3. Results and discussionWe develop

3. Results and discussion
We developed a targeted multiplex next generation RNA sequencing assay for the tissue source determination of forensic samples using the Illumina MiSeq platform. Custom targeted oligonucleotide pools were designed to amplify thirty to fifty-five gene targets in a single reaction. Overall, sixty-six body fluid- and tissue-specific gene targets were evaluated in a number of iterative combinations, including three housekeeping genes.

The specificity of each biomarker within each of the iterative multiplex systems was evaluated using four to seven donors of each target body fluid or tissue. The ‘target hit’ or count values for each biomarker was obtained. A biomarker was determined to be suitable candidate when it demonstrated moderate to high count values in the body fluid or tissue of interest with little to no counts in non-target body fluids. An example of the expression data obtained for a single source blood sample is shown in Fig. 1. As can be seen, high count values are observed for each of the eight included blood biomarkers with little to no expression of the other thirty non-blood biomarkers in the multiplex. Therefore, using this multiplex assay a blood sample could easily be distinguished due to the high specificity of the included blood-specific biomarkers. Modifications were made to each subsequent multiplex system in order to remove biomarkers with poor specificity or sensitivity (i.e. abundance). Additionally, biomarkers with extremely high expression levels, such as HBB and HBA, were also removed due to the reduction in overall efficiency of the multiplex. After initial specificity testing, a prototype 34plex system was developed. A high degree of specificity was obtained for each body fluid. For example, the percentage of reads attributable to saliva biomarkers in saliva samples ranges from 83 to 98%, for blood 96–100%, semen 98–100%, vaginal secretions 87–100% and skin 93–96%. The percentage of reads from menstrual blood, as expected, included contributions from menstrual blood biomarkers (29–96%), vaginal secretions and blood. Using the developed multiplex assay, both components in two-fluid admixed samples (blood-saliva and vaginal secretions-semen) were correctly identified.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผล และการอภิปรายเราพัฒนามีเป้าหมายมัลติเพล็กซ์ถัดไปสร้าง RNA ลำดับวิเคราะห์สำหรับการกำหนดแหล่งที่มาของเนื้อเยื่ออย่างนิติที่ใช้แพลตฟอร์ม Illumina MiSeq กำหนดเองเป้าหมาย oligonucleotide สระถูกออกแบบมาเพื่อขยายสามสิบถึงห้าสิบห้ายีนเป้าหมายในปฏิกิริยาเดียว โดยรวม หกหกเหลวในร่างกายเนื้อเยื่อเฉพาะ และยีนเป้าหมายถูกประเมินในจำนวนชุดซ้ำ รวมถึงยีนแม่บ้านสามThe specificity of each biomarker within each of the iterative multiplex systems was evaluated using four to seven donors of each target body fluid or tissue. The ‘target hit’ or count values for each biomarker was obtained. A biomarker was determined to be suitable candidate when it demonstrated moderate to high count values in the body fluid or tissue of interest with little to no counts in non-target body fluids. An example of the expression data obtained for a single source blood sample is shown in Fig. 1. As can be seen, high count values are observed for each of the eight included blood biomarkers with little to no expression of the other thirty non-blood biomarkers in the multiplex. Therefore, using this multiplex assay a blood sample could easily be distinguished due to the high specificity of the included blood-specific biomarkers. Modifications were made to each subsequent multiplex system in order to remove biomarkers with poor specificity or sensitivity (i.e. abundance). Additionally, biomarkers with extremely high expression levels, such as HBB and HBA, were also removed due to the reduction in overall efficiency of the multiplex. After initial specificity testing, a prototype 34plex system was developed. A high degree of specificity was obtained for each body fluid. For example, the percentage of reads attributable to saliva biomarkers in saliva samples ranges from 83 to 98%, for blood 96–100%, semen 98–100%, vaginal secretions 87–100% and skin 93–96%. The percentage of reads from menstrual blood, as expected, included contributions from menstrual blood biomarkers (29–96%), vaginal secretions and blood. Using the developed multiplex assay, both components in two-fluid admixed samples (blood-saliva and vaginal secretions-semen) were correctly identified.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลและการอภิปรายเราพัฒนาเป้าหมายต่อไปซึ่งในการมัลติเพล็กซ์สำหรับเนื้อเยื่อแหล่งการกำหนดตัวอย่างทางนิติวิทยาศาสตร์ใช้แพลตฟอร์ม Illumina miseq . เป้าหมายที่กำหนดเอง ซึ่งสระว่ายน้ำถูกออกแบบมาเพื่อขยายสามสิบ 55 ยีนเป้าหมายในปฏิกิริยาเดี่ยว โดยของเหลวในร่างกายและเป้าหมายที่ 66 - ยีน tissue-specific ประเมินในจํานวนชุดซ้ำ รวมทั้งสาม housekeeping ยีนความจำเพาะของแต่ละไบโอมาร์คเกอร์ในแต่ละแห่งของมัลติเพล็กซ์ระบบประเมินการใช้สี่ถึงเจ็ดผู้บริจาคแต่ละเป้าหมายของเหลวในร่างกายหรือเนื้อเยื่อ ' เป้าหมาย ' หรือค่าการนับแต่ละไบโอมาร์คเกอร์ได้ . เป็นไบโอมาร์คเกอร์คือมุ่งมั่นที่จะเป็นผู้สมัครที่เหมาะสมเมื่อมันแสดงให้เห็นถึงปานกลางนับค่าสูงในของเหลวในร่างกาย หรือเนื้อเยื่อ ที่น่าสนใจไม่น้อยกับนับไม่ใช่เป้าหมายของเหลวในร่างกาย . ตัวอย่างของการแสดงออกของข้อมูลตัวอย่างเลือดแหล่งเดียวที่แสดงในรูปที่ 1 ทั้งนี้ การนับค่าสูงเป็นสังเกตสำหรับแต่ละแปดรวมเลือดใหม่ที่มีน้อยไปไม่มีการแสดงออกของอีกสามสิบไม่เลือดใหม่ใน multiplex ดังนั้นการใช้วิธีมัลติเพล็กซ์นี้ตัวอย่างเลือดอาจจะแตกต่างจากความจำเพาะสูงซึ่งรวมเฉพาะในเลือด การทำมัลติเพล็กซ์ระบบแต่ละที่ตามมาเพื่อเอาใหม่กับความจำไม่ดีหรือความไว ( เช่นความอุดมสมบูรณ์ ) นอกจากนี้ ทางชีวภาพกับระดับการแสดงออกสูงมาก เช่น และ โซ hbb , ถูกลบออกเนื่องจากการลดลงในประสิทธิภาพโดยรวมของ multiplex หลังจากการทดสอบความจำเพาะเริ่มต้นระบบ 34plex เครื่องต้นแบบได้ ระดับสูงของความจำเพาะได้ในแต่ละตัวของของไหล ตัวอย่าง ร้อยละของอ่านข้อมูลในน้ำลายน้ำลายซึ่งช่วงจาก 83 98 เปอร์เซ็นต์ เลือด 96 – 100% , น้ำอสุจิ 98 – 100% , ช่องคลอดหลั่ง 87 – 100% และผิว 93 – 96 % จำนวนคนอ่านจากเลือดประจำเดือนอย่างที่คาดไว้ รวมถึงผลงานจาก menstrual เลือดใหม่ ( 29 ( 96% ) , การหลั่งในช่องคลอดและเลือด ใช้พัฒนา multiplex การทดสอบทั้งส่วนประกอบสองของเหลวตัวอย่าง ( น้ำลายผสมเลือดและช่องคลอดหลั่งน้ำอสุจิ ) ถูกระบุอย่างถูกต้อง