PCR amplification of the hypervaria

PCR amplification of the hypervariable (V) 3 region of the eubacterial
16S rRNA was performed using the universal bacterial primers 357F
(5′-CCT AGG GGA GGC AGC AG-3′) containing a 40-bp GC clamp at
the 5′end, and 519R (5′-ATT ACC GCG GCK GCT GG-3′) (Muyzer et al.,
1993). PCR reactions were conducted in a 50 μl reaction mixture containing
200 μMof each dNTP, 1.75 mMMgCL2, 500 nM of each primer,
1× PCR buffer, 0.1% bovine serum albumin (BSA), and 1.25 U Platinum
Taq DNA polymerase (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway). After an
initial cycle of 4 min at 94 °C, 1.5 min at 64 °C, and 1.5 min at 72 °C, a
7-cycle touchdown was performed with stepwise decrease of the annealing
temperature (30 s at 94 °C, 30 s with an 1 °C/cycle decrement
from 64 °C and 1 min at 72 °C), followed by 27 cycles of regular PCR
(45 s at 94 °C, 45 s at 58 °C, 1 min at 72 °C) and a final extension step
of 10 min at 72 °C. To confirmsuccessful amplification of the V3 region,
aliquots of 8 μl of PCR products were analyzed by 1.5% (wt/vol)
agarose gel electrophoresis, stained with RedSafe™ Nucleic Acid
Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Inc., Kyunggi-do, Korea),
and imaged using a Gel Doc XR System (Bio-Rad laboratories, Hercules,
CA, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR ขยายของ hypervariable (V) 3 ภูมิภาคของ eubacterial16S rRNA ที่ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ที่แบคทีเรียสากล 357F(5′-CCT AGG GGA GGC AGC AG-3′) ประกอบด้วยคีมหนีบ GC 40 bp ที่5′end และ 519R (5′ ATT บัญชี GCG GCK GCT GG-3′) (Muyzer et al.,1993) . ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในการ 50 μl ปฏิกิริยาส่วนผสมที่ประกอบด้วย200 μMof dNTP, 1.75 mMMgCL2, 500 nM แต่ละพื้นบัฟเฟอร์การ PCR × 1, 0.1% วัว serum albumin (บีเอสเอ), และแพลททินั่ม U 1.25พอลิเมอเรส Taq DNA (Invitrogen Dynal AS ออสโล นอร์เวย์) หลังจากการเริ่มต้นรอบ 4 นาทีที่ 94 ° C, 1.5 นาทีที่ 64 ° C และ 1.5 นาทีที่ 72 ° C ความเหรียญ 7 รอบทำกับ stepwise ลดการการอบเหนียวอุณหภูมิ (30 s ที่ 94 ° C, 30 s กับการ 1 ° C/รอบ decrementจาก 64 ° C และ 1 นาทีที่ 72 ° C), ตาม ด้วย 27 รอบของ PCR ธรรมดา(45 s ที่ 94 ° C, 45 s ที่ 58 ° C, 1 นาทีที่ 72 ° C) และขั้นตอนสุดท้ายต่อ10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส การขยาย confirmsuccessful ภาค V3aliquots μl 8 ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวิเคราะห์ โดย 1.5% (wt/vol)agarose เจ electrophoresis สีกับกรดนิวคลีอิก RedSafe ™ย้อมสีโซลูชัน (iNtRON เทคโนโลยีชีวภาพ Inc., Kyunggi จูโด เกาหลี),และใช้ระบบ Doc XR เจล (Bio Rad ห้องปฏิบัติการ เฮอร์คิวลิส imagedCA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR ของ hypervariable นี้ (V) 3 พื้นที่ของ eubacterial
16S rRNA ได้รับการดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ของแบคทีเรียสากล 357F
(5'-CCT AGG GGA GGC AGC AG-3 ') ที่มียึด GC 40 bp ที่
5'end ที่ และ 519R (5'-ATT แม็ก GCG GCK GCT GG-3 ') (Muyzer et al.,
1993) ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการใน 50 ไมโครลิตรปฏิกิริยาส่วนผสมที่มี
200 μMofแต่ละ dNTP 1.75 mMMgCL2 500 นาโนเมตรของแต่ละไพรเมอร์
1 ×บัฟเฟอร์ PCR, 0.1% โปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มวัว (BSA) และ 1.25 U
แพลทินัมดีเอ็นเอโพลิเมอร์Taq (Invitrogen Dynal AS ออสโล, นอร์เวย์) หลังจากที่รอบแรกของ 4 นาทีที่ 94 ° C 1.5 นาทีที่ 64 องศาเซลเซียสและ 1.5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสซึ่งเป็นทัชดาวน์7 วงจรที่ได้ดำเนินการกับการลดขั้นตอนการอบอ่อนอุณหภูมิ (30 วินาทีที่ 94 ° C, 30 s กับ 1 ° C / รอบลดลงจาก64 องศาเซลเซียสและ 1 นาทีที่ 72 ° C) ตามด้วย 27 รอบของ PCR ปกติ(45 s ที่ 94 ° C, 45 s ที่ 58 ° C, 1 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ) และขั้นตอนการขยายสุดท้าย10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส เพื่อขยาย confirmsuccessful ของภูมิภาค V3, aliquots 8 ไมโครลิตรของผลิตภัณฑ์ PCR วิเคราะห์ 1.5% (น้ำหนัก / ปริมาตร) ข่าวคราว agarose, ย้อมด้วยสี RedSafe ™นิวคลีอิกกรดโซลูชั่นการย้อมสี(intron เทคโนโลยีชีวภาพ, Inc Kyunggi ทำเกาหลี) , และถ่ายภาพโดยใช้เจลหมอ XR ระบบ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว, CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเพิ่มปริมาณของเชื้อออก ( V ) 3 เขตของ 16S rRNA eubacterial
ถูกดำเนินการโดยใช้แบคทีเรียชนิดสากล 357f
( 5 ’ - CCT agg ก๊ะ ggc อาซาฮี ag-3 School ) ที่ประกอบด้วย 40 BP GC หนีบที่
5 นั้นจบ และ 519r ( 5 ’ - เจ้าหน้าที่บัญชี gcg gck GCT gg-3 School ) ( muyzer et al . ,
1993 ) ในปฏิกิริยา PCR จำนวน 50 μ L ปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย
200 μเข้าแต่ละ dntp mmmgcl2 , 1.75 ,500 nm ของแต่ละเช่น ,
1 × PCR buffer , 0.1% อัลบูมิน ( BSA ) และ 1.25 u แพลทินัม
แทค DNA polymerase ( Invitrogen dynal , ออสโล , นอร์เวย์ ) หลังจากการเริ่มต้นรอบ 4
นาทีที่ 94 ° C 1.5 นาทีที่ 64 ° C และ 1.5 นาทีที่ 72 ° C ,
7-cycle เทพนิรมิตคือการลดลงของอุณหภูมิการอบอ่อน =
( 30 s ที่ 94 ° C 30 S มี 1 ° C / วงจรลด
จาก 64 เมตร C และ 1 นาทีที่ 72 ° C )ตามด้วย 27 รอบของ PCR ธรรมดา
( 45 S ที่ 94 ° C 45 S ที่ 58 องศา C , 1 นาทีที่ 72 ° C ) และสุดท้ายขยายขั้นตอน
10 นาทีที่ 72 องศา เพื่อขยาย confirmsuccessful ของ V3 ภูมิภาค
เฉยๆ 8 μ l ผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้สำหรับ เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร )
เจลอิเล็กที่เปื้อน redsafe ™กรดนิวคลีอิก
staining โซลูชั่น ( iNtRON เทคโนโลยีชีวภาพ , อิงค์ , Kyunggi ทำ , เกาหลี ) ,
และ อื่นๆที่ใช้เจลหมอ 9000 ระบบชีวภาพราดห้องปฏิบัติการ , Hercules ,
CA , USA )