Materials and methodsChemicalsFruct

Materials and methods
Chemicals
Fructose was purchased from Alfa Aesar Co. Type
II collagenase was purchased from Worthington
(Lakewood, NJ). Bovine serum albumin (pH 7, ≥ 98%,
Sigma product number A7906) and all other
chemicals were purchased from Sigma-Aldrich Co.
(Oakville, ON).
Animal treatment and hepatocyte preparation
Male Sprague-Dawley rats weighing 275–300 g
(Charles River Laboratories) were housed in ventilated
plastic cages over PWI 8-16 hardwood bedding.
There were 12 air changes per hour, 12 h light photoperiod
(lights on at 0800 h) and an environmental
temperature of 21 to 23°C with a 50–60% relative
humidity. The animals were fed with a normal standard
chow diet and water ad libitum. Hepatocytes
were isolated from rats by collagenase perfusion
of the liver as described by Moldeus and co-workers
(Moldeus et al., 1978). Isolated hepatocytes
(106 cells/ml, 10 ml) were suspended in Krebs-
Henseleit buffer (pH 7.4) containing 12.5 mM HEPES
in 50 ml round-bottomed flasks continually rotating
in a 37°C water bath, under an atmosphere of 95% O2
and 5% CO2. Hepatocytes were allowed to acclimatize
for 30 min before the addition of chemicals.
Cell viability assay
Hepatocyte viability was assessed microscopically
by plasma membrane disruption by the trypan blue
(0.1%, w/v) exclusion test (Moldeus et al., 1978).
Hepatocyte viability was determined every 30 min
during a 3 h incubation period. The cells were at least
80–90% viable before use. Catalase inhibited hepatocytes
were prepared by adding 4 mM sodium azide
to the hepatocytes before adding fructose or glycolaldehyde.
FeII:HQ was used to load hepatocytes
with 2 M iron by incubating hepatocytes with 2 M
ferrous sulphate (FeII) mixed with 4 M 8-hydroxyquinoline
(HQ).
H2O2 measurement
H2O2 was measured in hepatocytes at 30, 60, 90 min.
50 l of the hepatocytes suspension (0.05 × 106 cells)
was added to 950 l of FOX 1 reagent (ferrous oxidation
of xylenol orange) and incubated at room temperature
in dark for 30 min. The FOX 1 reagent consisted
of 25 mM sulfuric acid, 250 M ferrous ammonium
sulphate, 100 M xylenol orange and 0.1 M sorbitol.
Following incubation, samples were analysed
spectrophotometrically at 560 nm. The extinction
coefficient 2.35 × 105 M− 1 cm−1 was used to quantify
the molar concentration of H2O2 through Beer’s law
(Ou & Wolff, 1996).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ

ฟรักโทสสารเคมีที่ซื้อมาจากอัลฟ่า aesar ร่วม ประเภทคอลลา
ii ซื้อมาจากวอร์ชิงตัน
(เลกวูด, NJ) วัวซีรั่มอัลบูมิ (pH 7, ≥ 98%,
หมายเลขผลิตภัณฑ์ซิก a7906) และสารเคมีอื่น ๆ
กำลังซื้อจาก บริษัท Sigma-Aldrich ร่วม.
(กวิลล์บน). การรักษาสัตว์และการจัดเตรียม

ตับหนู Sprague-Dawley เพศชายชั่งน้ำหนัก 275-300 กรัม
(ชาร์ลส์ห้องปฏิบัติการแม่น้ำ) มีการระบายอากาศที่ตั้งอยู่ในกรงพลาสติก
กว่า PWI เตียงไม้เนื้อแข็ง 8-16.
มี 12 เปลี่ยนแปลงอากาศต่อชั่วโมง, 12 ชั่วโมงต่อช่วงแสงไฟ
(ไฟบนที่ 0800 ชั่วโมง) และอุณหภูมิ
สิ่งแวดล้อมของ 21-23 องศาเซลเซียสกับญาติ 50-60% ความชื้น
สัตว์ที่ได้รับการเลี้ยงดูด้วยมาตรฐานปกติ
Chow อาหารและน้ำ Libitum โฆษณา เซลล์ตับ
ถูกแยกจากหนูโดย
ปะคอลลาของตับตามที่อธิบาย moldeus และเพื่อนร่วมงาน
(moldeus et al. 1978) เซลล์ตับโดดเดี่ยว
(106 เซลล์ / มล. 10 มล. ) ถูกแขวนใน Krebs-
หด buffer (pH 7.4) ที่มี 12.5 HEPES มม.
50 ขวดกลมท้องแบน มล. อย่างต่อเนื่องในการหมุน
37 °อาบน้ำ C, ภายใต้บรรยากาศ 95% o2
CO2 5% และเซลล์ตับได้รับอนุญาตให้ปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมใหม่
เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่นอกเหนือจากสารเคมี.
ทดสอบความมีชีวิตของเซลล์
มีชีวิตเซลล์ตับมีการประเมินกล้องจุลทรรศน์
จากการหยุดชะงักของเยื่อหุ้มพลาสม่าโดย trypan สีฟ้า
(0.1% w / v) ยกเว้นการทดสอบ (moldeus et al, , 1978).
มีชีวิตเซลล์ตับถูกกำหนด
ทุก 30 นาทีในช่วงระยะเวลาการบ่ม 3 ชั่วโมง เซลล์อย่างน้อย
80-90% ที่ทำงานได้ก่อนการใช้งานเซลล์ตับ catalase ยับยั้ง
ถูกจัดเตรียมโดยการเพิ่ม มม. โซเดียม 4
azide ต่อเซลล์ตับก่อนที่จะเพิ่มฟรักโทสหรือ glycolaldehyde
feii:. HQ ถูกนำมาใช้ในการโหลดเซลล์ตับ
2 เหล็กเมตรโดยฟักเซลล์ตับที่มี 2 ซัลเฟตเมตรเหล็ก
(feii) ผสมกับ 4  ม. 8-hydroxyquinoline
(HQ).

H2O2 วัด H2O2 ถูกวัดในเซลล์ตับวันที่ 30, 60, 90 นาที.
50 l จากการระงับเซลล์ตับ (0.05 × 106 เซลล์)
ถูกเพิ่มเข้ามาถึง 950 ลิตรของสุนัขจิ้งจอก 1 รีเอเจนต์ (
ออกซิเดชันของธาตุเหล็ก xylenol สีส้ม) และบ่มที่อุณหภูมิ
อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที สุนัขจิ้งจอก 1 สารประกอบด้วย
จาก 25 กรดกำมะถัน มม. , 250 แอมโมเนียมซัลเฟตเหล็ก m
 100 เมตร xylenol สีส้มและ 0.1 เมตรซอร์บิทอ.
บ่มต่อไปนี้ตัวอย่างการวิเคราะห์
spectrophotometrically ที่ 560 นาโนเมตรการสูญเสียค่าสัมประสิทธิ์
2.35 × 105 m-1-1 ซม. ถูกใช้ในการวัดปริมาณความเข้มข้น
โมลของ H2O2 ผ่านกฎหมายเบียร์
(OU & Wolff, 1996)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธี
เคมี
ฟรักโทสถูกซื้อจากชนิดอัลฟา Aesar Co.
II collagenase ที่ซื้อจากธธิง
(Lakewood, NJ) วัว serum albumin (ค่า pH 7 ≥ 98%,
ซิกผลิตภัณฑ์หมายเลข A7906) และอื่น ๆ ทั้งหมด
ซื้อสารเคมีจาก บริษัทซิก Aldrich
(Oakville, ON).
เตรียม hepatocyte และรักษาสัตว์
Sprague Dawley ที่ชาย rats น้ำหนัก g 275–300
(แม่น้ำชาร์ลส์ Laboratories) ได้แห่ง ventilated
พลาสติกกรง PWI เหนือเตียงไม้ 8-16.
มีอากาศเปลี่ยนแปลงที่ 12 ต่อชั่วโมง ชั่วโมงแสง 12 h
(ไฟบนที่ 0800 h) และสภาพแวดล้อม
อุณหภูมิ 21-23° C กับญาติ 50–60%
ความชื้น สัตว์ถูกเลี้ยง ด้วยมาตรฐานปกติ
ควรรับประทานอาหารและน้ำที่ ad libitum Hepatocytes
ที่แยกจากหนู โดยการกำซาบ collagenase
ของตับตามที่อธิบายไว้ โดย Moldeus และบริษัทคน
(Moldeus et al., 1978) แยกต่างหาก hepatocytes
(106 เซลล์/ml, 10 ml) ถูกหยุดชั่วคราวในเครบส์-
Henseleit บัฟเฟอร์ (pH 7.4) ประกอบด้วย 12.5 มม. HEPES
ใน 50 ml ยนที่กลมน้ำอย่างต่อเนื่องหมุน
ใน 37° C น้ำน้ำ ภายใต้บรรยากาศของ 95% O2
5% CO2 Hepatocytes ได้รับอนุญาตให้ acclimatize
สำหรับ 30 นาทีก่อนการเพิ่มของสารเคมี
วิเคราะห์เซลล์ชีวิต
Hepatocyte ชีวิตถูกประเมิน microscopically
โดยทรัพยพลาสมาเมมเบรนโดยบลู trypan
(0.1%, w/v) ทดสอบแยก (Moldeus et al., 1978) .
Hepatocyte ชีวิตกำหนดทุก 30 นาที
ช่วงฟักตัว 3 h เซลล์ได้น้อย
80–90% ได้ก่อนใช้งาน Catalase ห้าม hepatocytes
ถูกเตรียม โดยการเพิ่ม 4 mM โซเดียม azide
ให้ hepatocytes ก่อนฟรักโทสหรือ glycolaldehyde
FeII:HQ ถูกใช้เพื่อโหลด hepatocytes
กับ 2 M เหล็กโดย incubating hepatocytes กับ 2 M
ซัลเฟต (FeII) ผสมกับ M 4 8-hydroxyquinoline
(HQ) .
H2O2 วัด
H2O2 ถูกวัดใน hepatocytes ที่ 30, 60, 90 นาที
l 50 การระงับ hepatocytes (0.05 × 106 เซลล์)
ถูกเพิ่ม l 950 ของรีเอเจนต์ FOX 1 (ออกซิเดชันเหล็ก
xylenol ส้ม) และ incubated ที่อุณหภูมิห้อง
ในมืดใน 30 นาที ประกอบด้วยรีเอเจนต์ FOX 1
ของกรดซัลฟิวริก 25 มม. แอมโมเนียเหล็ก M 250
ซัลเฟต 100 M xylenol ส้ม และซอร์บิทอล 0.1 M.
ถูก analysed ตัวอย่างต่อไปนี้คณะทันตแพทยศาสตร์
spectrophotometrically ที่ 560 nm การดับ
สัมประสิทธิ์ 2.35 แสน × 105 M− 1 cm−1 ถูกใช้เพื่อกำหนดปริมาณ
สมาธิสบของ H2O2 ผ่านกฎหมายของเบียร์
(Ou & Wolff, 1996)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ

น้ำตาลฟรัค - โทซสารเคมีมีการซื้อจาก Alfa Production aesar . co . th collagenase พิมพ์
II ได้ถูกซื้อจาก Worthington
( Lakewood Amphitheater , NJ ) วัวอีกเจลมาสก์มอยเจอร์ไรเซอร์ไข่ขาว( PH 7 ,กำหนด≥ 98% ,
Six Sigma หมายเลข ผลิตภัณฑ์ ที่ 7906 )และอื่นๆทั้งหมด
สารเคมีได้ซื้อจาก sigma-aldrich . co . th
( Oakville ,บน)..
สัตว์การบำบัดและ hepatocyte
ซึ่งจะช่วยในการเตรียมตัวหนู sprague-dawley น้ำหนัก 275 - 300 กรัม
( Charles River Laboratories )ได้ตั้งอยู่ในอากาศถ่ายเท
พลาสติกกรงเหนือ pwi 8-16 8-16 8-16 ไม้เนื้อแข็งชุดเครื่องนอน.
มี 12 ทางอากาศการเปลี่ยนแปลงต่อชั่วโมง, 12 ชั่วโมงไฟ photoperiod
(ไฟที่ 0800 h )และสิ่งแวดล้อม
อุณหภูมิ ของ 21 ถึง 23 ° C พร้อมด้วย 50 - 60% ความชื้นสัมพัทธ์
ซึ่งจะช่วย. สัตว์ที่เป็นอาหารกินกับน้ำตาม อำเภอ ใจและอาหาร
ข้าวมาตรฐานปกติ hepatocytes
ตามมาตรฐานก็แยกออกจากพวกหนูโดยอาจทำให้เกิดความดันโลหิตแบบ collagenase
ของตับเช่นที่อธิบายไว้โดย moldeus และเพื่อนร่วมงาน
( moldeus et al . 1978 ) แยก hepatocytes
( 106 เซลล์/มิลลิลิตร, 10 มล.)ได้ถูกระงับชั่วคราวใน krebs -
henseleit Buffer ( PH 7.4 )ประกอบด้วย 12.5 มม. hepes
ใน 50 มล.แบบท้องกระจกแบบหมุนได้รอบใบลูกปืนหลายอย่างต่อเนื่อง
ในที่ 37 ° C น้ำอ่างอาบน้ำ,ตามบรรยากาศที่มี 95% O 2
และ 5% ก๊าซ CO 2 ระบบไฮโดรเพาเวอร์ไฮโดรเพาเวอร์.hepatocytes รับอนุญาตให้ทำให้เคยชินกับอากาศ
ซึ่งจะช่วยให้ได้ 30 นาทีก่อนที่การเพิ่มสารเคมี.

ซึ่งจะช่วยสอบอย่างรอบคอบเซลล์ hepatocyte อย่างรอบคอบมีการประเมินผลการปฏิบัติอย่างพินิจพิจารณา
โดย membrane )การหยุดชะงักพลาสมาโดย trypan สีฟ้า
( 0.1% , w / v )การแยกการทดสอบ( moldeus et al ., 1978 )..
hepatocyte อย่างรอบคอบจึงตัดสินใจทุกๆ 30 นาที
ในระหว่างที่ 3 ชั่วโมงอบช่วงเวลา. เซลล์ที่อยู่ที่อย่างน้อย
80-90 80-90 80-90% แก้ปัญหาก่อนการใช้งานcatalase hepatocytes
ซึ่งจะช่วยระงับได้เตรียมความพร้อมโดยการเพิ่ม 4 มม.( azide
ซึ่งจะช่วยให้ hepatocytes ก่อนการเพิ่มน้ำตาลฟรัค - โทซหรือ glycolaldehyde .
feii :รุ่น HQ ถูกใช้เพื่อโหลด hepatocytes
พร้อมด้วย 2 m เตารีดโดยศูนย์บ่มเพาะ hepatocytes พร้อมด้วย 2 m
ซึ่งมีธาตุเหล็กจุนสี( feii )ผสมกับ 4 m 8 - hydroxyquinoline
(รุ่น HQ )..
H 2 O 2 วัด
H 2 O 2 วัดได้ใน hepatocytes ที่ 30 , 60 , 90 นาที
50 l ของ hepatocytes แขวน( 0.05 × 106 เซลล์)
ถูกเพิ่มใน 950 l ของสุนัขจิ้งจอก 1 ตัวกระทำ(ซึ่งมีธาตุเหล็กออกซิไดส์
ของ xylenol สีส้ม)และ incubated ที่ อุณหภูมิ ห้อง
ในสีเข้มสำหรับ 30 นาทีสุนัขจิ้งจอก 1 ตัวกระทำประกอบด้วย
ของกรดซัลฟูริก 25 มม., 250 m ซึ่งมีธาตุเหล็ก its ammonium
จุนสี, 100 m xylenol สีส้มและ sorbitol 0.1 ม..
ต่อไปนี้แสดงระยะฟักตัว,ตัวอย่างก็วิเคราะห์
spectrophotometrically ที่ 560 นิวตันเมตรการสูญพันธุ์
ตัวเลขสูงสุด 2.35 × 105 ม. - 1 ซม. 1 ที่ผ่านมา volatility )ความเข้มข้นกรามที่ใช้เคี้ยว
ของ H 2 O 2 ผ่านกฎหมายของเบียร์
( OU &เป็น 1996 )