซิเตถูกนำมาใช้เป็นตัวชะ คอลัมน์เศษส่วนชะอ่านผ่าน spectrophotometer ระหว่าง 300 และ 700nm ถูกรวบรวมเข้าด้วยกัน สุดท้ายเอทานอลถูกใช้ในการชะสารเป้าหมาย (ด้วยสารขั้วอื่น ๆ ) ที่จะได้รับสารมีความบริสุทธิ์สูงขั้นตอนการเตรียม TLC เพิ่มเติมในโปรโตคอลบริสุทธิ์เป็น บริษัท ส่วนเอทานอลความเข้มข้นนี้ได้และนำไปใช้ในการเตรียม TLC (20 ซม× 20 ซมซิลิกาเจล G)
ตัวทำละลายที่ทำงานเป็นส่วนผสมของน้ำนมกรดฟอร์มิค, กรดอะซิติกและน้ำ (100: 11: 11: 26) วงดนตรีเป้าหมาย (Rf 0.42) ถูกทิ้งออกละลายในเอทานอลและแยกออกจากซิลิกาที่ผ่านการกรอง (Whatman ฉบับที่ 1 กระดาษกรอง Whatman อังกฤษ) ตัวอย่างเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้านที่ 45 ◦Cภายใต้ความกดดันที่ลดลงในเครื่องระเหยแบบหมุน (Rotavapor RE, มีห้องอาบน้ำเย็น Julabo F40, Buchi) เพื่อเป็นการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเม็ดสีผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์ในคอลัมน์ C18 (Techsphere 5ODS 4 เมตร 250 มม× 4.6mm) โดยใช้การวิเคราะห์ HPLC (Waters, ฟอร์ดสหรัฐอเมริกา) การติดตั้งเครื่องตรวจจับการดูดกลืนแสงแบบ dual 2487 (น้ำ) ตั้งอยู่ที่ 400 และ 500 นาโนเมตร อัตราการไหลเป็น 0.5mLmin-1 โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ของ acetonitrile ผสมกับน้ำ (80:20, v / v) เม็ดสีแดงที่ได้จากการเตรียม TLC บริสุทธิ์ต่อไปโดยกึ่งเตรียม HPLC (Waters, สหรัฐอเมริกา) ในคอลัมน์ C18
(100 มม× 19mm, XBridge เตรียมน้ำสหรัฐอเมริกา) โดยใช้การไล่ระดับสีแยกน้ำผสมกับเมทานอล (ที่ 80:20 0: 100 v / v) กว่า 30 นาที อัตราการไหลเป็น 0.8mLmin-1.
2.5 ลักษณะทางเคมีลักษณะทางเคมีของสารประกอบที่ใช้งานบริสุทธิ์ได้ดำเนินการผ่านสเปกตรัม UV-Vis, IR, GC-MS และ NMR วิเคราะห์
การวิเคราะห์รังสียูวีได้ดำเนินการโดยใช้ Shimadzu UV-Vis spectrophotometer สแกน (หมายเลขรุ่น UV-2101 PC) สแกนได้รับการดำเนินการในช่วงระหว่าง 200 และความยาวคลื่น 700nm สำหรับการวิเคราะห์ IR ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ในสูญญากาศ Desiccators มากกว่า KOH เม็ดเป็นเวลา 48 ชั่วโมงตามด้วยการวิเคราะห์ IRspectral ตัวอย่าง 1mg ใน FTIR (FT / IR-420 Jasco สหรัฐอเมริกา) การวิเคราะห์ GC-MS ได้รับการดำเนินการโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ Shimadzu QP5000 พอดีกับ Supelcowax- 10 คอลัมน์เส้นเลือดฝอยมี 0.32mmID, 30mlength และ 30 ความหนา mfilm ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับเมื่อเทียบกับโมเลกุลที่มีการรายงานในวรรณคดีและ NIST (National Institute of วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, USA) ห้องสมุดที่ถูกติดตั้งสำหรับการอ้างอิง สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกไว้ใน CDCl3 ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ Bruker WM500 [500MHz (1HNMR) และ 125MHz (13CNMR)] การเปลี่ยนแปลงทางเคมีที่ได้รับใน I-ขนาดและถูกอ้างอิงกับตัวทำละลายและไปทาง TMS
ภายในเป็นมาตรฐาน.
2.6 แผ่นแบคทีเรียทดสอบกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของเม็ดสีแดงมีการตรวจสอบโดยสื่อที่เป็นของแข็งการทดสอบทางชีวภาพ
แผ่นทดสอบถูกจัดทำขึ้นโดยใช้ Muller-Hinton agar (25 มิลลิลิตร) ในเท 90mm × 15mm แผ่น Petri พื้นผิวของวุ้นแผ่น Petri เป็นเมล็ดที่มี
0.1ml ของการระงับน้ำเกลือของโต 24 ชั่วโมงแบคทีเรียทดสอบ แผ่นกระดาษชุบด้วยสารตัวอย่างที่อยู่ในศูนย์กลางของแผ่นวุ้นเมล็ดและบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦C ขนาดของโซนยับยั้งทั่วแผ่นกระดาษวัดหลังจาก 24 ชั่วโมงของการบ่ม ข้อมูลที่นำเสนอในตารางที่ 1 มีค่าเฉลี่ยของสามซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . เชื้อจุลินทรีย์และเชื้อราเชื้อราสายพันธุ์สื่อ
purpureus nfcci 1756 ถูกใช้จากคอลเลกชันของเชื้อรารักษาวัฒนธรรมแห่งชาติที่เชื้อราคอลเลกชันของอินเดีย ( nfcciwdcm 932 ) ตั้งอยู่ที่สถาบันของเรา ความเครียดและการรักษาเชื้อรา )
) อาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextrose agar ( PDA ) ขนาดกลาง ( สื่อสูง อินเดีย )การเพาะเมล็ดปานกลาง ประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร malt extract สารสกัดจากยีสต์ 1.5 , 2.5 และ 5.0 กลูโคส . การหมักขนาดกลางใช้สำหรับการผลิตสีคือก่อนหน้านี้ใช้ synthetic medium [ 15 ] ยกเว้นแทน ( กรัม / ลิตร ) ผลิตด้วยปริมาณ 0.1 0.5 ดังนั้นทางกำหนดการหมัก medium ซึ่งประกอบด้วย ( กรัม / ลิตร ) คาดว่า c5h8nnao4 ด้วยกลูโคส , H2O ( ผงชูรส , ผงชูรส ) 5.0 , kh2po4 5.0 , k2hpo4 5.0 ,7h2o MgSO4 ใด้วย 0.5 feso4 ด้วย 7h2o0.01 znso4 7h2o0.01 mnso4 , ด้วย , ด้วย h2o0.03 KCl 0.5 พีเอชของอาหารปรับ 6.5 ก่อนการฆ่าเชื้อ การใช้แบคทีเรียเพื่อประเมินฤทธิ์ต้านจุลชีพของเม็ดสีบริสุทธิ์ของ Bacillus megaterium ( MCM ) b-357 ) , Bacillus mycoides ( MCM b-358 ) , Bacillus subtilis ( b-310 ) , Salmonella typhimurium ( mcmb-303 )ซึ่งได้จากการสะสมของจุลินทรีย์ ( แม็ค mcm-wdcm-561 ) ที่สถาบันของเรา และซาลโมเนลลาไทฟี mtcc และ Escherichia coli mtcc 443 ที่จัดหาจาก
จุลินทรีย์ประเภทวัฒนธรรมของสะสม imtech , Chandigarh , อินเดีย
2.2 . การเพาะปลูก
เมื่อยเลือกย้ายไป PDA slants วัฒนธรรมจากหุ้นและบ่มที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส ◦หลังจาก 7 วันสปอร์ถูกเก็บเกี่ยวกับการเป็นหมัน ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 50mm , pH 7.0 ) และใช้สำหรับการเตรียมเพาะเมล็ด การเพาะเลี้ยงเมล็ดแบกแบบขวดเออร์เลนเมเยอร์ ( 100 ml ) ประกอบด้วยหลอดขนาดกลางใส่ 0.5ml สปอร์แขวนลอย ( 1 × 108 CFU / ml ) 4 วันที่ 30 ◦ C ก่อนที่จะถูกโอนไปยังสื่อการหมัก
2.3 หมัก
เตรียมเพาะเมล็ดถูกย้ายไปหมักปานกลาง ( 50ml ในขวด 250ml เออร์เลนเมเยอร์ ) และหมักเป็นเวลา 13 วัน ที่ 32 ◦ C เครื่องปั่น Rotary ( 150 รอบต่อนาที ) ในความมืดที่สมบูรณ์ การเติบโตของวัฒนธรรมและการผลิตสีคือ
ประมาณและการบันทึกในช่วงเวลาต่าง ๆ เพื่อทดสอบผลของระยะเวลาในการหมักนั้น ในทำนองเดียวกัน การปรับอุณหภูมิ พีเอชคาร์บอนและไนโตรเจนของสื่อ ทดลองเฉยๆ ช่วงของอุณหภูมิ ( 25 – 40 ◦องศาเซลเซียส pH เริ่มต้น ( 2 – 8 ) ( ดังแสดงในรูปที่ 1 ) กลูโคส ( 10 – 40 กรัมต่อลิตร ) ต่าง ๆสารที่มีไนโตรเจน ( ที่ความเข้มข้นเทียบเท่ากับร้อยละ 0.5 และ 0.1 MSG ( ผงชูรส ) - 1.0% ) ( ดังรูปที่ 2 shownin ) สถิติที่ใช้การทดลองการเพิ่มประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์เดียวในเวลาและรักษาผู้อื่นเป็นค่าคงที่ ข้อมูลที่นำเสนอในผลมะเดื่อ . 1 และ 2 มีจำนวน 3 ซ้ำ ในแต่ละกรณีมีข้อผิดพลาดมาตรฐาน ประมาณเม็ดเส้นใยแยกจากน้ำหมักโดยการกรองผ่านเมมเบรน ( ขนาดรูขุมขน 0.8mm )การสังเคราะห์ culture filtrate คือระดับที่ 8000rpm เป็นเวลา 15 นาทีและความเข้มข้นของเม็ดสีสูง คือ รินและถูกกำหนดโดยวัสดุ ได้แสดงออกในแง่ของค่าเฉพาะค่าสัดส่วนความเข้มข้นของเม็ดสี [ 16 ] .
2.4 . การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของรงควัตถุสีแดงใหม่
มือถือฟรีน้ำหมัก ( 4 ลิตร ) ใช้สีบริสุทธิ์ 148 wasconcentrated 1 ลิตร โดยใช้เครื่องระเหย ( rotavapor r-210 บูชิ , สวิตเซอร์แลนด์ ) .
เข้มข้นน้ำซุปก็แห้งและผง . ผง ( 5.5 กรัม ) ถูกสกัดโดยใช้เฮกเซน ( รวม 500 มล. ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในการปั่น ( 120 รอบต่อนาที ) และความเข้มข้น 2.4 กรัม โดยใช้สุญญากาศระเหยสกัดเม็ดโหลดดิบเป็นซิลิกาเจล ( 60 - 120 ตาข่าย ) คอลัมน์ เฮกเซน ในอัตราส่วนต่างๆ ตามด้วยเฮกเซนและเอทิลอะซิเตท ใช้นี้ คอลัมน์ตัวอย่างเศษส่วนอ่านผ่านวัสดุระหว่าง 300 และ 700nm ถูกรวมเข้าด้วยกัน ในที่สุด เอทานอลที่ใช้ elute สารประกอบเป้าหมาย ( มีสารประกอบโพลาร์อื่น ๆ )เพื่อให้ได้สารประกอบเพิ่มเติมค่าความบริสุทธิ์สูง ( ขั้นตอนในการขั้นตอนถูกรวม . ส่วนนี้คือเอทานอลเข้มข้นและประยุกต์
เพื่อเตรียม TLC ( 20 × 20 ซม. , ซิลิกาเจลกรัม ) ที่ใช้เป็นสารผสมของเอทิลอะซิเตทตัวทำละลาย , กรด , กรดและน้ำ ( 100:11:11:26 ) วงเป้าหมาย ( RF 0.42 ) ถูกทำลายไปละลายในเอทานอลและแยกจากซิลิกาที่ผ่านการกรอง ( whatman 1 ไส้กรองกระดาษ whatman , อังกฤษ ) ตัวอย่างแบบแห้ง 45 ◦ C ภายใต้การลดความดันในเครื่องระเหยแบบหมุน ( rotavapor อีกครั้งกับอาบน้ำสูตรเย็น julabo บูชิ , ) เพื่อเพิ่มเติมการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเม็ดสีและผลิตภัณฑ์ วิเคราะห์ในคอลัมน์ c18 ( techsphere 5ods 4  M 250 มม. × 4.6mm ) โดยใช้ HPLC วิเคราะห์ ( น้ำมิลฟอร์ด , USA ) พร้อมกับ 2487 Dual การดูดกลืนแสงตรวจจับ ( น้ำ ) , การตั้งค่าที่ 400 และ 500 นาโนเมตร อัตราการไหลเท่ากับ 0.5mlmin − 1 โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ของไนไตรล์ผสมกับน้ำ ( 80 , V / V ) รงควัตถุสีแดงที่ได้จากค่า TLC ยังบริสุทธิ์ โดย HPLC กึ่งเบื้องต้น ( น้ำ , USA ) ใน c18 คอลัมน์
( 100 มม. × 19mm xbridge เตรียมน้ำสหรัฐอเมริกา ) โดยใช้การไล่ระดับของน้ำที่ผสมกับเมทานอล ( 80 ถึง 0 v / v ) กว่า 30 นาที อัตราการไหล คือ 0.8mlmin − 1 .
2.5 คุณสมบัติทางเคมี
คุณสมบัติทางเคมีของสารประกอบที่ใช้งานได้ทั้ง UV Vis บริสุทธิ์ผ่านสเปกตรัม , IR , MS และวิเคราะห์ GC และ NMR การวิเคราะห์ข้อมูลใช้ ยูวี UV Spectrophotometer ( Shimadzu ) ซึ่งการสแกนแบบ PC ไม่ uv-2101 )การกระทำในช่วงระหว่าง 200 และ 700nm ความยาวคลื่น การวิเคราะห์และ , ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ในโถทำแห้งสุญญากาศเหนือเกาะเม็ด 48 ชั่วโมง ตามด้วย มีตัวอย่างในการวิเคราะห์ irspectral 1mg ( ( ฟุต / ir-420 jasco , USA ) GC - นางสาววิเคราะห์โดยใช้กล้องติดตั้งกับ Shimadzu qp5000 supelcowax - คอลัมน์ , 10 ซึ่งมี 0.32mmid 30mlength , ,และ 30  mfilm ความหนา ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับเมื่อเทียบกับโมเลกุลของรายงานในวรรณคดีและ NIST ( สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติประเทศสหรัฐอเมริกา ) ห้องสมุดที่ถูกติดตั้งเพื่อใช้อ้างอิง NMR สเปกตรัมที่ได้ถูกบันทึกไว้ใน cdcl3 ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ BRUKER wm500 สเปกโตรมิเตอร์ [ 500MHz ( 1hnmr ) และ 125mhz ( 13cnmr ) ]เคมีกะได้รับในı - ขนาดและถูกอ้างอิงกับตัวทำละลายและเพื่อ TMS เป็นมาตรฐานภายใน
.
2.6 ต้านเชื้อแบคทีเรียแบคทีเรียในจานสีแดง
กิจกรรมทดสอบโดยวิธีทดสอบของแข็งสื่อ . ทดสอบจานเตรียมใช้ มุลเลอร์ ฮินตัน ( 25 มล. ) เทลงในจาน Petri 90mm × 15mm . การใช้พื้นผิวของจานเพาะเลี้ยงได้เมล็ดด้วย
0