3.1. Description of the Transfer-PC

3.1. Description of the Transfer-PCR (TPCR) process
3.2. Application of TPCR for DNA cloning
3.3. Application of TPCR for multiple-site targeted mutagenesis
3. Results
Fig.1. Schematic presentation of the Transfer-PCR (TPCR) process. (A) TPCR for DNA cloning. The target gene for cloning is marked in blue. The donor and the recipient
plasmids are marked in green and brown, respectively. Primers are indicated by arrows that contain a gene-specific sequences at the 30 end (solid blue line) and a vectorspecific
sequences corresponding to the integration sites on the recipient vector, at the 50 end (solid brown line). Dashed blue line indicates formation of an amplification
product. (B) TPCR for protein engineering. The target gene for mutagenesis is marked in blue. Blue arrows indicate mutagenic primers with the mutation sites shown by red
stars. For both (A) and (B), red X over the plasmid indicates elimination of the wild-type (donor or parental) plasmid by DpnI treatment.
Fig.2. Analysis of TPCR reactions for DNA cloning. (A). Agarose gel analysis
following the TPCR reaction. 8 ll samples were loaded onto a 1% Agarose gel. The
concentration of each primer used in the reaction in nM is shown above the gel.Mis
molecular weight markers in base-pairs. (B). Plates obtained following transformation
of 10 ll DpnI-treated TPCR reactions for generation of pET28-IFNa8 lower
panel) and pACYCDuet-TFIIEa (upper panel). Numbers above the plates indicate the
concentration of each of the primer used for the TPCR reaction. (C) Bar-graph
illustrating the dependence of the number of colonies (Y-axis) obtained after the
TPCR reaction on the primer concentration used (X-axis). Blue and red bars indicate
colony number obtained for pET28-IFNa8 and pACYCDuet-TFIIEa, respectively. The
counting results are averaged over two repeated TPCR reactions.
Fig.3. (A) Structure of Calmodulin (CaM) (blue) bound to CaMKII (red) (PDB code
1CM1). Blue spheres represent calcium ions. (B) A model of a Gb1-based novel
binder (blue) interacting with the effector binding region of Ras (red). Positions of
CaM and Gb1 residues targeted for mutagenesis are numbered and shown as green
sticks.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.1 การอธิบายของกระบวนการ PCR โอน (TPCR)3.2. แบบของ TPCR สำหรับการโคลนดีเอ็นเอ3.3. แบบของ TPCR หลายไซต์เป้าหมาย mutagenesis3. ผลลัพธ์ภาพการนำเสนอมันของการโอนย้าย-PCR (TPCR) (A) TPCR การโคลนดีเอ็นเอ ยีนเป้าหมายสำหรับโคลนถูกทำเครื่องหมายเป็นสีน้ำเงิน ผู้บริจาคและผู้รับplasmids มีเครื่องหมายสีเขียวและสีน้ำตาล ตามลำดับ ไพรเมอร์จะแสดง ด้วยลูกศรที่ประกอบด้วยลำดับยีนเฉพาะที่สิ้นสุด 30 (เส้นทึบสีน้ำเงิน) และ vectorspecificลำดับที่สอดคล้องกับไซต์การรวมเวกเตอร์ผู้รับ ท้าย 50 (เส้นทึบสีน้ำตาล) ก่อตัวของการขยายแสดงเส้นประสีน้ำเงินผลิตภัณฑ์ (ข) TPCR สำหรับวิศวกรรมโปรตีน ยีนเป้าหมายสำหรับ mutagenesis ถูกทำเครื่องหมายเป็นสีน้ำเงิน ลูกศรสีน้ำเงินระบุไพรเมอร์ mutagenic ไซต์การกลายพันธุ์ที่แสดง ด้วยสีแดงดาว สำหรับทั้งสอง (A) และ (B) แดง X ผ่าน plasmid บ่งชี้ชนิดป่าที่ตัดออก (ผู้บริจาค หรือผู้ปกครอง) plasmid DpnI บำบัดโดยการFig.2 ปฏิกิริยาการวิ TPCR การโคลนดีเอ็นเอ (A) การวิเคราะห์เจ Agaroseต่อปฏิกิริยา TPCR ตัวอย่าง 8 จะถูกโหลดลง 1% Agarose เจล ที่ความเข้มข้นของแต่ละพื้นที่ใช้ในปฏิกิริยาใน nM เป็นข้างเจMisเครื่องหมายโมเลกุลน้ำหนักเป็นฐานคู่ (ข) . แผ่นที่ได้รับต่อการเปลี่ยนแปลงของปฏิกิริยา TPCR DpnI ถือว่าจะ 10 สำหรับรุ่น pET28 IFNa8 ล่างแผง) และ pACYCDuet-TFIIEa (บนแผง) ระบุหมายเลขข้างบนแผ่นความเข้มข้นของแต่ละพื้นที่ใช้สำหรับปฏิกิริยา TPCR (ค) กราฟแท่งแสดงการพึ่งพาของอาณานิคม (แกน y) ได้รับหลังจากปฏิกิริยา TPCR ในความเข้มข้นของสีรองพื้นใช้ (แกน x) แสดงแถบสีน้ำเงิน และสีแดงจำนวนโคโลนีที่รับ pET28 IFNa8 และ pACYCDuet-TFIIEa ตามลำดับ ที่ผลการตรวจนับจะ averaged ผ่านปฏิกิริยา TPCR ซ้ำสองFig.3 (A) โครงสร้างของ Calmodulin (CaM) (สีน้ำเงิน) กับ CaMKII (แดง) (รหัส PDB1 ซ.ม. 1) ทรงกลมสีน้ำเงินแสดงประจุแคลเซียม (ข) แบบจำลองของนวนิยายโดย Gb1สารยึดเกาะ (สีน้ำเงิน) กับภูมิภาครวม effector ของรา (สีแดง) ตำแหน่งของCaM และ Gb1 ตกเป้าหมาย mutagenesis เป็นสีเขียวแสดงเป็น และลำดับไม้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.1 คำอธิบายของ Transfer-PCR (TPCR) กระบวนการ
3.2 การประยุกต์ใช้ TPCR ดีเอ็นเอโคลนนิ่ง
3.3 การประยุกต์ใช้ TPCR หลายสถานที่ที่กำหนดเป้าหมายฉับ
3 ผลการค้นหา
รูปที่ 1 การนำเสนอแผนผังของ Transfer-PCR (TPCR) กระบวนการ (A) TPCR สำหรับการโคลนดีเอ็นเอ ยีนเป้าหมายสำหรับการโคลนจะถูกทำเครื่องหมายในสีฟ้า ผู้บริจาคและผู้รับ
พลาสมิดมีการทำเครื่องหมายสีเขียวและสีน้ำตาลตามลำดับ ไพรเมอร์จะมีการแสดงโดยลูกศรที่มีลำดับยีนเฉพาะที่ 30 ปลาย (สายสีน้ำเงิน) และ vectorspecific
ลำดับสอดคล้องกับเว็บไซต์ที่บูรณาการในเวกเตอร์ผู้รับที่ปลาย 50 (สายสีน้ำตาลแข็ง) เส้นสีฟ้าประแสดงให้เห็นการก่อตัวของการขยาย
ผลิตภัณฑ์ (B) TPCR สำหรับวิศวกรรมโปรตีน ยีนเป้าหมายสำหรับการกลายพันธุ์มีการทำเครื่องหมายในสีฟ้า ลูกศรสีฟ้าระบุไพรรันกับเว็บไซต์การกลายพันธุ์ที่แสดงโดยสีแดง
ดาว ทั้ง (ก) และ (ข), X สีแดงกว่าพลาสมิดที่บ่งชี้การกำจัดชนิดป่า (ผู้บริจาคหรือผู้ปกครอง) พลาสมิดโดย DpnI การรักษา
รูปที่ 2 การวิเคราะห์ปฏิกิริยา TPCR สำหรับการโคลนดีเอ็นเอ (A) การวิเคราะห์เจล agarose
ต่อปฏิกิริยา TPCR 8 ตัวอย่าง LL ถูกโหลดไปยังเจล Agarose 1%
ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่ใช้ในการทำปฏิกิริยาใน nM แต่ละคนจะแสดงให้เห็นข้างต้น gel.Mis
เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลในฐานคู่ (B) แผ่นที่ได้รับต่อไปนี้การเปลี่ยนแปลง
จาก 10 LL DpnI รับการรักษาอาการ TPCR สำหรับคนรุ่นของ pET28-IFNa8 ต่ำ
แผง) และ pACYCDuet-TFIIEa (แผงบน) ตัวเลขด้านบนแผ่นระบุ
ความเข้มข้นของแต่ละประถมศึกษาที่ใช้ในการเกิดปฏิกิริยา TPCR (C) บาร์กราฟ
แสดงการพึ่งพาของจำนวนโคโลนี (แกน Y) ที่ได้รับหลังการ
เกิดปฏิกิริยากับความเข้มข้น TPCR ประถมศึกษาที่ใช้ (แกน X) สีฟ้าและแถบสีแดงแสดง
จำนวนโคโลนีที่ได้รับสำหรับ pET28-IFNa8 และ pACYCDuet-TFIIEa ตามลำดับ
ผลการนับจะเฉลี่ยกว่าสองซ้ำปฏิกิริยา TPCR
รูปที่ 3 () โครงสร้างของ Calmodulin (CAM) (สีฟ้า) ผูกพันกับ CaMKII (สีแดง) (PDB รหัส
1CM1) ทรงกลมสีฟ้าเป็นตัวแทนของแคลเซียมไอออน (B) รูปแบบของ gB1 ตามนวนิยาย
เครื่องผูก (สีฟ้า) มีปฏิสัมพันธ์กับ Effector ภูมิภาคผูกพันของแรส (สีแดง) ตำแหน่งของ
CaM และสารตกค้าง gB1 กำหนดเป้าหมายสำหรับการกลายพันธุ์จะมีหมายเลขและแสดงเป็นสีเขียว
ไม้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.1 . รายละเอียดการโอนเงิน ( tpcr กระบวนการ PCR )
2 . การประยุกต์ใช้ tpcr ดีเอ็นเอ การโคลน
3.3 . การประยุกต์ใช้ tpcr หลายไซต์เป้าหมายของ
3 ผลลัพธ์
” . การนำเสนอวงจรของการถ่ายโอนยีน ( tpcr ) กระบวนการ ( ) tpcr สำหรับการโคลนดีเอ็นเอ การโคลนยีนเป้าหมายสำหรับเป็นเครื่องหมายสีฟ้า ผู้บริจาคและผู้รับ
) จะปรากฏเป็นสีเขียว และสีน้ำตาล ตามลำดับไพรเมอร์จะแสดงด้วยลูกศรที่ประกอบด้วยยีนเฉพาะที่ลำดับที่ 30 ( เส้นทึบ ) และ vectorspecific
ลำดับสอดคล้องกับรวมเว็บไซต์เกี่ยวกับเวกเตอร์ผู้รับที่ 50 ( เส้นสีน้ำตาลทึบ ) เส้นประสีฟ้าแสดงรูปแบบของผลิตภัณฑ์การเพิ่ม

( ข ) tpcr วิศวกรรมโปรตีน ยีนเป้าหมายสำหรับการเป็นเครื่องหมายสีฟ้าลูกศรสีน้ำเงินแสดงวิธี PCR กับการกลายพันธุ์เว็บไซต์แสดงโดยดาวสีแดง

ทั้ง ( A ) และ ( B ) X สีแดงบนพลาสมิด บ่งชี้ว่า การผลิต ( โดยผู้ปกครอง ) พลาสมิดโดย dpni รักษา .
fig.2 . การวิเคราะห์ปฏิกิริยา tpcr สำหรับการโคลนดีเอ็นเอ ( A ) เจลการวิเคราะห์
ต่อไปนี้ tpcr ปฏิกิริยา 8 ตัวอย่างจะถูกโหลดลงบนเจล ( 1 )
ความเข้มข้นของแต่ละสีรองพื้นที่ใช้ในปฏิกิริยาใน nm แสดงข้างบนเจล . .
โมเลกุลเครื่องหมายในคู่เบส ( ข ) แผ่นได้ตามการเปลี่ยนแปลง
10 จะ dpni รักษาปฏิกิริยา tpcr สำหรับรุ่นของแผงล่าง
pet28-ifna8 ) และ pacycduet tfiiea ( แผงด้านบน ) ตัวเลขข้างบนแผ่นระบุ
ความเข้มข้นของแต่ละไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ tpcr ปฏิกิริยา( C )
บาร์กราฟแสดงการพึ่งพาของจำนวนโคโลนี ( แกน Y ) ที่ได้จาก
tpcr ปฏิกิริยาเมื่อใช้ไพรเมอร์ของ ( แกน X ) สีฟ้าและแถบสีแดงแสดง
อาณานิคมหมายเลขรับได้และ pet28-ifna8 pacycduet tfiiea ตามลำดับ
นับผลเฉลี่ยมากกว่าสองซ้ำ tpcr ปฏิกิริยา .
fig.3 .( ก ) โครงสร้างของคาลโมดูลิน ( CAM ) ( สีฟ้า ) ต้อง camkii ( สีแดง ) ( รหัส
PDB 1cm1 ) ทรงกลมสีฟ้าเป็นตัวแทนของไอออนแคลเซียม ( ข ) รูปแบบของ gb1 ยึดตามนวนิยาย
( สีฟ้า ) มีปฏิสัมพันธ์กับโต้งผูกพันเขตของราส ( สีแดง ) ตำแหน่งของ
แคม และ gb1 ตกค้างเป้าหมายสำหรับการจำกัดและแสดงเป็นแท่งเขียว