2.1. Transformation of Agrobacteriu

2.1. Transformation of Agrobacterium tumefaciens strains with
vector pCAMBIA2301 and maintenance
Transformation of three different strains of A. tumefaciens viz.
GV3101, LBA4404, (purchased from NCCB, Netherland),
and EHA105 [9–11] with binary plant expression vector pCAMBIA2301
was carried out using electroporation (Electroporation
conditions: Voltage 2.4 kV, Capacitance 25 mF,
Resistance 200 W; Electroporator- Biorad GenePulser Xcell).
These cultures were maintained in the presence of pCAMBIA2301
selection antibiotic, i.e., kanamycin (50 mg/L) (Himedia,
India) and strain specific selection antibiotics (50 mg/L)
mentioned in Table 1. The pCAMBIA2301 vector contains
GUS (coding sequence interrupted with intron sequence) as a
reporter gene and neomycin phosphotransferase II (nptII) as a
selective marker gene. Both genes are driven by the CaMV
35S promoter (Fig. 1A). All the three Agrobacterium strain cultures
were grown in luria broth (Himedia, India) medium and
agitated at 28 _C for 18 h at 200 rpm with required antibiotics
2.2. In vitro shoot regeneration
The authenticated B. monnieri growing in botanical garden of
the institute (B. V. Patel Pharmaceutical Education and
Research Development (PERD) Centre, Ahmedabad, Gujarat,
India.) was used as mother plant to obtain the leaf explants for
the in vitro shoot regeneration. Leaf explants were surface sterilized
aseptically by tween 80 (Teepol, Reckitt Benckiser, India)
treatment for 2 min followed by 0.1% mercury chloride (Merck,
India) treatment for 2 min. Explants were further washed with
sterile water to remove remaining sterilants present on the surface
of leaf explants. In vitro culture of B. monnieri was established
by a previously standardized protocol developed in our
laboratory using leaves as explants [12]. Explants were cultured
on Murashige and Skoog (MS) medium [13] supplemented with
2 lM of 6-benzyladenine (Merck, India), 3% w/v sucrose
(Fisher Scientific, India) and 0.2% (w/v) gelrite (Duchefa
Biochemie, The Netherland). These cultures were maintained
and incubated at temperature 25 ฑ 2 _C under suitable culture
conditions (16 h light/8 h dark) and routinely subcultured after
every 28 days. For A. tumefaciens mediated plant transformation,
shoots were excised and its leaves were directly used as
explants for the purpose.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1. การเปลี่ยนแปลงของอโกรแบคทีเรียม tumefaciens เงียpCAMBIA2301 เวกเตอร์และการบำรุงรักษาการเปลี่ยนแปลงของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันสามของ A. tumefaciens vizGV3101, LBA4404, (ซื้อจาก NCCB ประเทศเนเธอร์แลนด์),EHA105 [9-11] กับ pCAMBIA2301 เวกเตอร์นิพจน์พืชไบนารีและทำออกใช้ electroporation (Electroporationเงื่อนไข: แรงดัน 2.4 kV ค่าความจุ 25 mFความต้านทาน 200 W Electroporator - Biorad GenePulser Xcell)วัฒนธรรมเหล่านี้ถูกเก็บรักษาในต่อหน้าของ pCAMBIA2301การเลือกยาปฏิชีวนะ เช่น กานามัยซิน (50 mg/L) (Himediaอินเดีย) และสายพันธุ์การเลือกยาปฏิชีวนะ (50 mg/L)กล่าวถึงในตารางที่ 1 ประกอบด้วยเวกเตอร์ pCAMBIA2301GUS (รหัสลำดับที่ขัดจังหวะ ด้วย intron ลำดับ) เป็นการโปรแกรมรายงาน phosphotransferase ยีนและนีโอมัยซิน II (nptII) เป็นการยีนเครื่องหมายที่เลือก ยีนทั้งสองขับเคลื่อน ด้วยการ CaMVโปรโมเตอร์ 35S (Fig. 1A) ทั้งหมดสามอโกรแบคทีเรียมต้องใช้วัฒนธรรมได้เติบโตขึ้นใน luria ซุป (Himedia อินเดีย) และนั้นกระตุ้นทำที่ _C 28 สำหรับ h 18 ที่ 200 รอบต่อนาทีกับยาปฏิชีวนะที่จำเป็น2.2 การฟื้นฟูยิงเพาะเลี้ยงMonnieri เกิดได้เติบโตในสวนพฤกษศาสตร์สถาบัน (B. V. Patel ยาศึกษา และงานวิจัยศูนย์พัฒนา (PERD) อาร์เมดาบัด คุชรา ตอินเดีย) ใช้เป็นโรงงานแม่รับใบ explants สำหรับฟื้นฟูเครื่องมือยิง Explants ใบมีผิว sterilizedaseptically โดย tween 80 (Teepol, Reckitt Benckiser อินเดีย)รักษา 2 นาทีตาม ด้วยคลอไรด์ปรอท 0.1% (เมอร์ครักษาอินเดีย) 2 นาที Explants ถูกต่อไปล้างด้วยใส่น้ำเอา sterilants ที่เหลืออยู่บนพื้นผิวของ explants ใบ เพาะของ monnieri เกิดก่อโดยโพรโทคอลที่เป็นมาตรฐานก่อนหน้านี้พัฒนาในของเราห้องปฏิบัติการโดยใช้ใบเป็น explants [12] Explants มีอ่างMurashige และ Skoog (MS) [13] สื่อเสริมด้วย2 lM ของ 6-benzyladenine (เมอร์ค อินเดีย), ซูโครส 3% w/v(Fisher วิทยาศาสตร์ อินเดีย) และ 0.2% (w/v) gelrite (DuchefaBiochemie ในประเทศเนเธอร์แลนด์) วัฒนธรรมเหล่านี้ถูกรักษาไว้และ incubated ที่อุณหภูมิ 25 _C ฑ 2 ภายใต้วัฒนธรรมที่เหมาะสมเงื่อนไข (16 h ไฟ/8 h ดำ) และ subcultured เป็นประจำหลังจากทุก 28 วัน สำหรับ A. tumefaciens mediated แปลงโรงงานถ่ายภาพได้ excised และใบตรงที่เคยเป็นexplants สำหรับวัตถุประสงค์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 การเปลี่ยนแปลงของ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ที่มี
เวกเตอร์ pCAMBIA2301 และการบำรุงรักษา
การเปลี่ยนแปลงของสามสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของ A. tumefaciens ได้แก่ .
GV3101, LBA4404 (ซื้อจาก NCCB, เนเธอร์แลนด์),
และ EHA105 [9-11] ด้วยการแสดงออกพืชไบนารีเวกเตอร์ pCAMBIA2301
ถูกนำออกมาใช้ Electroporation (Electroporation
เงื่อนไข: แรงดันไฟฟ้า 2.4 กิโลโวลต์, การประจุกระแสไฟ 25 mF,
ความต้านทาน 200 W; Electroporator- Biorad GenePulser XCell).
วัฒนธรรมเหล่านี้ถูกเก็บรักษาไว้ในที่ที่มี pCAMBIA2301
ยาปฏิชีวนะตัวเลือกคือ KANAMYCIN (50 มิลลิกรัม / ลิตร) (HIMEDIA,
อินเดีย) และความเครียดยาปฏิชีวนะตัวเลือกเฉพาะ (50 มิลลิกรัม / ลิตร)
ที่กล่าวถึงในตารางที่ 1 เวกเตอร์ pCAMBIA2301 มี
GUS (ลำดับการเข้ารหัสขัดจังหวะกับลำดับ Intron) เป็น
ยีนนักข่าวและ phosphotransferase NEOMYCIN II (nptII) เป็น
ยีนเครื่องหมายเลือก ยีนทั้งสองได้รับแรงผลักดันจาก CaMV
35S ก่อการ (รูป. 1A) ทั้งสามวัฒนธรรมสายพันธุ์แบคทีเรีย
ที่ถูกปลูกในน้ำซุป Luria (HIMEDIA, อินเดีย) ขนาดกลางและ
ไม่สบายใจที่ 28 _C 18 ชั่วโมงที่ 200 รอบต่อนาทีด้วยยาปฏิชีวนะที่ต้องการ
2.2 ในการฟื้นฟูยิงหลอดทดลอง
รับรองความถูกต้อง B. monnieri การเจริญเติบโตในสวนพฤกษศาสตร์ของ
สถาบัน (BV Patel เภสัชกรรมการศึกษาและ
การพัฒนา (เปิด) ศูนย์ Ahmedabad,
อินเดีย.) ถูกใช้เป็นแม่พันธุ์ที่จะได้รับชิ้นส่วนใบสำหรับ
ในหลอดทดลอง ยิงฟื้นฟู ชิ้นใบถูกผิวฆ่าเชื้อ
ปลอดเชื้อโดยทวี 80 (Teepol, Reckitt Benckiser, อินเดีย)
การรักษาเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วยคลอไรด์ปรอท 0.1% (เมอร์,
อินเดีย) การรักษาเป็นเวลา 2 นาที ชิ้นถูกล้างต่อไปด้วย
น้ำหมันในการลบ Sterilants ที่เหลืออยู่บนพื้นผิว
ของชิ้นส่วนใบ ในวัฒนธรรมการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของบี monnieri ก่อตั้งขึ้น
โดยโปรโตคอลมาตรฐานก่อนหน้านี้ของเราพัฒนาขึ้นใน
ห้องปฏิบัติการโดยใช้ใบเป็นชิ้น [12] ชิ้นส่วนที่ถูกเลี้ยง
ในอาหารสูตร Murashige และ Skoog (MS) กลาง [13] เสริมด้วย
2 LM 6-benzyladenine (เมอร์, อินเดีย), 3% w / v ซูโครส
(Fisher Scientific, อินเดีย) และ 0.2% (w / v) gelrite ( Duchefa
Biochemie, เนเธอร์แลนด์) เหล่านี้ถูกเก็บรักษาวัฒนธรรม
และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ฑ 2 _C ภายใต้วัฒนธรรมที่เหมาะสม
เงื่อนไข (16 ชั่วโมงแสง / 8 ชั่วโมงเข้ม) และเชื้อเป็นประจำหลังจากที่
ทุก 28 วัน สำหรับ A. tumefaciens พึ่งการเปลี่ยนแปลงพืช
หน่อถูกตัดและใบของมันถูกนำมาใช้โดยตรงเป็น
ชิ้นส่วนเพื่อวัตถุประสงค์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . การเปลี่ยนแปลงของ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ด้วย

pcambia2301 เวกเตอร์และบำรุงรักษาแปลง 3 สายพันธุ์ที่แตกต่างกันของ A . tumefaciens viz .
gv3101 LBA4404 , ( ซื้อจาก nccb , เนเธอร์แลนด์ ) ,
9 – 11 ถ่ายยีนพบในสายพันธุ์ EHA105 [ และ ] กับไบนารีเวกเตอร์การแสดงออกของพืช pcambia2301
ถูกหามออกมาใช้ electroporation ( electroporation
เงื่อนไขแรงดัน 2.4 กิโลโวลต์ความจุ 25
MF ,ความต้านทาน 200 W ; electroporator - biorad genepulser xcell ) .
วัฒนธรรมเหล่านี้ถูกเก็บรักษาไว้ในการแสดงตนของ pcambia2301
เลือกยาปฏิชีวนะ เช่น กานามัยซิน ( 50 mg / l (
himedia ) , อินเดีย ) และสายพันธุ์ที่เลือกเฉพาะยาปฏิชีวนะ ( 50 mg / L )
ตารางในข้อ 1 . เวกเตอร์ที่ pcambia2301 ประกอบด้วย
กัส ( ลำดับขัดจังหวะกับลำดับ iNtRON นะครับ ) เป็น
ยีน นักข่าวและนีโอมัยซิน phosphotransferase II ( nptii ) เป็น
ยีนเครื่องหมายที่เลือก ทั้งยีนถูกขับเคลื่อน ด้วยการ 35s CAMV
( รูปที่ 1A ) ทั้งหมดสามอโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์วัฒนธรรม
ปลูกในน้ำซุป ( himedia ลุเรีย อินเดีย ) กลาง _c
ปั่นป่วนที่ 28 18 H ที่ 200 รอบต่อนาที ด้วยต้องใช้ยาปฏิชีวนะ
2.2 . ในหลอดทดลองโดยยิง
รับรองพ. monnieri เติบโตในสวนพฤกษศาสตร์ของ
สถาบัน ( B . V . เพื่อการศึกษาและวิจัยพัฒนายา
( เปิด ) ศูนย์ , Ahmedabad รัฐคุชราต
อินเดีย ) ถูกใช้เป็นโรงงานแม่ เพื่อขอรับใบ เลี้ยงสำหรับ
ในหลอดทดลองยิงตัวเอง ใบที่เติมสารฆ่าเชื้อที่ผิว
aseptically โดย Tween 80 ( ทีโพล RECKITT BENCKISER , อินเดีย , รักษา )
2 นาที ตามด้วย 0.1% ปรอทคลอไรด์ ( เมอร์ค
, อินเดีย ) การรักษาเป็นเวลา 2 นาทีเลี้ยงได้ซักด้วยน้ำปลอดเชื้อเพื่อลบ sterilants

เหลือปัจจุบันบนพื้นผิวของชิ้นส่วนพืชใบ ในเนื้อเยื่อของ monnieri ก่อตั้ง
โดยโปรโตคอลมาตรฐานก่อนหน้านี้ที่พัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของเรา
ใช้ใบเลี้ยง [ 12 ] อาหารเพาะเลี้ยง
บนอาหารสูตร Murashige และ Skoog ( MS ) กลาง [ 13 ] เสริม
2 LM ของ 6-benzyladenine ( Merck , อินเดีย )3 % W / V ซูโครส
( ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ อินเดีย ) และ 0.2% ( w / v ) gelrite ( duchefa
บิโอเคมี , เนเธอร์แลนด์ ) วัฒนธรรมเหล่านี้ยังคงบ่มที่อุณหภูมิ 25 ฑ
2 _c ภายใต้เงื่อนไขวัฒนธรรม
เหมาะ ( 16 / 8 H H แสงมืด ) และตรวจ subcultured หลังจาก
ทุกๆ 28 วัน A . tumefaciens สําหรับทําแปลงพืช
ยอดตัดและใบของมันถูกใช้โดยตรงโดย
อาหารเพื่อวัตถุประสงค์ .