2. Materials and methods2.1. Sampli

2. Materials and methods
2.1. Sampling area

The samples of water and sediments were collected from Lake Tana, Amhara regional state, Ethiopia. The sampling area was located at a latitude of 12 (12° 0′ 0 N) and a longitude of 37.33 (37° 19′ 60 E). The lake was the source of Blue Nile with a total surface area of 3 600 km2, a volume of 28.00 km3 and an average elevation of 1 911 m above the sea level[24].

2.2. Sample collection

Totally 12 water and 12 sediment samples were collected from Gorgora site of Lake Tana which was located at 65 km North West direction of Gondar town. The water samples were collected in 500 mL sterile screw capped bottles and sufficient space was provided for aeration and thorough mixing. The sediments were collected by sterilized spatula and transferred to wide mouth sterilized bottle. All samples were labeled and transported to Microbiology Laboratory, Department of Biology, University of Gondar and stored at 4 °C for further studies.

2.3. Pretreatment of samples

The samples were subjected to various physical and chemical pretreatment methods in order to facilitate isolation of actinomycetes[25]. The sediment samples were air dried; heated aseptically, which stimulates the isolation of actinomycetes by eliminating most unwanted Gram negative bacteria. Appropriate selective media such as starch casein agar, glycerol yeast extract agar and antifungal antibiotics (amphotericin B) at 25 µg/mL were used for actinomycetes growth promotion and also for prevention of fungal contamination[26],[27].

2.4. Actinomycetes isolation and maintenance

Actinomycetes were isolated by serial dilution method from sediments[28]. Stock solution was prepared by diluting 1 g of sediment in 9 mL of sterile saline water and shaken well by using vortex mixer. From the stock solution, 1 mL was used to prepare the final volume of 10−1, 10−2, 10−3, 10−4 and 10−5 by serial dilution method. Finally, 0.1 mL of suspension from 10−1, 10−2, 10−3, 10−4 and 10−5 were used to spread on starch-casein agar medium aseptically. In water samples, 1 mL of aliquot was taken and spread evenly over the sterilized starch casein agar plates by using L-shaped glass rod. For each sample three plates were used and incubated at 30 °C for 7 to 14 d. The plates were observed periodically for the growth of actinomycetes. The pure colonies were selected, isolated and maintained in starch casein agar slants at 4 °C for subsequent studies.

2.5. Bacterial strains

Pathogenic bacterial strains such as E. coli (ATCC2592), Salmonella typhi (ATCC9289) (S. typhi), Staphylococcus aureus (ATCC2923) (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumonia (ATCC7000603) (K. pneumonia) were obtained from Gondar College of Medical Science, University of Gondar.

2.6. Preparation of 0.5 McFarland standard

McFarland standard was prepared by adding 0.5 mL of 0.048 mol/L BaCl2 (1.17% w/v BaCl2.2H2O) in to 99.5 mL of 0.18 mol/L H2SO4 (1% w/v) with constant stirring. The equal volume of standard solution was distributed into same sized screw capped test tubes. These test tubes were tightly sealed and stored at room temperature to prevent from evaporation and light. Before use, turbidity standard was vigorously agitated by using vortex mixer[29].

2.7. Procedures for inoculum preparation and inoculation

A pure colony of test bacteria was taken by using a sterile wire loop and transferred into test tubes having a sterile nutrient broth. The test tubes were incubated at 37 °C for 24 h until the visible turbidity and density equal to that of 0.5 McFarland standard. After adjusting the turbidity, sterile cotton swab was dipped into the suspension and streaked over the entire surface of the plate medium for three times by rotating the plate approximately at 60 °C to ensure uniform distribution of the inoculum.

2.8. Primary screening of isolates

During the primary screening, isolates were screened against selected bacterial strains by using perpendicular streak and agar overlay methods. Antagonistic activity of isolates against Gram negative and Gram positive bacteria was primarily screened by using perpendicular streak method and later evaluated by agar overlay method[28],[30]. In perpendicular streak method, nutrient agar media was used and each plate was streaked with individual isolates at the center/diameter of the plate and incubated at 30 °C for 7 d. Later, 24 h fresh sub-cultured test bacteria were prepared and streaked perpendicular to the isolates and incubated at 37 °C for 24 h[30]. In agar overlay method, 5-7 d old colony of actinomycetes was spot inoculated on nutrient agar plates and incubated for 7 d at 30 °C. Then overlaid with 5 mL of semisolid nutrient agar with standardized suspension of test bacteria was inoculated and incubated at 37 °C for 24 h. The zone of inhibition (in mm) around the colonies was measured.

2.9. Production of crude extracts

The isolates showing potential antibacterial activities from the primary screening was subjected to solid state and submerged state fermentation methods to produce crude extracts.

2.9.1. Solid state fermentation method
In this method, 100 g of the substrate (rice grain) was taken in to 500 mL conical flask and 100 mL of distilled water was added and boiled until the rice grains become softened. The mineral salt solution such as K2HPO4 (2.00 g/L), NaCl (1.00 g/L), MgSO4.7H2O (0.10 g/L) and CaCl2 (0.05 g/L) was added for optimization and autoclaved at 121 °C for 15 minutes. Then it was allowed to cool and inoculated with 2 mL of culture suspension from 7 d old actinomycetes culture grown on starch casein agar. After inoculation, flasks were incubated at 30 °C for two weeks. The completely fermented rice grain was ground with mortar and pestle and allowed to dry for 24 h at room temperature. Later, 100 mL of ethyl acetate and 100 mL of methanol was added to the extract and placed on rotary shaker at 120 r/min for 12 h. Finally, the extract was filtered with Whatman No.1 filter paper and the solvent phase was removed by using rotary vacuum evaporator set at water bath temperature of 60 °C[31].

2.9.2. Submerged state fermentation method
In this method, 1 000 mL of yeast and malt extract broth was prepared in which 100 mL was dispensed into 500 mL Erlenmeyer flask, sterilized and cooled. At room temperature broth was inoculated with 2 mL suspension of isolates and kept for 14 d in a rotary shaker at 200 r/min. Then the culture broth was harvested by centrifugation at 4 000 r/min for 15 min. The supernatant was collected and added equal volumes of ethyl acetate (1:1 v/v) then shaken vigorously for 1 h and repeated twice. The solvent phase was separated from aqueous phase by using a separating funnel and subjected to rotary vacuum evaporator at a water bath temperature of 60 °C at 100 r/min to remove solvent and to get crude extracts[32].

2.10. Secondary screening

2.10.1. Disc diffusion method
Antibacterial activities of the crude extracts were tested by using agar disc diffusion method as described by Kirby-Bauer with modification[33]. The inoculum was prepared by mixing a few bacterial colonies (1 mL) from exponential phase with 9 mL of sterile nutrient broth and compared the turbidity with that of the standard 0.5 McFarland solution which is equivalent to 106-108 CFU/mL. The sterile swab was dipped into properly adjusted inoculum and excess liquid was removed by gentle rotation of the cotton swab against the inner surface of the test tube. To obtain even growth, the entire Mueller Hinton agar (MHA) surface was swabbed uniformLy by the cotton swab. The inoculated plates were left at room temperature for 3-5 minutes to allow for any surface moisture to be absorbed before applying the extract. Ten mg/mL of each crude extracts was impregnated with filter paper (6 mm diameter disc) and placed on the surface of MHA medium. Standard antibiotic (tetracycline) disc was used as a positive control and filter paper disc soaked with methanol as a negative control. The selected standard antibiotic and the crude extracts were applied on the MHA in triplicate and left for 15 min to allow the extracts to diffuse. Then the plates were incubated at 37 °C for 18-24 h and the zone of inhibition (mm) was measured.

2.10.2. Agar well diffusion method
In this method inoculum was prepared as that of disc diffusion method. The well was prepared in the plate by using sterile cork borer (6 mm in diameter). A volumn of 100 µL of 10 mg/mL of crude extracts was carefully dispensed into each well and allowed to diffuse for 2 h and incubated at 37 °C for 24 h. The sterilized methanol was filtered and used as negative control. After 24 h of incubation, zone of inhibition around each well was recorded and the experiment was repeated for three times[34].

2.11. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC)

MIC and MBC was determined by broth two fold serial dilution method[35]. In this method one Gram positive and one Gram negative bacterial strain was used. For determination of MIC and MBC, 12 sterile screw capped test tubes were used. A volume of 1 mL of nutrient broth was dispensed into test tubes 1-10 and 2 mL into test tube 11 (broth control). 1 mL of the crude extract solution was added into test tubes 1 and 2 and 2 mL to test tube 12 (crude extract control). One milliliter of well mixed solution was transferred from test tube 2 to 3 and this process was continued serially up to the test tube 10 by mixing and changing the micropipette tips at each dilution. Finally 1 mL was discarded from test tube 10 and 0.1 mL of standardized inoculum was added into test tubes 1-10 and incubated at 37 °C for 18-24 h. After incubation, by observing the growth of bacteria in the test tube MIC value was determined. From the above test tubes with no growth (no turbidity), 0.1 mL was spreaded over the surface of Mueller Hinton agar plates. Aft

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สุ่มตัวอย่างพื้นที่

ตัวอย่างน้ำและตะกอนได้รวบรวมจากทะเลสาบทา Amhara ภูมิภาครัฐ เอธิโอเปีย พื้นที่สุ่มอยู่ที่ละติจูด 12 (12° 0′ 0 N) และลองจิจูดของ 37.33 (37° 19′ 60 E) ได้ ทะเลสาบมีแหล่งที่มาของบลูไนล์ มีพื้นที่ทั้งหมดของ 3 600 km2 ปริมาตรของ 2800 km3 และระดับความสูงเฉลี่ย 1 911 เมตรเหนือระดับน้ำทะเล [24]

2.2 ตัวอย่างชุด

น้ำ 12 ทั้งหมดและตัวอย่างตะกอน 12 ถูกเก็บรวบรวมจากเว็บไซต์ Gorgora ของทาเลที่ตั้งอยู่ที่ 65 กิโลเมตรทิศตะวันตกเฉียงเหนือของ Gondar เมือง ตัวอย่างน้ำที่เก็บในขวดขนาด 500 มล.ใส่สกรูปรบมือ และให้พื้นที่เพียงพอสำหรับ aeration และผสมอย่างละเอียด ตะกอนได้เก็บรวบรวม โดย sterilized พาย และโอนย้ายไปขวด sterilized ปากกว้าง ตัวอย่างทั้งหมดมีป้าย และขนส่งไปห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ภาควิชาชีววิทยา มหาวิทยาลัย Gondar และเก็บที่ 4 ° C สำหรับเพิ่มเติมศึกษา

2.3 Pretreatment อย่าง

ตัวอย่างถูกต้องต่าง ๆ ทางกายภาพ และเคมี pretreatment วิธีการเพื่อช่วยในการแยกของ actinomycetes [25] ตัวอย่างตะกอนถูกอากาศแห้ง ซึ่งความร้อน aseptically กระตุ้นแยกของ actinomycetes โดยตัดสุดกรัมลบแบคทีเรีย สื่อเลือกที่เหมาะสมเช่นแป้งเคซีน agar กลีเซอรยีสต์สารสกัด agar และต้านเชื้อรายาปฏิชีวนะ (amphotericin B) ที่มล 25 ไมโครกรัมเป็นเครื่องใช้ สำหรับโปรโมชั่น actinomycetes เติบโต และป้องกันเชื้อราปนเปื้อน [26], [27]

2.4 บำรุงรักษาและ actinomycetes แยก

Actinomycetes ถูกแยกต่างหาก โดยวิธีเจือจางประจำจากตะกอน [28] โซลูชันหุ้นโดย g 1 diluting ของตะกอนใน 9 mL ของน้ำเกลือฆ่าเชื้อ และหวาดวิตกกัน โดยใช้เครื่องผสม vortex จากการแก้ปัญหาสินค้าคงคลัง 1 mL ใช้เตรียมปริมาตรสุดท้ายของ 10−1, 10−2, 10−3, 10−4 และ 10−5 โดยวิธีเจือจางประจำ สุดท้าย 0.1 mL ของระงับจาก 10−1, 10−2, 10−3, 10−4 และ 10−5 ที่ใช้โบกแป้งเคซีน agar กลาง aseptically ในตัวอย่างน้ำ 1 mL ของส่วนลงตัวถูกดำเนินการ และกระจายทั่วแผ่นแป้ง sterilized เคซีน agar โดยร็อดแก้วรูปตัว L สำหรับตัวอย่างแต่ละ แผ่นที่สามถูกใช้ และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ d 7-14 แผ่นถูกสังเกตเป็นระยะ ๆ สำหรับการเติบโตของ actinomycetes เลือกอาณานิคมบริสุทธิ์ แยก และยังคงอยู่ในแป้งเคซีน agar เอียงที่ 4 ° C สำหรับการศึกษาต่อมา

2.5 สายพันธุ์แบคทีเรีย

สายพันธุ์แบคทีเรียอุบัติเช่น E. coli (ATCC2592), ซัล typhi (ATCC9289) (S. typhi), Staphylococcus หมอเทศข้างลาย (ATCC2923) (S. หมอเทศข้างลาย), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) (P. aeruginosa) และโรค Klebsiella (ATCC7000603) (คุณ โรค) ได้รับจาก Gondar วิทยาลัยทางการแพทย์วิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยของ Gondar

2.6 เตรียม 0.5 McFarland มาตรฐาน

มาตรฐาน McFarland ได้เตรียมเพิ่ม 0.5 mL ของ 0.048 โมล/L BaCl2 (ความ 1.17% w/v BaCl2.2H2O) ในการมล 99.5 ของโมล 0.18 L กำมะถัน (1% w/v) กับกวนคงที่ ปริมาตรของสารละลายมาตรฐานเท่ามีการกระจายเข้าไปในหลอดทดสอบขนาดสกรูปรบมือกัน หลอดทดสอบเหล่านี้ถูกปิดผนึกแน่น และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเพื่อป้องกันการระเหยและแสง ก่อนใช้ ความขุ่นมาตรฐานได้ดั่งนั้นกระตุ้นทำ โดยใช้เครื่องผสม vortex [29]

2.7 ขั้นตอนการเตรียม inoculum inoculation

ฝูงทดสอบแบคทีเรียบริสุทธิ์นำโดยวนใส่ลวด และโอนย้ายเข้าไปในหลอดทดสอบมีซุปเป็นธาตุอาหารที่ฆ่าเชื้อ หลอดทดสอบได้ incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชมจนกระทั่งเห็นความขุ่นและความหนาแน่นเท่ากับ 0.5 McFarland มาตรฐาน หลังจากปรับความขุ่นใน กอซสำลีจุ่มลงในการระงับ และลายบนพื้นผิวทั้งหมดของสื่อแผ่นสำหรับสามครั้ง โดยหมุนจานประมาณที่ 60 ° C เพื่อให้กระจายสม่ำเสมอของ inoculum

2.8 คัดแยกหลัก

ระหว่างคัดกรองหลัก แยกได้ฉายกับเลือกสายพันธุ์แบคทีเรีย โดยใช้เส้นริ้วและ agar ซ้อนทับวิธีการ กิจกรรมการต่อต้านของแยกแบคทีเรียกรัมบวกและกรัมลบถูกฉายเป็นหลัก โดยใช้วิธีเส้นริ้ว และภายหลังประเมิน โดยวิธี agar ซ้อนทับ [28], [30] ในแนวตั้งฉากวิธี ใช้สื่อ agar ธาตุอาหาร แล้วแต่ละแผ่นลายกับแยกแต่ละที่ศูนย์/เส้นผ่าศูนย์กลางของจาน และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d ภายหลัง แบคทีเรียย่อยอ่างทดสอบสด 24 ชมได้เตรียม และลายเส้นตั้งฉากกับการแยก และ incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชม [30] ในวิธีการซ้อนทับ agar 5-7 d อาณานิคมเก่าของ actinomycetes เป็นจุด inoculated บนแผ่นธาตุอาหาร agar และ incubated สำหรับ 7 d ที่ 30 องศาเซลเซียส แล้ว overlaid กับ 5 mL ของ semisolid agar ธาตุอาหารกับระงับเชื้อแบคทีเรียทดสอบมาตรฐาน inoculated และ incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชม โซนยับยั้ง (ใน mm) ทั่วอาณานิคมถูกวัด

2.9 ผลิตสารสกัดจากน้ำมัน

การแยกแสดงศักยภาพกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียจากการคัดกรองหลักถูกยัดเยียดให้ของแข็งและวิธีการหมักน้ำท่วมรัฐผลิตสารสกัดหยาบ

2.9.1 วิธีการหมักของแข็ง
ในวิธีการนี้ 100 กรัมของพื้นผิว (เมล็ดข้าว) ถ่ายไป 500 mL ทรงกรวยหนาว และเพิ่ม 100 mL ของน้ำกลั่น และต้มจนเม็ดข้าวกลายเป็นก่อ การแก้ปัญหาเกลือแร่เช่น K2HPO4 (2.00 g/L), NaCl (1.00 g/L), MgSO4.7H2O (0.10 g/L) และ CaCl2 (0.05 g/L) ถูกเพิ่มสำหรับการปรับ และ autoclaved ที่ 121 ° C 15 นาที จากนั้น จะได้อนุญาตให้เย็น และ inoculated มี 2 mL ของวัฒนธรรมระงับจาก 7 d วัฒนธรรม actinomycetes เก่าปลูกในแป้งเคซีน agar หลังจาก inoculation น้ำถูกจัด incubated ที่ 30 ° C สำหรับสองสัปดาห์ เมล็ดข้าวสมบูรณ์หมักดินกับโกร่ง และอนุญาตให้แห้งสำหรับ 24 ชมที่อุณหภูมิห้อง ภายหลัง 100 mL ของเอทิล acetate และ 100 mL ของเมทานอลถูกเพิ่มสารสกัด และวางลงในเชคเกอร์โรตารี่ที่ r 120 นาทีสำหรับ 12 h สุดท้าย การดึงข้อมูลที่กรอง Whatman หมายเลขกระดาษกรองที่ 1 และระยะที่เป็นตัวทำละลายถูกเอาออก โดยใช้โรตารี่ evaporator สูญญากาศที่อุณหภูมิ 60 ° C [31] อาบน้ำ

2.9.2 น้ำท่วมรัฐวิธีหมัก
ในวิธีการนี้ 1 000 mL ของยีสต์และมอลต์สกัดซุปเตรียมไว้ที่ 100 มลคำเป็น 500 mL Erlenmeyer หนาว sterilized และระบายความร้อนด้วย ที่อุณหภูมิห้อง ซุปถูก inoculated กับ 2 mL ระงับการแยก และเก็บไว้ใน d 14 ในเชคเกอร์โรตารี่ที่ 200 r/min แล้ว ซุปวัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ r 4 000/min ใน 15 นาที Supernatant ถูกรวบรวม และเพิ่มวอลุ่มเท่าของเอทิล acetate (1:1 v/v) แล้วเขย่าโยคะสำหรับ 1 h และทำซ้ำสองครั้ง แยกจากระยะอควี โดยใช้กรวยแยกเฟสตัวทำละลาย และการโรตารี่ดูด evaporator ที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสที่ 100 r/min อาบน้ำเอาตัวทำละลาย และการรับน้ำมันดิบแยก [32]

2.10 คัดกรองรอง

2.10.1 ดิสก์วิธีแพร่
กิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของสารสกัดหยาบที่ทดสอบโดยวิธี agar ดิสก์แพร่ตามที่อธิบายไว้ โดยเคอร์บี้วเออร์กับการแก้ไข [33] Inoculum ที่เตรียม โดยผสมแบคทีเรียบางอาณานิคม (1 mL) จากระยะเนนกับ 9 mL ของซุปใส่ธาตุอาหาร และเปรียบเทียบความขุ่นกับโซลูชัน McFarland 0.5 มาตรฐานซึ่งจะเท่ากับ 106-108 CFU/mL กวาดใส่ถูกจุ่มลงใน inoculum ปรับปรุงอย่างถูกต้อง และของเหลวส่วนเกินถูกเอาออก โดยหมุนเบา ๆ ของสำลีกับพื้นผิวด้านในของหลอดทดสอบ รับแม้การเจริญเติบโต พื้นผิวทั้งหมด Mueller Hinton agar (MHA) ถูก swabbed สม่ำเสมอเมื่อเทียบเคียง โดยสำลี แผ่น inoculated ถูกทิ้งที่อุณหภูมิห้อง 3-5 นาทีเพื่อให้ความชื้นใด ๆ ผิวจะดูดซึมก่อนที่จะใช้การดึงข้อมูล 10 mg/mL สารสกัดจากน้ำมันแต่ละ impregnated กับกระดาษกรอง (แผ่นเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 มิลลิเมตร) และวางอยู่บนพื้นผิวของตัวกลาง MHA มีใช้ดิสก์มาตรฐานยาปฏิชีวนะ (เตตราไซคลีน) เป็นบวกควบคุมและกระดาษกรองดิสก์กับเมทานอลเป็นตัวควบคุมค่าลบที่เปี่ยมล้นไปด้วย ยาปฏิชีวนะมาตรฐานเลือกและสารสกัดหยาบที่ใช้กับ MHA ใน triplicate และซ้าย 15 นาทีให้สารสกัดขจาย แล้วแผ่นก็ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 18-24 และโซน (mm) ยับยั้งถูกวัด

2.10.2 วิธีแพร่ดี agar
วิธีนี้ inoculum ถูกเตรียมไว้เป็นของดิสก์วิธีการแพร่ ดีเตรียมไว้ในจานโดยคอร์กกอซ borer (เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มิลลิเมตร) Volumn ของ 100 µL ของ 10 mg/mL สารสกัดจากน้ำมันอย่างระมัดระวังคำในแต่ละดี และสามารถกระจายใน 2 h และ incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชม เมทานอล sterilized กรอง และใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ หลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ โซนยับยั้งรอบละทั้งถูกบันทึก และทดลองถูกทำซ้ำสำหรับสามเวลา [34]

2.11 กำหนดความเข้มข้นลิปกลอสไขต่ำสุด (MIC) และความเข้มข้น bactericidal ต่ำสุด (ช่อง MBC)

ไมค์และช่อง MBC ได้ถูกกำหนด โดยซุปสองพับวิธีเจือจางประจำ [35] ในการนี้วิธีหนึ่งกรัมบวกและกรัมหนึ่ง ต้องใช้แบคทีเรียลบถูกใช้ สำหรับเรื่องของไมค์และช่อง MBC มีใช้หลอดทดสอบกระบอกสกรูปรบมือ 12 ปริมาตรของ 1 mL ของธาตุอาหารซุปมีคำลงในหลอดทดสอบ 1-10 และ 2 มล.ลงในหลอดทดสอบ 11 (ซุปควบคุม) 1 mL ของสารสกัดหยาบถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดสอบ 1 และ 2 และ 2 mL เพื่อทดสอบหลอด 12 (สารสกัดน้ำมันควบคุม) Milliliter หนึ่งของโซลูชันที่ดีผสมถูกโอนย้ายจากหลอดทดสอบ 2-3 และกระบวนการนี้ถูกต่อ serially ถึง 10 หลอดทดสอบ โดยผสม และเคล็ดลับ micropipette ที่เจือจางแต่ละการเปลี่ยนแปลง สุดท้าย 1 mL ถูกละทิ้งจากหลอดทดสอบ 10 และ 0.1 mL ของ inoculum มาตรฐานถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดสอบ 1-10 และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 18-24 หลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์ ค่าถูกกำหนด โดยการสังเกตการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในหลอดทดสอบ MIC จากหลอดทดสอบข้างต้นกับไม่เจริญเติบโต (ไม่ความขุ่น), 0.1 mL ได้ spreaded ผ่านพื้นผิวของแผ่น Mueller Hinton agar Aft

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 .  วัสดุและวิธีการ
2.1 . พื้นที่

ตัวอย่างน้ำและดินตะกอนที่เก็บจากทะเลสาบธนาสุ่มตัวอย่างภูมิภาค Amhara รัฐ , เอธิโอเปีย ตัวอย่าง พื้นที่ตั้งอยู่ที่ละติจูดที่ 12 ( 12 / 0 ได้รับ 0 n ) และลองจิจูดของที่สุด ( 37 ° 19 ได้รับ 60 E ) ทะเลสาบเป็นแหล่งของไนล์สีฟ้าที่มีพื้นที่ผิวทั้งหมดของ 3   600 ตารางกิโลเมตร มีปริมาณ 2800 km3 และความสูงเฉลี่ยของ 1   911 เมตรเหนือระดับน้ำทะเล [ 24 ] .

. .

รวม 12 คอลเลกชันตัวอย่างน้ำและดินตะกอน gorgora 12 รวบรวมจากเว็บไซต์ของทะเลสาบธนา ซึ่งอยู่ที่ 65 กิโลเมตรทางตะวันตกเฉียงเหนือของ Gondar ทิศทางเมือง ได้ทำการเก็บตัวอย่างใน 500 มล. ปราศจากรอยบากและพื้นที่เพียงพอให้สำหรับการเติมอากาศและทั่วถึงผสมตะกอนในการเก็บรวบรวมและโอนไปยังปากกว้างไม้พายฆ่าเชื้อฆ่าเชื้อขวดนม ตัวอย่างป้าย และส่งไปยังห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ภาควิชาชีววิทยา มหาวิทยาลัยของ Gondar และเก็บไว้ที่ 4 ° C ต่อการศึกษา .

2.3 นำตัวอย่าง

ตัวอย่างงานต่างๆวิธีการทางฟิสิกส์และเคมีปรับสภาพเพื่อความสะดวกในการแยกเชื้อแอคติโนมัยสีท [ 25 ] ตัวอย่างตะกอนแห้ง ; อุ่น aseptically ซึ่งกระตุ้นการแยกเชื้อแอคติโนมัยสีท โดยขจัดแบคทีเรียแกรมลบที่ไม่พึงประสงค์มากที่สุด . การเลือกสื่อที่เหมาะสม เช่น วุ้น , แป้งสารสกัดจากยีสต์และเชื้อรายาปฏิชีวนะใช้กลีเซอรอล ( amphotericin B ) ที่ 25 µ g / ml ตามลำดับเพื่อการส่งเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อแอคติโนมัยสีทและยังเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อรา [ 26 ] [ 27 ] .

2.4 . แอคติโนมัยซีทแยกและการบำรุงรักษา

แอคติโนมัยซีทแยกโดยวิธีอุทิศถวายจากตะกอน [ 28 ]โซลูชั่นหุ้นถูกเตรียมโดยละลาย 1 กรัมของดินตะกอนใน 9 ml ของน้ำเกลือปลอดเชื้อและสะเทือนได้ดี โดยการใช้เครื่องผสม . . จากโซลูชั่นหุ้น 1 ml ใช้เตรียมเล่มสุดท้าย 10 − 1 , − 2 10 10 − 3 , 10 − 4 และ 10 − 5 โดยวิธีเจือจางแบบต่อเนื่อง ในที่สุด , 0.1 มิลลิลิตรจากที่พัก 10 − 1 , − 2 10 10 − 3 , 10 − 4 และ 10 − 5 ถูกใช้เพื่อกระจายบนอาหารวุ้นแป้ง , aseptically .ในตัวอย่างน้ำ 1 มิลลิลิตรส่วนลงตัวถูกกระจายไปกว่าเคซีนวุ้นแผ่นแป้งฆ่าเชื้อโดยใช้แท่งแก้วรูปตัว L . สำหรับแต่ละตัวอย่างสามจานใช้และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 7 ถึง 14 วัน พบว่ามีแผ่นเป็นระยะการเจริญเติบโตของแอคติโนมัยซีส . อาณานิคมบริสุทธิ์ถูกเลือกแยกและรักษาในแป้ง , วุ้น slants ที่ 4 ° C ต่อการศึกษา .

2.5 แบคทีเรียก่อโรคจากแบคทีเรียสายพันธุ์

เช่น E . coli , Salmonella ( atcc2592 ) ไทฟอยด์ ( atcc9289 ) ( S . ไทฟอยด์ ) , Staphylococcus aureus ( atcc2923 ) ( S . aureus ) , Pseudomonas aeruginosa ( atcc27853 ) ( P . aeruginosa ) และ Klebsiella ปอดบวม ( atcc7000603 ) ( Kปอดบวม ) ที่ได้รับจากวิทยาลัยวิทยาศาสตร์การแพทย์ของ Gondar Gondar , มหาวิทยาลัย .

2.6 การเตรียม 0.5 แมคฟาร์แลนด์มาตรฐาน

แมคฟาร์แลนด์มาตรฐานเตรียมเพิ่ม 0.5 มิลลิลิตร 0.052 โมลต่อลิตร bacl2 ( 1.17 % W / V bacl2.2h2o ) ในระบบประมาณ 0.18 mol / L กรดซัลฟิวริก ( 1% w / v ) กับคงตื่นเต้น ปริมาณที่เท่ากันของสารละลายมาตรฐานกระจายไปปกคลุมด้วยสกรูขนาดเดียวกัน หลอดทดสอบหลอดทดสอบเหล่านี้ได้ถูกผนึกแน่นและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเพื่อป้องกันการระเหยของน้ำและไฟ ก่อนที่จะใช้มาตรฐานความขุ่นอย่างแข็งขัน ปั่นป่วน โดยใช้ผสม Vortex [ 29 ] .

2.7 . ขั้นตอนการเตรียมเชื้อเชื้อบริสุทธิ์และ

เป็นอาณานิคมของแบคทีเรียทดสอบถ่ายโดยใช้ห่วงลวดที่เป็นหมันและถ่ายโอนลงในหลอดทดลองที่มีการฆ่าเชื้ออาหารซุปหลอดทดสอบถูกบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จนกระทั่งมองเห็นความขุ่นและความหนาแน่นเท่ากับ 0.5 แมคฟาร์แลนด์ มาตรฐาน หลังจากปรับค่าความขุ่น , ไม้กวาดฝ้ายเป็นหมันถูกจุ่มลงในการระงับและลายไปทั่วพื้นผิวของจานกลางสามครั้ง โดยหมุนจานประมาณ 60 ° C เพื่อให้แน่ใจว่า การแจกแจงของเชื้อ

2.8 .หลักคัดเลือกสายพันธุ์

ในการคัดกรองการคัดกรองแบคทีเรียไอโซเลท กับ เลือก โดยใช้แนวตั้งฉากและวิธีการซ้อนวุ้น กิจกรรมของเชื้อปฏิปักษ์ต่อแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบที่ถูกคัดกรอง โดยวิธี streak ตั้งฉากและต่อมาประเมินโดยวิธี agar ซ้อนทับ [ 28 ] , [ 30 ]ในวิธีการแนวตั้งฉาก สื่อ NUMB3RS ถูกใช้และแต่ละแผ่นเป็นลายแบบไอโซเลทที่ศูนย์ / เส้นผ่าศูนย์กลางของจานและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 7 วันภายหลัง 24 ชั่วโมงสดย่อยอาหารทดสอบแบคทีเรียถูกเตรียมและลายตั้งฉากกับไอโซเลทและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง [ 30 ] . วิธีหุ้มวุ้น5-7 D อาณานิคมเก่าด้วยกัน มีจุดที่ปลูกบนแผ่นวุ้นสารอาหารและบ่มเป็นเวลา 7 D ที่ 30 องศา แล้ววางทับด้วย 5 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อสารอาหารกึ่งแข็งด้วยช่วงล่างมาตรฐานของแบคทีเรียทดสอบเป็นเชื้อบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โซนของการยับยั้ง ( มม. ) รอบโคโลนีวัด

2.9 . การผลิตสารสกัดจาก

ดิบการแยกเชื้อแบคทีเรียที่อาจเกิดขึ้นจากการแสดงกิจกรรมหลักภายใต้สถานะของแข็งและวิธีหมักสภาพจมอยู่ใต้น้ำเพื่อผลิตสารสกัด

: .
วิธีการหมักของแข็งวิธีการนี้ของพื้นผิว 100 กรัม ( ข้าว ) ถ่ายใน 500 ml ขวดกรวยและ 100 มล. น้ำกลั่นเติมและต้มจนข้าวเป็นธัญพืชลดลงสารละลายเกลือแร่ เช่น k2hpo4 ( 2.00 กรัม / ลิตร ) , เกลือ ( 1.00 กรัม / ลิตร ) , mgso4.7h2o ( 0.10 กรัม / ลิตร ) และผลิต ( 0.05 กรัม / ลิตร ) ถูกเพิ่มสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพและสังเคราะห์ที่ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที มันได้รับอนุญาตให้เย็นและใส่ 2 ml ของการระงับวัฒนธรรมจาก 7 D เก่าด้วยกันวัฒนธรรมเติบโตบนอาหารวุ้น , แป้ง หลังจากที่ได้รับ flasks อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 2 สัปดาห์ทั้งหมดเมล็ดข้าวหมักถูกพื้นดินกับครกและสาก และได้รับอนุญาตให้แห้งเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ต่อมา 100 มิลลิลิตรของเอทิลอะซีเตทและ 100 มิลลิลิตร เติมสารสกัดเมทานอลและวางไว้บนเครื่องเขย่าที่ 120 R / นาทีเป็นเวลา 12 ชั่วโมง ในที่สุด สารสกัดถูกกรองด้วย whatman ไม่กระดาษ 1 กรองและเฟสตัวทำละลายจะถูกลบออกโดยใช้เครื่องระเหยแบบสุญญากาศตั้งน้ำร้อนอุณหภูมิ 60 องศา C [ 31 ] .

2.9.2 .
วิธีการหมักสภาพจมอยู่ในวิธีการนี้ , 1   000 มิลลิลิตร สารสกัดจากยีสต์และน้ำซุปที่เตรียมไว้ในข้าวมอลต์ที่ 100 มล. ก็จ่ายไป 500 มล. เออร์เลนเมเยอร์ขวดฆ่าเชื้อและทำให้เย็นที่ใส่น้ำอุณหภูมิห้อง 2 มล ระงับเชื้อ และเก็บไว้สำหรับ 14 D ในเครื่องปั่นหมุนที่ 200 R / นาที แล้ววัฒนธรรมซุปเก็บเกี่ยวโดยการเหวี่ยงแยกที่ 4 000 R / นาทีเป็นเวลา 15 นาที และน่าน รวบรวมข้อมูลและเพิ่มเท่ากับปริมาณเอทิลอะซิเตท ( 1 : 1 v / v ) แล้วเขย่าแรงๆ สำหรับ 1 H และซ้ำ 2 ครั้งเฟสตัวทำละลายแยกจากเฟสน้ำโดยใช้กรวยแยก และต้องระเหยแบบสุญญากาศที่อุณหภูมิ 60 องศา C น้ำอาบที่ 100 R / มินเอาตัวทำละลายและได้รับสารสกัดหยาบ [ 32 ] .

2.10 . การคัดกรองรอง

2.10.1 . แผ่นกระจายวิธี
กิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียจากสารสกัดทดสอบโดยวิธี agar disc diffusion ตามที่อธิบายไว้โดยเคอร์บี้ บาวเออร์ กับการปรับเปลี่ยน [ 33 ] เชื้อถูกเตรียมโดยผสมอาณานิคมแบคทีเรียไม่กี่ ( 1 มล. ) จากชี้แจงระยะ 9 มิลลิลิตรของน้ำซุปและอาหารปลอดเชื้อเปรียบเทียบความขุ่นที่มาตรฐาน 0.5 แมคฟาร์แลนด์ โซลูชั่น ซึ่งเทียบเท่ากับ 106-108 CFU / mlเช็ดล้างฆ่าเชื้อถูกจุ่มลงในของเหลวและเชื้ออย่างถูกต้องปรับส่วนเกินออกด้วยการหมุนที่อ่อนโยนของผ้าฝ้ายกับผิวด้านในของหลอดทดสอบ รับการเติบโต แม้ว่าทั้ง มุลเลอร์ ฮินตัน ( MHA ) พื้นผิวทำความสะอาดอย่างสม่ำเสมอ โดยผ้าฝ้าย .การใส่แผ่น ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ประมาณ 3-5 นาที เพื่อให้ความชื้นของพื้นผิวใด ๆที่จะถูกดูดซึมก่อนที่จะใช้สารสกัด มล. มิลลิกรัม / 10 ของแต่ละสกัดถูกชุบด้วยกระดาษกรอง ( 6 มม. เส้นผ่าศูนย์กลางดิสก์ ) และวางไว้บนพื้นผิวของมะ )มาตรฐานยาปฏิชีวนะ ( tetracycline ) ดิสก์ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกและกรองกระดาษแผ่นแช่ด้วยเมทานอลเป็นตัวควบคุมลบ เลือกมาตรฐานยาปฏิชีวนะและสารสกัดที่ใช้ใน MHA ทั้งสามใบแล้ว 15 นาที เพื่อให้สารสกัด เพื่อกระจาย . แล้วจานก็บ่มที่ 37 ° C ระหว่าง H และโซนของการยับยั้ง ( มม. ) วัด

2.10.2 .วุ้นดีกระจายวิธี
ในวิธีนี้โดยเตรียมเป็นวิธีแพร่แผ่นดิสก์ ได้เป็นอย่างดีที่เตรียมไว้ในจาน ใช้ฆ่าเชื้อก๊อกเจาะ ( 6 มม. ) มีปริมาตร 100 µ L 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรของสารสกัดเป็นอย่างดีจ่ายในแต่ละอย่างดีและอนุญาตให้กระจาย สำหรับ 2 ชั่วโมงและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยเมทานอลเป็นกรองและใช้ควบคุมลบ หลังจาก 24 ชั่วโมง 1 , โซนยับยั้งในแต่ละรอบก็ถูกบันทึก และทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง [ 34 ] .

2.11 . การหาความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง ( MIC ) และความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถฆ่าเชื้อ ( MBC )

' และ MBC ถูกกำหนดโดยซุปสองพับอุทิศถวายวิธี [ 35 ]ในวิธีนี้หนึ่งกรัมบวกและแกรมลบแบคทีเรียสายพันธุ์ที่ใช้ หาไมค์และ MBC 12 เป็นหมันกรูปกคลุมหลอดทดลองมาใช้ ปริมาณ 1 มิลลิลิตรของน้ำซุปลงในหลอดทดสอบธาตุ dispensed 2 มล. ในหลอดทดลอง 1-10 และ 11 ( ควบคุมน้ำซุป ) 1 มิลลิลิตรของสารละลายสกัดที่เพิ่มลงในหลอดทดลองที่ 1 และ 2 และ 2 มล. ในหลอดทดสอบที่ 12 ( การควบคุมสารสกัด )หนึ่งมิลลิลิตรของสารละลายผสม ถูกย้ายจากหลอดทดลอง 2 และกระบวนการนี้ต่ออนุกรมขึ้นไปทดสอบหลอด 10 โดยการผสมและการเปลี่ยนแปลงไมโครปิเปตทิปที่แต่ละเจือจาง ในที่สุด 1 ml ถูกทิ้งจากหลอด 10 และ 0.1 มิลลิลิตร ปริมาณมาตรฐานถูกเพิ่มลงในหลอดทดลอง 1-10 และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง หลังจากระยะเวลาโดยการสังเกตการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในหลอดทดลองไมค์ค่าถูกกำหนดไว้ จากข้างต้นการทดสอบท่อที่ไม่มีการเติบโต ( ไม่ขุ่น ) , 0.1 ml พบแพร่กระจายบนพื้นผิวของ มุลเลอร์ ฮินตัน วุ้นแผ่น ทางท้ายเรือ