or in a flotation apparatus. For m

or in a flotation
apparatus. For maximum recovery of the product of value, washing of the biomass is often
advisable, for example in the form of a diafiltration. The selection of the method is dependent upon the biomass content in the fermentation broth and the properties of the biomass, and also the interaction of the biomass with the organic compound (e. the product
of value). ในหนึ่งรุรุ, the fermentation broth can be sterilized or pasteurized. In a 5 further embodiment, the fermentation broth is concentrated. Depending on the requirement,
this concentration can be done batch wise or continuously. The pressure and temperature
range should be selected such that firstly no product damage occurs, and secondly minimal
use of apparatus and energy is necessary. The skillful selection of pressure and
temperature levels for a multistage evaporation in particular enables saving of energy.
10
The recovery process may further ประกอบรวมด้วย additional purification steps in which alanine is further purified. If, however, alanine is converted into a secondary organic product by chemical reactions as described below, a further purification of alanine is, depending on the
kind of reaction and the reaction conditions, not necessarily required. For the purification of 15 alanine obtained in process step II) methods known to the person skilled in the art can be
used, as for example crystallization, filtration, electrodialysis and chromatography. The
resulting solution may be further purified by means of ion exchange chromatography in
order to remove undesired residual ions.

20 According to a preferred embodiment of the process according to the การประดิษฐ์นี้ the
process further ประกอบรวมด้วย the process step:

III) conversion alanine contained in the fermentation broth obtained in process step I) or
conversion of the recovered organic compound obtained in process step II) into a
25 secondary organic product being different from the organic compound by อย่างน้อย one
chemical reaction.

The การประดิษฐ์ is now explained in more detail with the aid of figures and non-limiting examples.
30
Figure 1 shows a schematic map of plasmid pSacB.

Figure 2 shows a schematic map of plasmid pSacB alaD.

35 Figure 3 shows a schematic map of plasmid pSacB AldhA .

Figure 4 shows a schematic map of plasmid pSacB Apf/D.
Figure 5 shows a schematic map of plasmid pSacB ApfiA 40
Figure 6 shows a schematic map of plasmid pSacB ApckA.



PF 75583
17
EXAMPLES

Example 1: General method for the transformation of Basfia succiniciproducens

Strain
ไวด์ไทป์ DD1 (deposit DSM18541) DD1 AldhA AptID (DD3)
DD1 AldhA ApflD alaD (DD3 alaD)
DD1 AldhA ApfID ApckA alaD (DD3 ApckA alaD)
5 Table 1: Nomenclature of the DD1-ไวด์ไทป์ and mutants referred to in the examples

Basfia succiniciproducens DD1 (ไวด์ไทป์) was transformed with DNA by electroporation using the following protocol:

10 For preparing a pre-culture DD1 was inoculated from frozen stock into 40 ml BHI (brain
heart infusion; Becton, Dickinson and Company) in 100 ml shake flask. Incubation was performed over night at 37°C; 200 rpm. For preparing the main-culture 100 ml BHI were placed in a 250 nil shake flask and inoculated to a final OD (600 nm) of 0.2 with the pre-
culture. Incubation was performed at 37°C, 200 rpm. The cells were harvested at an OD of 15 approximately 0.5, 0.6 and 0.7, pellet was washed once with 10% cold glycerol at 4°C and
re-suspended in 2 ml 10% glycerol (4°C).
100 pl of competent cells were the mixed with 2-8 pg DNA and kept on ice for 2 min in an
electroporation cuvette with a width of 0.2 cm. Electroporation under the following 20 conditions: 400 0; 25 pF; 2.5 kV (Gene Pulser, Bio-Rad). 1 ml of chilled BHI was added
immediately after electroporation and incubation was performed for approximately 2 h at
37°C.
Cells were plated on BHI with 5 mg/L chloramphenicol and incubated for 2-5 d at 37°C until 25 the colonies of the ทรานสฟอร์แมนต์s were visible. Clones were isolated and restreaked onto
BHI with 5 mg/I chloramphenicol until purity of clones was obtained.

Example 2: Generation of deletion constructs

30 Mutation/deletion plasmids were constructed based on the vector pSacB (SEQ ID NO: 13).
Figure 1 shows a schematic map of plasmid pSacB. 5'- and 3'- flanking regions (approx. 1500 by each) of the chromosomal fragment, which should be deleted were amplified by PCR from chromosomal DNA of Basfia succiniciproducens and introduced into said vector
using standard techniques. Normally, อย่างน้อย 80% of the ORF were targeted for a deletion. 35 In such a way the deletion plasmids for the lactate ดีไฮโดรจีเนส /dhA, pSacB_delta_/dhA
(SEQ ID NO: 15), the ไพรูเวต ฟอร์เมต ไลเอส activating enzyme pfiD pSacB_delta_ pflD
(SEQ ID No: 16), the ไพรูเวต ฟอร์เมต ไลเอส activating enzyme pflA, pSacB_delta_ pflA


PF 75583
18
(SEQ ID No: 17) and the phosphoenolไพรูเวต craboxylase pSacB_delta_ pckA (SEQ ID No: 18) were constructed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หรือ flotation เป็น เครื่องมือการ การกู้คืนสูงสุดผลิตภัณฑ์มูลค่า ซักผ้าของชีวมวลมักจะเป็นแนะนำ ตัวอย่างในรูปแบบของ diafiltration การเลือกวิธีการจะขึ้นเนื้อหาของชีวมวลในซุปหมักและคุณสมบัติของชีวมวล และการโต้ตอบของชีวมวลที่ มีสารประกอบอินทรีย์ (e. ผลิตภัณฑ์ของค่า) ในหนึ่งรุรุ ซุปหมักสามารถ sterilized หรือ pasteurized ในลื่นเพิ่มเติมเป็น 5 ซุปหมักได้เข้มข้น ขึ้นอยู่กับความต้องการ ความเข้มข้นนี้สามารถทำชุดฉลาด หรืออย่างต่อเนื่องได้ ความดันและอุณหภูมิ ควรเลือกช่วงที่แรก ไม่มีความเสียหายของสินค้าเกิดขึ้น และประการที่สองน้อย จำเป็นต้องใช้เครื่องมือและพลังงาน เลือกฝีมือของความดัน และ ระดับอุณหภูมิการระเหย multistage ในการช่วยประหยัดพลังงาน 10การกู้คืนการฟอกเพิ่มเติมประกอบรวมด้วยเพิ่มเติมขั้นตอนในการเพิ่มเติมบริสุทธิ์อะลานีนที่พฤษภาคม ถ้า ไร อะลานีนจะถูกแปลงเป็นผลิตภัณฑ์อินทรีย์รอง โดยปฏิกิริยาทางเคมีตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ฟอกเพิ่มเติมของอะลานีน ขึ้นอยู่กับการชนิดของปฏิกิริยาและปฏิกิริยาเงื่อนไข ไม่จำเป็นต้อง สามารถเป็นวิธีที่รู้จักบุคคลผู้เชี่ยวชาญในศิลปะฟอกของอะลานีน 15 ที่ได้รับในกระบวนการขั้นตอนที่สอง) ใช้ สำหรับตัวอย่างตกผลึก กรอง electrodialysis และ chromatography ที่ แก้ปัญหาได้อาจจะเพิ่มเติมบริสุทธิ์โดยใช้วิธี chromatography แลกเปลี่ยนไอออนใน สั่งเอากันไม่เหลือ20 ตามศูนย์รวมแห่งการตามการประดิษฐ์นี้ที่ต้องการประมวลการประกอบรวมด้วยกระบวนการขั้นตอนเพิ่มเติม:อะลานีนแปลง III) ที่มีอยู่ในซุปหมักได้ในขั้นตอนของกระบวนการฉัน) หรือแปลงของสารประกอบอินทรีย์ถูกกู้คืนได้ในกระบวนการขั้นตอน II) เป็นการ25 รองอินทรีย์ผลิตภัณฑ์แตกต่างจากสารประกอบอินทรีย์โดยอย่างน้อยหนึ่งปฏิกิริยาเคมีขณะนี้มีอธิบายการประดิษฐ์ที่ละเอียดด้วยความช่วยเหลือของตัวเลขและตัวอย่างไม่จำกัด30รูปที่ 1 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacBรูปที่ 2 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB alaD35 รูป 3 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB AldhAรูปที่ 4 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ pSacB plasmid Apf/dรูปที่ 5 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB ApfiA 40รูปที่ 6 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB ApckA PF 7558317ตัวอย่างตัวอย่างที่ 1: วิธีการทั่วไปสำหรับการเปลี่ยนแปลงของ Basfia succiniciproducensต้องใช้ไวด์ไทป์ DD1 (ฝาก DSM18541) AldhA AptID DD1 (DD3)AlaD DD1 AldhA ApflD (DD3 alaD)AlaD DD1 AldhA ApfID ApckA (DD3 ApckA alaD)ตาราง 5 1: ระบบการตั้งชื่อของ DD1 ไวด์ไทป์และสายพันธุ์อ้างอิงถึงในตัวอย่างBasfia succiniciproducens DD1 (ไวด์ไทป์) ถูกแปลงกับดีเอ็นเอ โดย electroporation ที่ใช้โพรโทคอลต่อไปนี้:10 การจัดเตรียม DD1 วัฒนธรรมก่อนถูก inoculated จากหุ้นแช่แข็งใน BHI (สมอง 40 mlห้องคอนกรีต Becton สัน และบริษัท) ใน 100 ml เขย่าหนาว ทำการบ่มข้ามคืนที่ 37° C 200 รอบต่อนาที การจัดเตรียม วัฒนธรรมหลัก 100 มล BHI ไว้ใน 250 nil สั่นหนาว และ inoculated ไป OD ที่สุดท้าย (600 nm) ของ 0.2 กับก่อนวัฒนธรรม ทำบ่มที่ 37° C, 200 rpm เซลล์มีการเก็บเกี่ยวที่มี OD 15 เม็ดประมาณ 0.5, 0.6 และ 0.7 ถูกล้างครั้งเดียว ด้วย 10% กลีเซอรเย็นที่ 4° C และ การหยุดชั่วคราวใน 2 ml 10% กลีเซอร (4 ° C)100 pl เซลล์อำนาจถูกผสมกับ pg 2-8 ดีเอ็นเอ และเก็บไว้ในน้ำแข็ง 2 นาทีในการ electroporation cuvette กว้างของ 0.2 cm. Electroporation ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ 20:400 0 25 pF 2.5 kV (ยีน Pulser, Bio Rad) เพิ่ม 1 ml ของ BHI เย็น ทันทีหลังจาก electroporation และคณะทันตแพทยศาสตร์ดำเนินการประมาณ 2 h ที่ 37 องศาเซลเซียสชุบใน BHI กับ chloramphenicol 5 mg/L และ incubated เซลล์สำหรับ d 2-5 ที่ 37° C จนถึง 25 อาณานิคมของ ทรานสฟอร์แมนต์s ถูกมองเห็น แยกต่างหาก และ restreaked บนโคลน BHI ด้วย 5 มิลลิกรัม / ฉัน chloramphenicol จนบริสุทธิ์ของโคลนได้รับการตัวอย่างที่ 2: การสร้างโครงสร้างการลบPlasmids กลายพันธุ์/ลบ 30 ถูกสร้างตาม pSacB เวกเตอร์ (ลำดับ ID ไม่: 13)รูปที่ 1 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB 5' -และ 3 - flanking ภูมิภาค (โดยแต่ละประมาณ 1500) ของส่วนของโครโมโซม ซึ่งควรถูกลบถูกขยาย โดย PCR จากของโครโมโซม DNA Basfia succiniciproducens และนำเข้าสู่เวกเตอร์ดังกล่าวใช้เทคนิคมาตรฐาน โดยปกติ อย่างน้อย 80% ของ ORF มีเป้าหมายสำหรับการลบ 35 ในลักษณะ plasmids ลบสำหรับ lactate ดีไฮโดรจีเนส /dhA, pSacB_delta_/ดี เอชเอ (ไม่มีลำดับ ID: 15), ไลเอสฟอร์เมตไพรูเวตที่เปิดใช้งานเอนไซม์ pfiD pSacB_delta_ pflD (ไม่มีลำดับ ID: 16), ไลเอสฟอร์เมตไพรูเวตที่เปิดใช้งานเอนไซม์ pflA, pSacB_delta_ pflA PF 7558318(ลำดับ ID ไม่: 17) และ phosphoenolไพรูเวต craboxylase pSacB_delta_ pckA (ลำดับ ID ไม่: 18) ถูกสร้างขึ้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หรือลอยอุปกรณ์ สำหรับการกู้คืนสูงสุดของผลิตภัณฑ์ของค่าซักผ้าชีวมวลมักจะแนะนำให้เลือกตัวอย่างเช่นในรูปแบบของ diafiltration ที่
การเลือกวิธีการขึ้นอยู่กับเนื้อหาชีวมวลในน้ำหมักและคุณสมบัติของชีวมวลและยังทำงานร่วมกันของชีวมวลที่มีสารประกอบอินทรีย์ (จ.
ผลิตภัณฑ์ของค่า) ในหนึ่งรุรุ, น้ำหมักที่สามารถฆ่าเชื้อหรือพาสเจอร์ไรส์ ใน 5 ศูนย์รวมต่อน้ำหมักมีความเข้มข้น ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับความต้องการ,
ความเข้มข้นนี้สามารถทำได้หรือชุดที่ชาญฉลาดอย่างต่อเนื่อง ความดันและอุณหภูมิช่วงควรจะเลือกดังกล่าวที่ตอนแรกไม่มีความเสียหายของผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นและน้อยที่สุดประการที่สองการใช้งานของเครื่องมือและพลังงานเป็นสิ่งที่จำเป็น การเลือกและทักษะความชำนาญของความดันและระดับอุณหภูมิสำหรับการระเหยแบบหลายขั้นตอนโดยเฉพาะอย่างยิ่งจะช่วยให้ประหยัดพลังงาน. 10 กระบวนการกู้คืนต่อไปอาจจะประกอบรวมด้วยขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมในอะลานีนซึ่งเป็นบริสุทธิ์ต่อไป แต่ถ้าอะลานีนจะถูกแปลงเป็นผลิตภัณฑ์อินทรีย์รองจากปฏิกิริยาทางเคมีตามที่อธิบายไว้ด้านล่างบริสุทธิ์ต่อไปของอะลานีนเป็นขึ้นอยู่กับชนิดของปฏิกิริยาและสภาพการเกิดปฏิกิริยาที่ไม่จำเป็นต้อง สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ 15 อะลานีนที่ได้รับในขั้นตอนที่สอง) วิธีการที่เป็นที่รู้จักกันกับคนที่มีฝีมือในงานศิลปะที่สามารถนำมาใช้เป็นเช่นตกผลึกกรองelectrodialysis และโค แก้ปัญหาที่เกิดอาจจะบริสุทธิ์ต่อไปโดยวิธีการของโคแลกเปลี่ยนไอออนในการลบไอออนที่เหลือที่ไม่พึงประสงค์. 20 ตามที่ศูนย์รวมที่ต้องการของกระบวนการตามการประดิษฐ์นี้กระบวนการต่อไปประกอบรวมด้วยขั้นตอนกระบวนการ: III) อะลานีนแปลง ที่มีอยู่ในน้ำหมักที่ได้รับในขั้นตอนที่หนึ่ง) หรือการเปลี่ยนแปลงของสารประกอบอินทรีย์กู้คืนได้รับในขั้นตอนที่สอง) เป็น25 ผลิตภัณฑ์อินทรีย์รองแตกต่างจากสารอินทรีย์โดยอย่างน้อยหนึ่งปฏิกิริยาทางเคมี. การประดิษฐ์จะมีการอธิบายในตอนนี้ รายละเอียดด้วยความช่วยเหลือของตัวเลขและตัวอย่างที่ไม่ จำกัด . 30 รูปที่ 1 แสดงแผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB. รูปที่ 2 แสดงแผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB alaD. 35 รูปที่ 3 แสดงแผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB AldhA. รูปที่ 4 แสดงให้เห็นว่า . แผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB APF / D รูปที่ 5 แสดงให้เห็นแผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB ApfiA 40. รูปที่ 6 แสดงให้เห็นแผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB ApckA PF 75583 17 ตัวอย่างตัวอย่างที่ 1: วิธีการทั่วไปสำหรับการเปลี่ยนแปลงของ Basfia succiniciproducens สายพันธุ์ไวด์ไทป์ DD1 (เงินฝาก DSM18541) DD1 AldhA AptID (DD3) DD1 AldhA ApflD alaD (DD3 alaD) DD1 AldhA ApfID ApckA alaD (DD3 ApckA alaD) 5 ตารางที่ 1: การตั้งชื่อของ DD1- ไวด์ไทป์กลายพันธุ์และการอ้างถึงใน ตัวอย่างBasfia succiniciproducens DD1 (ไวด์ไทป์) ถูกเปลี่ยนกับดีเอ็นเอโดย electroporation ใช้โปรโตคอลต่อไปนี้: 10 สำหรับการเตรียมความพร้อมวัฒนธรรมก่อน DD1 ได้รับเชื้อจากสต็อกลงไปแช่แข็ง 40 มล. BHI (สมองแช่หัวใจ Becton ดิกคินสันและ บริษัท ) 100 ml เขย่าขวด บ่มเพาะได้ดำเนินการไปคืนที่ 37 ° C; 200 รอบต่อนาที สำหรับการจัดทำหลักวัฒนธรรม 100 มล. BHI ถูกวางไว้ในขวดสั่นศูนย์ 250 และเชื้อไป OD สุดท้าย (600 นาโนเมตร) 0.2 ก่อนกับวัฒนธรรม ได้ดำเนินการบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C, 200 รอบต่อนาที เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวที่ OD 15 ประมาณ 0.5, 0.6 และ 0.7 เม็ดได้รับการล้างครั้งเดียว 10% กลีเซอรีนเย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน2 มล. กลีเซอรีน 10% (4 ° C). 100 พีของเซลล์ที่มีความสามารถ ได้รับการผสมกับดีเอ็นเอ 2-8 หน้าและเก็บไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 2 นาทีในcuvette electroporation ที่มีความกว้าง 0.2 เซนติเมตร Electroporation ภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้ 20 400 0; 25 pF; 2.5 กิโลโวลต์ (ยีน pulser, Bio-Rad) 1 มิลลิลิตร BHI แช่เย็นถูกเพิ่มเข้ามาในทันทีหลังจากที่electroporation และได้ดำเนินการฟักตัวประมาณ 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียส. เซลล์ที่ถูกชุบใน BHI 5 mg / L chloramphenicol และบ่มเป็นเวลา 2-5 วันที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสจนถึงวันที่ 25 อาณานิคมของ ทรานสฟอร์แมนต์ s ได้เห็น โคลนนิ่งถูกแยกและ restreaked บนBHI 5 มก. / I chloramphenicol จนมีความบริสุทธิ์ของโคลนที่ได้รับ. ตัวอย่างที่ 2: การสร้างการลบสร้าง30 กลายพันธุ์ / ลบพลาสมิดถูกสร้างขึ้นบนพื้นฐานของ pSacB เวกเตอร์ (SEQ ID NO: 13). รูปที่ 1 แสดงให้เห็นว่า แผนที่แผนผังของพลาสมิด pSacB 5'- และ 3'- ภูมิภาคขนาบข้าง (ประมาณ. 1500 โดยในแต่ละ) ของชิ้นส่วนของโครโมโซมซึ่งควรจะถูกลบถูกขยายโดยวิธี PCR จากดีเอ็นเอของโครโมโซม succiniciproducens Basfia และนำเข้าสู่เวกเตอร์กล่าวว่าการใช้เทคนิคมาตรฐาน โดยปกติแล้วอย่างน้อย 80% ของ ORF เป็นเป้าหมายสำหรับการลบ 35 วิธีดังกล่าวพลาสมิดลบสำหรับแลคเตทดีไฮโดรจีเนส / ดีเอชเอ, pSacB_delta_ / ดีเอชเอ(SEQ ID NO: 15) ที่ไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสเปิดใช้เอนไซม์ pfiD pSacB_delta_ pflD (SEQ ID No: 16) ที่ไพรูเวตฟอร์เมตไลเอสเปิดใช้เอนไซม์ pflA, pSacB_delta_ pflA PF 75583 18 (SEQ ID No: 17) และ phosphoenol ไพรูเวต craboxylase pSacB_delta_ pckA (SEQ ID No: 18) ถูกสร้างขึ้น