HPLC-based screening of PhaCAc muta

HPLC-based screening of PhaCAc mutants Fig. 2B shows a schematic diagram
of the HPLC-based screening system developed in this study. Briefly, it is consisted of
site-specific random mutagenesis, preparation of a mutant library, primary assay of
P(3HB) accumulation in E. coli JM109 using Nile red (9-(diethylamino)-5H-benzo[α]
phenoxazin-5-one) dye on an agar plate, liquid cultivation in M9 medium plus
dodecanoate (C12) using a 96-well plate for P(3HB-co-3HHx) accumulation, alkaline
sample pretreatment, HPLC assay, and nucleotide sequence determination. A PhaCAc
D171X mutant library constructed with E. coli JM109 was spread on Luria–Bertani (LB)
agar plates (Bacto-Tryptone 10 g, Bacto-yeast extract 5 g, NaCl 10 g, and agar 15 g per
liter of distilled water) supplemented with 20 gL−1 glucose, 0.5 mg/L−1 Nile red, and
50 mgL−1 kanamycin and cultured at 37°C overnight. The polymerization ability of
PhaCAc mutants was judged based on the intensity of the pinkish pigmentation of the
cells caused by Nile red staining (16). Next, single pinkish pigmented colonies were
inoculated in M9 medium (0.6 mL) containing 1.0 gL−1 sodium dodecanoate, 1.0 gL−1
Bacto-yeast extract, 0.4 vol% Brij35, and 50 mgL−1 kanamycin in each 1.2-mL well of a
96-deep well culture plate (BM Equipment Co., Ltd., Tokyo). After sealing the plate with
an air-permeable film (4titude, Ltd., Surrey, UK), the cells were cultured at 37°C for 72 h
in a reciprocal shaker (1035 rpm, Bio Shaker, Taitec Co., Ltd., Saitama). After the grown
cells were replicated on LB agar plates, the cultured 96-well plates were centrifuged
using a Hitachi R6S swing rotor at 3000 rpm (1500 × g) for 10 min, and then the culture
supernatants were discarded. The 96-well plates with cell pellets remaining at the
bottom of each well were dried at 55°C for 3 days.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

HPLC การคัดกรองของสายพันธุ์ PhaCAc Fig. 2B แสดงไดอะแกรมแผนผังวงจรระบบคัดกรองโดยใช้ HPLC พัฒนาในการศึกษานี้ สั้น ๆ มันจะประกอบด้วยไซต์สุ่ม mutagenesis เตรียมของไลบรารีกลายพันธุ์ วิเคราะห์หลักของการสะสม P(3HB) ใน E. coli JM109 ที่ใช้แม่น้ำไนล์สีแดง (9- (diethylamino)-5 H-benzo [α]phenoxazin-5-1) ย้อมบนแผ่นการ agar เพาะปลูกของเหลวใน M9 กลางบวกdodecanoate (C12) ใช้จานดี 96 P(3HB-co-3HHx) สะสม อัลคาไลน์ตัวอย่าง pretreatment วิเคราะห์ HPLC และกำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์ PhaCAc การD171X สร้างกับ E. coli JM109 ไลบรารีกลายพันธุ์ได้แพร่กระจายไปบน Luria – Bertani (ปอนด์)แผ่น agar (Bacto Tryptone 10 g สารสกัด Bacto-ยีสต์ 5 กรัม NaCl 10 g และ agar 15 กรัมต่อลิตรของน้ำกลั่น) เสริม ด้วยกลูโคส 20 gL−1, 0.5 มิลลิกรัม/L−1 ไนล์สีแดง และ50 mgL−1 กานามัยซิน และอ่างที่ 37° C ค้างคืน ความสามารถในการ polymerization ของสายพันธุ์ PhaCAc ถูกตัดสินตามความเข้มของผิวคล้ำบัวโรยของเซลล์ที่เกิดจากแม่น้ำไนล์สีแดงย้อมสี (16) ถัดไป เดียวบัวโรยหมึกอาณานิคมได้inoculated ในกลาง M9 (0.6 มิลลิลิตร) ประกอบด้วย dodecanoate โซเดียม gL−1 1.0, 1.0 gL−1สารสกัดจากยีสต์ Bacto, 0.4 vol % Brij35 และกานามัยซิน mgL−1 50 ในแต่ละดี 1.2 mL ของการ96-ลึกทั้งวัฒนธรรมจาน (BM Equipment Co., Ltd. โตเกียว) หลังจากยาแนวรอยต่อแผ่นด้วยมีฟิล์มอากาศ permeable (4titude จำกัด เซอร์เรย์ อังกฤษ), เซลล์มีอ่างที่ 37° C สำหรับ 72 hในเชคเกอร์เป็นอัตราแลกเปลี่ยน (1035 rpm ไบเชคเกอร์ Taitec Co., Ltd. ไซตามะ) หลังจากการปลูกเซลล์ถูกจำลองแบบแล้วบนแผ่น agar ปอนด์ แผ่น 96 ดีอ่างถูก centrifugedใช้กับใบพัดสวิง R6S ฮิตาชิที่ 3000 รอบต่อนาที (1500 × g) ใน 10 นาที และวัฒนธรรมsupernatants ได้ถูกยกเลิก แผ่น 96 ดีกับเซลล์ขี้ที่เหลือในการด้านล่างของแต่ละบ่อได้แห้งที่ 55° C สำหรับ 3 วัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจคัดกรอง HPLC-based ของการกลายพันธุ์ PhaCAc รูป 2B แสดงแผนภาพ
ของระบบการตรวจคัดกรอง HPLC-based การพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้ สั้น ๆ ก็จะประกอบไปด้วย
เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงฉับสุ่มการจัดทำห้องสมุดกลายพันธุ์, การทดสอบหลักของ
P (3HB) สะสมในเชื้อ E. coli JM109 โดยใช้สีแดงแม่น้ำไนล์ (9- (diethylamino) -5H-Benzo [α]
phenoxazin-5 ได้หนึ่ง) สีย้อมบนจานเลี้ยงเชื้อ, การเพาะปลูกที่มีสภาพคล่องในระดับปานกลาง M9 บวก
dodecanoate (C12) โดยใช้แผ่น 96 ดีสำหรับ P (3HB-ร่วม 3HHx) สะสมด่าง
ปรับสภาพตัวอย่างทดสอบ HPLC และการกำหนดลำดับนิวคลีโอ PhaCAc
ห้องสมุดกลายพันธุ์ D171X สร้างด้วยเชื้อ E. coli JM109 ถูกแพร่กระจายบน Luria-Bertani (LB)
วุ้นแผ่น (Bacto-Tryptone 10 กรัม, สารสกัดจากยีสต์ Bacto 5 กรัม, 10 กรัมโซเดียมคลอไรด์และวุ้น 15 กรัมต่อ
ลิตรของน้ำกลั่น) เสริมด้วย 20 GL-1 กลูโคส 0.5 mg / L-1 ไนล์สีแดงและ
50 MGL-1 KANAMYCIN และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน ความสามารถพอลิเมอของ
การกลายพันธุ์ PhaCAc ถูกตัดสินขึ้นอยู่กับความเข้มของเม็ดสีสีชมพูของ
เซลล์ที่เกิดจากการย้อมสีไนล์สีแดง (16) ถัดไปอาณานิคมสีเดียวสีชมพูถูก
เชื้อในสื่อ M9 (0.6 มิลลิลิตร) มี 1.0 GL-1 โซเดียม dodecanoate 1.0 GL-1
สารสกัดจากยีสต์ Bacto 0.4% โดยปริมาตร Brij35 และ 50 MGL-1 KANAMYCIN ในแต่ละ 1.2 มิลลิลิตรดี
แผ่นวัฒนธรรมทั้ง 96 ลึก (BM อุปกรณ์ จำกัด , โตเกียว) หลังจากที่ปิดผนึกแผ่นกับ
ฟิล์มเครื่องดูดซึม (4titude จำกัด , Surrey, UK) เซลล์ที่ถูกเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง
ในการปั่นซึ่งกันและกัน (1,035 รอบต่อนาที, ไบโอปั่น Taitec จำกัด ไซตามะ) หลังจากที่การเจริญเติบโต
ของเซลล์ที่ถูกจำลองแบบใน LB แผ่นวุ้นเลี้ยงแผ่น 96 หลุมถูกปั่น
โดยใช้ใบพัดแกว่ง Hitachi R6S ที่ 3000 รอบต่อนาที (1500 ×กรัม) เป็นเวลา 10 นาทีและจากนั้นวัฒนธรรม
supernatants ถูกโยนทิ้ง แผ่น 96 ดีกับเซลล์เม็ดที่เหลืออยู่ที่
ด้านล่างของแต่ละดีแห้งที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 วัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จากการคัดเลือกสายพันธุ์และ phacac รูปที่ 2B แสดงแผนภาพ
ของ HPLC จากระบบคัดกรองพัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ สั้น ๆ , มันคือการสุ่มเฉพาะ
จัดทำห้องสมุดกลายพันธุ์ โดยหลักของ
p ( 3hb ) ที่สะสมใน E . coli ที่มีการใช้ปลานิลสีแดง ( 9 - ( diethylamino ) ได้แก่αเบนโซ [ ]
phenoxazin-5-one ) สีบนจานวุ้น ,ของเหลวในการขนาดกลางและ dodecanoate M9
( c12 ) ใช้ 96 ดีแผ่น P ( 3hb-co-3hhx ) การสะสมด่าง
ตัวอย่างก่อน , HPLC ) และการหาลำดับเบส . เป็น phacac
d171x กลายพันธุ์ห้องสมุดสร้างด้วยเชื้อ E . coli ที่มีถูกแพร่กระจายในลุเรีย–แบร์ตานิ ( LB )
วุ้นแผ่น ( Bacto ทริพโทน 10 กรัม , ยีสต์สกัด Bacto 5 กรัม เกลือ 10 กรัมและ 15 กรัมต่อ
วุ้นลิตรของน้ำ ) เสริมด้วย 20 GL − 1 กลูโคส 0.5 mg / L − 1 ปลานิลสีแดง , และ 50 มิลลิกรัมต่อลิตร − 1
kanamycin และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศา C ในชั่วข้ามคืน พอลิเมอไรเซชันใน
phacac กลายพันธุ์ถูกตัดสินบนพื้นฐานของความเข้มของเม็ดสีสีชมพูของ
เซลล์ที่เกิดจากไนล์ สีแดงย้อม ( 16 ) หน้าเดียวมีอาณานิคมอยู่ในแปลง M9
สีเชื้อปานกลาง ( 0.6 ml ) ประกอบด้วย 1 .0 GL − 1 โซเดียม dodecanoate 1.0 GL − 1
Bacto สกัดยีสต์ 0.4 % Vol brij35 และ 50 มิลลิกรัมต่อลิตร − 1 ปัจจัยในแต่ละ 1.2-ml ดีของ
96 จานลึกดี วัฒนธรรม ( BM Equipment Co . , Ltd . , โตเกียว ) หลังจากที่ปิดผนึกแผ่นกับ
ฟิล์มอากาศซึมผ่าน ( 4titude , Ltd , Surrey , UK ) , เซลล์เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศา C เป็นเวลา 72 ชั่วโมง
ในเครื่องปั่นซึ่งกันและกัน ( 1035 รอบต่อนาที , ไบโอ เขย่า taitec Co . , Ltd . , ไซตามะ ) หลังจากปลูก
เซลล์มีการจําลองแบบปอนด์วุ้นแผ่น ด้วยแผ่นมีไฟฟ้าเลี้ยง 96
โดยใช้ใบพัดแกว่ง ฮิตาชิ r6s ที่ 3000 รอบต่อนาที ( × 1 , 500 กรัม เป็นเวลา 10 นาที แล้ววัฒนธรรม
supernatants ถูกละทิ้ง . 96 ดีจานกับเซลล์เม็ดที่เหลือที่
ด้านล่างของแต่ละอย่างดีที่อุณหภูมิ 55 องศา C เป็นเวลา 3 วัน