synthesize enantiopure D-phenylglyc

synthesize enantiopure D-phenylglycine or D-4-hydroxyphenylglycine, the two important side-chains in high demand for the β-lactam antibiotics industry, in a single enzymatic step using L-glutamate as a lowcost amino donor. Biotechnological development in various aspects were attempted to make this enzymatic synthesis process effective and viable. Directed mutagenesis of dpgA gene to replace the C-terminus serine with cysteine could facilitate rapid and site specific immobilization of the D-PhgAT(S453C) on thiol-containing matrix while maintaining enzyme activity and enhancing its stability. Biocatalysis using the immobilized D-PhgAT(S453C) in a controlled-release system of Amberlite (IRA400)-adsorbed benzoylformate yielded a final Dphenylglycine concentration of 10.25 g.L-1. Two systems for D-PhgAT high-expression were developed. The first system was based on Escherichia coli host with chaperones coexpressions which improved the D-PhgAT yield from 0.44 to 1,768 unit.L-1.OD-1. In the second system, codon-optimized synthetic dpgA gene was expressed in Pichia pastoris with bacterial chaperones co-expressions which yielded D-PhgAT at 14,717 unit.L-1.OD-1. Problem of the inherently low solubility of the wild-type D-PhgAT was alleviated by structureguided mutagenesis which could increase the enzyme solubility from 11.5 to 51 mg/mL. During investigation of molecular and catalytic property of the D-PhgAT, a new method for determination of aminotransferase stereospecificity for C-4' hydrogen transfer on the coenzyme was developed. A spectrophotometric enzymatic cycling method using Lglutamate dehydrogenase and D-PhgAT for determination of L-glutamate in foods is another aspect of D-PhgAT application developed during this project. Genetically modification of the D-PhgAT to relief substrate inhibition, developing effective and logical systems for substrate addition and product removal are important research topics that should be done in the future.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สังเคราะห์ enantiopure D phenylglycine หรือ D-4-hydroxyphenylglycine สองสำคัญสายข้างในความต้องการสูงสำหรับอุตสาหกรรมยาปฏิชีวนะβ-lactam ในเอนไซม์ใช้ L-กลูตาผู้บริจาคมิโนเซอร์ กับการประพัฒนาในด้านต่าง ๆ มีความพยายามจะทำให้กระบวนการสังเคราะห์เอนไซม์ในระบบนี้มีประสิทธิภาพ และทำงานได้ Mutagenesis ของยีน dpgA จะแทนรอบเส้นใยประสาท C terminus cysteine สามารถอำนวยความสะดวกรวดเร็ว และเว็บไซต์โดยตรงตรึงเฉพาะของ D-PhgAT(S453C) บน thiol ที่ประกอบด้วยเมทริกซ์ในขณะรักษาเอนไซม์ และเพิ่มความเสถียร ใช้ D-PhgAT(S453C) แบบตรึงในระบบควบคุมรุ่นของ Amberlite (IRA400) Biocatalysis-benzoylformate ซับให้ผลความเข้มข้นสุดท้าย Dphenylglycine 10.25 g.L-1 D PhgAT สูงนิพจน์สองระบบได้รับการพัฒนา ระบบแรกคืออิง Escherichia coli โฮสต์กับ coexpressions ครูซึ่งผลตอบแทน D PhgAT จาก 0.44 1,768 หน่วย L-1 OD-1 แสดงรหัสพันธุกรรมที่ดีที่สุด dpgA สังเคราะห์ยีนในระบบที่สอง ใน Pichia pastoris กับแบคทีเรียครูร่วมนิพจน์ซึ่งให้ผล D PhgAT 14,717 หน่วย L-1 OD-1 ปัญหาของการละลายต่ำประมาณของป่าชนิด D-PhgAT ถูก alleviated โดย structureguided mutagenesis ซึ่งสามารถเพิ่มการละลายเอนไซม์จาก 11.5 ถึง 51 mg/mL ในระหว่างการตรวจสอบ ทรัพย์สินเร่งปฏิกิริยาโมเลกุลของ PhgAT D วิธีการใหม่สำหรับการกำหนด aminotransferase stereospecificity C-4' ไฮโดรเจนส่งครอบคลุมการได้รับการพัฒนา Spectrophotometric เอนไซม์ปั่นวิธีใช้พร่อง Lglutamate และ D-PhgAT สำหรับความมุ่งมั่นของ L-กลูตาในอาหารมีแง่มุมอื่นของ D-PhgAT เป็นโปรแกรมที่พัฒนาในโครงการนี้ พันธุกรรมเปลี่ยนแปลงของ D-PhgAT เพื่อยับยั้งบรรเทาพื้นผิว ระบบพัฒนาประสิทธิภาพ และตรรกะสำหรับการกำจัดผลิตภัณฑ์และนอกจากนี้พื้นผิวมีหัวข้องานวิจัยที่สำคัญที่ควรจะทำในอนาคต

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สังเคราะห์ enantiopure D-phenylglycine หรือ D-4-hydroxyphenylglycine ทั้งสองด้านที่สำคัญโซ่ในความต้องการสูงสำหรับอุตสาหกรรมยาปฏิชีวนะβ-lactam ในขั้นตอนเดียวโดยใช้เอนไซม์ L-กลูตาเมตเป็นผู้บริจาคอะมิโน lowcost การพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพในแง่มุมต่าง ๆ ได้รับการพยายามที่จะทำให้กระบวนการการสังเคราะห์เอนไซม์ที่มีประสิทธิภาพและทำงาน ฉับกำกับของ dpgA ยีนเพื่อแทนที่ซีรีน C-ปลายทางกับ cysteine ​​สามารถอำนวยความสะดวกรวดเร็วและเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงของการตรึง D-PhgAT (S453C) บน thiol ที่มีส่วนผสมของเมทริกซ์ในขณะที่รักษาเอนไซม์และเสริมสร้างความมั่นคงของ biocatalysis ใช้ตรึง D-PhgAT (S453C) ในระบบควบคุมการเปิดตัวของแอมเบอร์ (IRA400) benzoylformate -adsorbed ผลความเข้มข้น Dphenylglycine สุดท้ายของ 10.25 GL-1 ทั้งสองระบบ D-PhgAT สูงแสดงออกได้รับการพัฒนา ระบบแรกก็ขึ้นอยู่กับโฮสต์ Escherichia coli โดยมีครูใหญ่ coexpressions ซึ่งการปรับปรุงผลผลิต D-PhgAT จาก 0.44 ไป 1,768 unit.L-1.OD-1 ในระบบสอง codon ที่ดีที่สุดของยีนสังเคราะห์ dpgA ถูกแสดงใน pastoris Pichia กับครูใหญ่ของเชื้อแบคทีเรียร่วมแสดงออกซึ่งผล D-PhgAT ที่ 14,717 unit.L-1.OD-1 ปัญหาที่เกิดจากการละลายต่ำโดยเนื้อแท้ของป่าประเภท D-PhgAT ได้รับการบรรเทาโดยฉับ structureguided ซึ่งสามารถเพิ่มความสามารถในการละลายเอนไซม์ 11.5-51 mg / ml ในระหว่างการสืบสวนของโมเลกุลและการเร่งปฏิกิริยาทรัพย์สินของ D-PhgAT, วิธีการใหม่สำหรับการตัดสินใจของ stereospecificity aminotransferase สำหรับการถ่ายโอนไฮโดรเจน C-4 'บน Coenzyme ได้รับการพัฒนา วิธีการขี่จักรยานของเอนไซม์สเปกใช้ dehydrogenase Lglutamate และ D-PhgAT สำหรับการกำหนด L-กลูตาเมตในอาหารเป็นลักษณะของการประยุกต์ใช้ D-PhgAT อื่นพัฒนาขึ้นในช่วงโครงการนี้ พันธุกรรมการปรับเปลี่ยนของ D-PhgAT เพื่อยับยั้งการบรรเทาสารตั้งต้นการพัฒนาระบบที่มีประสิทธิภาพและตรรกะสำหรับการเพิ่มพื้นผิวและการกำจัดผลิตภัณฑ์เป็นหัวข้อการวิจัยที่สำคัญที่ควรจะทำในอนาคต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สังเคราะห์ enantiopure Pseudomonas หรือ d-4-hydroxyphenylglycine สองที่สำคัญโซ่ข้างในความต้องการสูงสำหรับอุตสาหกรรม lactam บีตา - ยาปฏิชีวนะ ใน เดียว ขั้นตอนการใช้เอนไซม์กรดอะมิโนเป็นๆของผู้บริจาค การพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพในด้านต่าง ๆ การพยายาม เพื่อให้เอนไซม์สังเคราะห์กระบวนการที่มีประสิทธิภาพ และการวางอนาคต การกลายพันธุ์ของยีนที่ dpga แทนที่เซรีน c-terminus กับซิสเตอีนสามารถนำไปใช้อย่างรวดเร็วและเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงของการตรึงเอนไซม์ ( s453c ) ที่ประกอบด้วยเมทริกซ์ขนาดในขณะที่รักษาเอนไซม์และเสริมสร้างความมั่นคงของ วัสดุที่ใช้ถูพื้นโดยใช้เอนไซม์ตรึง ( s453c ) ในแบบควบคุมการปลดปล่อยโดยระบบของสารละลาย ira400 ) - ดูดซับปริมาณเบนโซอิลฟอร์เมต จาก dphenylglycine สุดท้ายของ 10.25 g.l-1 . สองระบบสำหรับการแสดงออกของเอนไซม์สูงได้รับการพัฒนา ระบบแรกที่ใช้โฮสต์ที่มีคนติดตาม coexpressions Escherichia coli ซึ่งการปรับปรุงผลผลิตจากเอนไซม์ 0.44 1768 unit.l-1.od-1 . ในระบบที่สอง , codon เหมาะ dpga สังเคราะห์ยีนแสดงออกใน pichia pastoris กับแบคทีเรียผู้ดูแล Co การแสดงออกซึ่งให้ผลเอนไซม์ที่ 14717 unit.l-1.od-1 . ปัญหาของการละลายต่ำโดยเนื้อแท้ของของเอนไซม์ถูก alleviated โดย structureguided ซึ่งสามารถเพิ่มการละลายของเอนไซม์จาก 11.5 51 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ในการศึกษาปฏิกิริยาของตัวเร่งปฏิกิริยาและคุณสมบัติของเอนไซม์ วิธีใหม่สำหรับการวิเคราะห์ aminotransferase stereospecificity สำหรับซีโฟร์ " ไฮโดรเจนโอนบนโคได้รับการพัฒนา เป็นเอนไซม์ดีไฮโดรจีเนส lglutamate ) จักรยานโดยใช้เอนไซม์และการวิเคราะห์ปริมาณของเอนไซม์ในอาหารเป็นอีกแง่มุมของโปรแกรมประยุกต์ที่พัฒนาขึ้นในโครงการนี้ การดัดแปลงทางพันธุกรรมของเอนไซม์ตั้งต้นเพื่อบรรเทาและการพัฒนาที่มีประสิทธิภาพ และระบบตรรกะและฐานรองและการกำจัดผลิตภัณฑ์เป็นหัวข้อวิจัยที่สำคัญที่ต้องทำในอนาคต