2.2. DNA isolation and PCRDNA was i

2.2. DNA isolation and PCR
DNA was isolated from the compost samples using the
FastDNA Spin Kit for Soil (Qbiogene). Isolation was performed
on 0.4 g compost by following the manufactures
instructions. DNA was isolated from replica I, II and III
from each of the four composts. Microbial diversity of
the samples was determined by use of PCR-DGGE. Bacterial
DNA was amplified using the universal bacterial primers
341f + GC and 518r (Muyzer et al., 1993), which
amplifies a 233 bp fragment of 16S rDNA, including a
40 bp GC-clamp. PCR was performed using 2.5 ll 10· Ex
Taq buffer (20 mM Mg2+, TaKaRa, Japan), 2 ll 2.5 mM
dNTP mixture, 0.25 ll 5 units/ll Ex Taq polymerase
(TaKaRa), 0.175 ll of each primer (100 pmol/ll) (MWGBiotech
AG, Ebersberg, Germany), 1 ll diluted template
and H2O to a total of 25 ll. PCR was performed with a
T3Thermocycler (Biometra) using the following cycle conditions:
an initial denaturation at 94 C for 3 min, followed
by 30 cycles of denaturation at 94 C for 30 s, annealing at
55 C for 30 s and elongation at 72 C for 30 s, and then a
final elongation step at 72 C for 6 min. Fungal DNA was
amplified using a semi-nested approach (Oros-Sichler
et al., 2006), where primers NS1 (White et al., 1990) and
EF3 (Smit et al., 1999) amplifies part of 18S rDNA in a first
PCR, and this product is then used as template in a second
PCR applying primers NS1 and FR1-GC (Vainio and Hantula,
2000). The end product is an approximately 1650 bp
fragment with an added GC-clamp suitable for DGGE.
PCR constituents were as described for bacterial PCR
except the use of the different primers. Cycle conditions in
the first fungal PCR were as follows: an initial denaturation
step at 94 C for 8 min, followed by 25 cycles of denaturation
at 94 C for 30 s, annealing at 47 C for 45 s and elongation
at 72 C for 3 min and a final elongation step at
72 C for 10 min. The cycle conditions of the second fungal
PCR was like the first fungal PCR, with the exception that
it consisted of only 20 cycles and that the annealing temperature
was 48 C. The products from the bacterial and fungal
PCR reactions were verified by agarose gel electrophoresis.
The amount of DNA in each sample was estimated by
image analysis using GeneTools (SynGene) on digital
images of the agarose gels obtained with GeneSnap (SynGene).
This was done to ensure that equal amounts of
DNA from the samples were loaded onto the DGGE gel.
2.3. DGG

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ดีเอ็นเอแยกและ PCRดีเอ็นเอที่ถูกแยกจากตัวอย่างปุ๋ยหมักโดยใช้การชุดสปิน FastDNA ดิน (Qbiogene) ดำเนินการแยกต่างหากในปุ๋ยหมัก 0.4 กรัมผลิตโดยคำแนะนำ ดีเอ็นเอที่ถูกแยกจากจำลอง I, II และ IIIจาก composts 4 จุลินทรีย์ที่หลากหลายมีกำหนดตัวอย่าง โดยใช้ PCR-DGGE เชื้อแบคทีเรียดีเอ็นเอถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ที่แบคทีเรียสากล341f + GC และ 518r (Muyzer et al. 1993), ซึ่งเพิ่มส่วน bp 233 ของ 16S rDNA รวมทั้งการ40 บีแคลมป์ GC ทำ PCR ใช้ 2.5 ll 10· เช่นTaq บัฟเฟอร์ (20 mM Mg2 + TaKaRa ญี่ปุ่น), 2 ll ขนาด 2.5 มม.ส่วนผสม dNTP, 0.25 จะ 5 หน่วย/ll Ex Taq พอลิเมอเรส(TaKaRa), 0.175 ll ของรองพื้นแต่ละ (100 pmol ll) (MWGBiotechAG อันดับ เยอรมนี), 1 จะเจือจางแม่และ H2O จำนวน 25 จะ PCR มีดำเนินการกับการT3Thermocycler (Biometra) โดยใช้วงจรเงื่อนไขต่อไปนี้:denaturation เป็นเริ่มต้นที่ 94 C 3 นาที ตามโดยรอบ denaturation ที่ 94 C 30 30 s หลอมที่55 C s และยืดที่ C 72 30 30 s และการเป็นขั้นตอนสุดท้ายยืดที่ 72 C 6 นาทีเชื้อราดีเอ็นเอขยายโดยใช้วิธีกึ่งซ้อน (Oros Sichleret al. 2006), ที่ไพรเมอร์ NS1 (ขาว et al. 1990) และEF3 (Smit et al. 1999) เพิ่มส่วนของ rDNA 18 ปีในครั้งแรกPCR และผลิตภัณฑ์นี้แล้วใช้เป็นแม่แบบที่สองPCR ที่ใช้ไพรเมอร์ NS1 และ FR1 GC (Vainio และ Hantula2000) เป็นผลิตภัณฑ์สุดท้ายมีประมาณ 1650 bpแยกส่วนกับการเพิ่ม GC แคลมป์เหมาะสำหรับ DGGEทาง PCR ได้ตามที่อธิบายไว้สำหรับ PCR แบคทีเรียยกเว้นการใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน รอบเงื่อนไขในPCR เชื้อราครั้งแรกมีดังนี้: denaturation เป็นต้นขั้นตอนที่ 94 C สำหรับ 8 นาที ตาม ด้วย denaturation 25 รอบที่ C 94 30 s หลอม c 47 เป็นเวลา 45 วินาทีและยืดตัวc เป็นเวลา 3 นาทีและขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่ 72C 72 สำหรับ 10 นาที เงื่อนไขวงจรของเชื้อราสองPCR เป็นเหมือนการแรกเชื้อรา PCR ยกเว้นที่จะประกอบด้วยเพียง 20 รอบและที่อุณหภูมิหลอมมีค. 48 ผลิตภัณฑ์จากแบคทีเรีย และเชื้อราปฏิกิริยา PCR เป็นการตรวจสอบ โดย agarose เจอิประมาณจำนวนดีเอ็นเอในแต่ละอย่างโดยวิเคราะห์ภาพโดยใช้ GeneTools (SynGene) บนดิจิตอลภาพของเจ agarose ที่ได้รับจาก GeneSnap (SynGene)นี้ทำให้ที่เท่ากับจำนวนดีเอ็นเอจากตัวอย่างจะถูกโหลดลงบนเจ DGGE2.3. DGG

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 แยก DNA และ PCR
ดีเอ็นเอที่แยกได้จากตัวอย่างปุ๋ยหมักโดยใช้
FastDNA? ชุดสปินดิน (Qbiogene) แยกได้ดำเนินการ
ใน 0.4 กรัมปุ๋ยหมักโดยต่อไปนี้ผู้ผลิต
คำแนะนำ ดีเอ็นเอที่แยกได้จากแบบจำลอง I, II และ III
จากแต่ละสี่ปุ๋ยหมัก ความหลากหลายของจุลินทรีย์
กลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้ PCR-DGGE แบคทีเรีย
ดีเอ็นเอถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ของแบคทีเรียสากล
341f + GC และ 518r (Muyzer et al., 1993) ซึ่ง
ขยายส่วน 233 bp ของ 16S rDNA รวมทั้ง
40 bp GC-หนีบ PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ 2.5 LL 10 · Ex
Taq บัฟเฟอร์ (20 มิลลิเมตร Mg2 + Takara ประเทศญี่ปุ่น) 2 LL ขนาด 2.5 มม
dNTP ส่วนผสม, 0.25 LL 5 หน่วย / LL Ex Taq โพลิเมอร์
(Takara) 0.175 LL ของแต่ละไพรเมอร์ (100 pmol / LL) (MWGBiotech
แบงก์ Ebersberg, เยอรมนี) 1 LL แม่แบบเจือจาง
และ H2O รวม 25 LL PCR ได้ดำเนินการกับ
T3Thermocycler ใช้เงื่อนไขรอบต่อไปนี้ (Biometra?):
denaturation เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตาม
ด้วย 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่
55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและการยืดตัวที่ 72 C เป็นเวลา 30 วินาทีและจากนั้น
ขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 นาที เชื้อรา DNA ถูก
ขยายโดยใช้วิธีกึ่งซ้อนกัน (Oros-Sichler
et al., 2006) ที่ไพรเมอร์ NS1 (สีขาว et al., 1990) และ
EF3 (Smit et al., 1999) ขยายส่วนหนึ่งของ 18S rDNA ในครั้งแรก
PCR และผลิตภัณฑ์นี้ใช้แล้วเป็นแม่แบบในสอง
วิธี PCR ใช้ไพรเมอร์ NS1 และ FR1-GC (Vainio และ Hantula,
2000) สินค้าที่ได้คือประมาณ 1,650 bp
ชิ้นส่วนกับเพิ่ม GC-หนีบเหมาะสำหรับ DGGE.
คนละ PCR ถูกตามที่อธิบายไว้สำหรับแบคทีเรีย PCR
ยกเว้นการใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน เงื่อนไขในรอบ
แรกของเชื้อรา PCR มีดังนี้เริ่มต้น denaturation
ขั้นตอนที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 นาทีตามด้วย 25 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ
ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 47 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาทีและการยืดตัว
ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที และขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที เงื่อนไขรอบที่สองเชื้อรา
PCR เป็นเหมือนครั้งแรกเชื้อราวิธี PCR มีข้อยกเว้นว่า
มันมีเพียง 20 รอบและอุณหภูมิอบอ่อน
48 องศาเซลเซียสผลิตภัณฑ์จากแบคทีเรียและเชื้อรา
ปฏิกิริยา PCR ถูกตรวจสอบโดยข่าวคราว agarose
ปริมาณของดีเอ็นเอในแต่ละตัวอย่างที่ได้รับการประเมินโดย
การวิเคราะห์ภาพโดยใช้ GeneTools (SynGene) บนดิจิตอล
ภาพของเจล agarose ที่ได้รับกับ GeneSnap (SynGene).
นี้ทำเพื่อให้มั่นใจว่าปริมาณที่เท่ากันของ
ดีเอ็นเอจากตัวอย่างที่ถูกโหลดไปยังเจล DGGE .
2.3 DGG

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การแยกดีเอ็นเอและดีเอ็นเอดีเอ็นเอที่แยกได้จากตัวอย่างการใช้ปุ๋ยหมักfastdna ปั่นชุดดิน ( qbiogene ) มีการแยกในปุ๋ยหมัก 0.4 กรัมตามผู้ผลิตคําแนะนํา ดีเอ็นเอที่แยกได้จากแบบจำลองที่ 1 , 2 และ 3จากแต่ละสี่ปุ๋ยหมัก . ความหลากหลายของจุลินทรีย์ตัวอย่างที่ถูกกำหนดโดยใช้ของดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้ . แบคทีเรียดีเอ็นเอของแบคทีเรียชนิดที่ใช้สากล341f + GC และ 518r ( muyzer et al . , 1993 ) ซึ่งขยายเป็น 233 BP ส่วนของ 16S rDNA ได้แก่40 / GC ที่หนีบ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้ 2.5 จะ 10 ด้วย แฟนเก่าทัค บัฟเฟอร์ ( 20 มม. mg2 + ทาคาระ ญี่ปุ่น ) , ที่ 2 จะ 2.5 มม.ส่วนผสม dntp 0.25 จะ 5 หน่วย / จะใช้อดีตทัค( ทาการะ ) , 0.175 จะของแต่ละสี ( 100 pmol / 11 ) ( mwgbiotechebersberg AG , Germany ) , 1 จะแบบเจือจางและ H2O เพื่อรวมเป็น 25 ll ร่วมแสดงด้วยt3thermocycler ( biometra ) โดยใช้วงจรเงื่อนไขต่อไปนี้ :เริ่มต้นที่ 94 ( C เป็นเวลา 3 นาที ตาม30 รอบ ( ที่ 94 เป็นเวลา 30 วินาที annealing ที่55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและยืดที่ 72 C เป็นเวลา 30 วินาที และจากนั้นสุดท้ายการก้าวที่ 72 C เป็นเวลา 6 นาที รา ดีเอ็นเอคือขยายการใช้วิธีกึ่งซ้อนกัน ( โอรส sichleret al . , 2006 ) ที่ไพรเมอร์ 1 ( ขาว et al . , 1990 ) และef3 ( SMIT et al . , 1999 ) ขยายส่วนหนึ่งของ 18S rDNA ในแรกPCR และผลิตภัณฑ์นี้ถูกใช้เป็นแม่แบบในวินาทีPCR ใช้ไพรเมอร์ 1 และ fr1-gc ( ไวนิโอ hantula และ ,2000 ) ผลิตภัณฑ์สุดท้ายเป็น BP ประมาณ 1650ส่วน ด้วยการเพิ่ม GC หนีบเหมาะสำหรับการทดลอง .องค์ประกอบทั้งหมดจะถูกอธิบายโดยแบคทีเรียเป็นยกเว้นการใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน เงื่อนไขในรอบการตรวจเชื้อราก่อนดังนี้ : ( เริ่มต้นขั้นตอนที่ 94 ? C เป็นเวลา 8 นาที ตามด้วย ( 25 รอบที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที annealing ที่ 47 C เป็นเวลา 45 และการยืดตัว72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที และขั้นตอนสุดท้ายในการยืดตัว72 C 10 นาทีรอบเงื่อนไขสองราซึ่งเป็นเหมือนเชื้อราก่อน ยกเว้นว่ามันมีเพียง 20 รอบและที่อุณหภูมิการอบอ่อนคือ 48 C . ผลิตภัณฑ์จากเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราปฏิกิริยา PCR ได้ถูกตรวจสอบโดยกาโรสเจลปริมาณของ DNA ในแต่ละจำนวนโดยประมาณการวิเคราะห์ภาพที่ใช้ genetools ( syngene ) ดิจิตอลรูปของโรสเจลได้ด้วย genesnap ( syngene )นี้ทำเพื่อให้แน่ใจว่าปริมาณที่เท่ากันดีเอ็นเอจากตัวอย่างการทดลองโหลดลงบนเจล2.3 ดีจีจี