Examination of some immune genes re

Examination of some immune genes response of probiotic fed fish against bacterial infection:
RNA extraction from tissue:
Total RNA was extracted from livers of fish and then was purified using a spin column kit purchased from
Fermentas life science Co. (Invitrogen Corporation) (Van Allen Way, Carlsbad, Canada) according to the
manufacturer’s instructions. RNA samples were treated with DNase I (Ambion, UK) to remove contaminating
genomic DNA and repurified by spin column. Then RNA samples were stored in –80 o C until the process of
reverse-transcriptase.
SMART cDNA synthesis:
Two μg RNA was reverse transcribed with Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit™ was purchased
from Fermentas life science Co. (Invitrogen Corporation) Van Allen Way, Carlsbad, Canada using
hexanucleotides and used as templates for Real-time PCR.
Quantitation of IL6 and TNF- α by Real-time PCR:
Real-time PCR were performed by methods described previously (Zhang et al., 2008). Amplification and
quantification of cDNA were performed in the Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR, The 18S rRNA
served as an internal control for normalization. Each sample was run in triplicate and mean values were
reported. Normalized gene expression values were obtained using Light Cycler Relative Quantification
software. Relative gene copy numbers were derived using the formula 2ΔCT where ΔCT is the difference in
amplification cycles required to detect amplification product from equal starting concentrations of fish liver
RNA.
To compare the accuracy of efficiency-corrected relative quantification, amplification efficiency was
derived from standard curves. All standard curves for IL6, TNF-α and 18sRNA were linear over five or six
orders of magnitude with the linear correlation coefficients higher than 0.99. The amplification efficiency for
IL6, TNF-α and 18sRNA were between 98 and 104% and the difference between target and internal control
genes was5%. The 18sRNA gene was used as internal control gene.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตรวจสอบการตอบสนองบางยีนภูมิคุ้มกันของโปรไบโอติกส์เลี้ยงปลากับเชื้อ:อาร์เอ็นเอสกัดจากเนื้อเยื่อ:อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจาก livers ปลาแล้ว ที่บริสุทธิ์ใช้ชุดคอลัมน์หมุนซื้อจากFermentas วิทยาศาสตร์ Co. (Invitrogen Corporation) (แวนอัลเลนวิธี คาร์ลส แคนาดา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่างของอาร์เอ็นเอได้รับการรักษากับ DNase ฉัน (Ambion, UK) เอาขยะgenomic DNA และ repurified โดยคอลัมน์หมุน แล้วอาร์เอ็นเอตัวอย่างถูกเก็บไว้ใน –80 o C จนถึงกระบวนการย้อนกลับ-transcriptaseการสังเคราะห์ cDNA สมาร์ท:อาร์เอ็นเอสอง μg ถูกย้อนทับศัพท์กับร้าน™ชุดสังเคราะห์ cDNA แปลงกลับสแตรนด์แรกช่วยจาก Fermentas วิทยาศาสตร์ (Invitrogen Corporation) บริษัทใช้วิธีแวนอัลเลน คาร์ลส ประเทศแคนาดาhexanucleotides และใช้เป็นแม่แบบสำหรับ Real-time PCRการวิเคราะห์หาปริมาณของ IL6 และ TNF ด้วยกองทัพ โดย PCR แบบเรียลไทม์:PCR แบบเรียลไทม์ได้ดำเนินการ โดยวิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Zhang et al., 2008) ขยาย และนับของ cDNA ถูกดำเนินการในการใช้ Biosystems 7300 Real-Time PCR, 18S rRNAทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมภายในสำหรับฟื้นฟู แต่ละตัวอย่างถูกรันใน triplicate และมีค่าเฉลี่ยรายงาน ค่านิพจน์ยีนมาตรฐานได้รับการใช้ไฟ Cycler นับญาติซอฟต์แวร์ หมายเลขสำเนายีนญาติได้มาใช้ 2ΔCT สูตรที่ ΔCT ความแตกต่างในวงจรขยายที่จำเป็นในการตรวจสอบผลิตภัณฑ์ขยายจากความเข้มข้นเริ่มต้นเท่ากับของตับปลาอาร์เอ็นเอการเปรียบเทียบความถูกต้องของแก้ไขประสิทธิภาพนับญาติ มีประสิทธิภาพในการขยายมาจากเส้นโค้งมาตรฐาน มีเส้นโค้งทั้งหมดมาตรฐาน IL6, TNF ด้วยกองทัพ และ 18sRNA กว่าห้าหรือหกอันดับของขนาดกับความสัมพันธ์ของสัมประสิทธิ์เชิงเส้นสูงกว่า 0.99 ขยายประสิทธิภาพในIL6, TNF ด้วยกองทัพ และ 18sRNA ได้ระหว่าง 98 และ 104% ความแตกต่างระหว่างเป้าหมายและการควบคุมภายในยีน was5% มีใช้ยีน 18sRNA เป็นยีนควบคุมภายใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจสอบการตอบสนองของยีนภูมิคุ้มกันของปลาที่เลี้ยงโปรไบโอติกกับการติดเชื้อแบคทีเรีย:
การสกัดอาร์เอ็นเอจากเนื้อเยื่อ:
รวม RNA
ถูกสกัดจากตับของปลาแล้วบริสุทธิ์โดยใช้ชุดคอลัมน์หมุนที่ซื้อมาจากชีวิตวิทยาศาสตร์Fermentas จำกัด (Invitrogen คอร์ปอเรชั่น) (แวนอัลเลน ทางคาร์ลส, แคนาดา)
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่างอาร์เอ็นเอได้รับการรักษาด้วย DNase ฉัน (Ambion สหราชอาณาจักร)
เพื่อลบปนเปื้อนดีเอ็นเอและrepurified ตามคอลัมน์หมุน จากนั้นกลุ่มตัวอย่าง RNA ที่ถูกเก็บไว้ใน -80
องศาเซลเซียสจนกว่ากระบวนการของย้อนกลับtranscriptase.
การสังเคราะห์ยีนสมาร์ท:
สองไมโครกรัมอาร์เอ็นเอได้รับการถ่ายทอดกลับมี Revert ปฐมพยาบาล Strand
ยีนสังเคราะห์ชุด™ถูกซื้อจากชีวิตวิทยาศาสตร์Fermentas จำกัด (Invitrogen คอร์ปอเรชั่น) รถตู้ ทางอัลเลน, คาร์ลส, แคนาดาใช้
hexanucleotides และใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR แบบ Real-time.
ปริมาณ IL6 และ TNF- αโดยวิธี PCR แบบ Real-time:
(. Zhang et al, 2008) แบบ Real-time PCR ได้ดำเนินการโดยวิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้า และการขยายปริมาณของยีนได้ดำเนินการในแอพพลายด์ 7300 PCR แบบ Real-Time, The 18S rRNA ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมภายในสำหรับการฟื้นฟู ตัวอย่างแต่ละคนได้ทำงานในเพิ่มขึ้นสามเท่าและค่าเฉลี่ยค่าถูกรายงาน ปกติค่าการแสดงออกของยีนที่ได้รับโดยใช้แสง Cycler ปริมาณสัมพัทธ์ซอฟแวร์ สำเนายีนญาติตัวเลขที่ได้มาใช้2ΔCTสูตรที่ΔCTคือความแตกต่างในวงจรขยายที่จำเป็นในการตรวจสอบสินค้าที่ขยายจากความเข้มข้นเริ่มต้นเท่ากับตับปลาอาร์เอ็นเอ. เพื่อเปรียบเทียบความถูกต้องของประสิทธิภาพการแก้ไขปริมาณญาติที่มีประสิทธิภาพขยายได้มาจากเส้นโค้งมาตรฐาน. เส้นโค้งทุกมาตรฐาน IL6, TNF-αและ 18sRNA เป็นเชิงเส้นในช่วงห้าหรือหกคำสั่งของขนาดที่มีความสัมพันธ์เชิงเส้นค่าสัมประสิทธิ์สูงกว่า0.99 ประสิทธิภาพการใช้เครื่องขยายเสียงสำหรับIL6, TNF-αและ 18sRNA อยู่ระหว่าง 98 และ 104% และความแตกต่างระหว่างเป้าหมายและการควบคุมภายในยีนถูก 5% ยีน 18sRNA ถูกใช้เป็นยีนควบคุมภายใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การตรวจสอบของการตอบสนองของภูมิคุ้มกันบางยีนโปรไบโอติกเลี้ยงปลาต่อการติดเชื้อแบคทีเรีย :
การสกัด DNA จากเนื้อเยื่อ :
อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากตับของปลา จากนั้นก็บริสุทธิ์ใช้คอลัมน์หมุนชุดซื้อจาก
fermentas ชีวิตวิทยาศาสตร์ Co . ( Invitrogen Corporation ) ( Van Allen , คาร์ลสแบด , แคนาดา ) ตามคำสั่ง
คือ ผู้ผลิตตัวอย่าง RNA ได้รับการรักษาด้วยการตรวจหา ADNase ผม ( ambion , UK ) เพื่อลบปนเปื้อน
genomic DNA repurified คอลัมน์และหมุน แล้วตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่ถูกเก็บไว้ใน– 80 o C จนถึงขั้นตอน reverse transcriptase
.
การสังเคราะห์ cDNA สมาร์ท :
2 G ก็กลับμ RNA และมีสาระกลับปฐมยีนสังเคราะห์ชุด™ซื้อ
จาก fermentas ชีวิตวิทยาศาสตร์ Co . ( Invitrogen Corporation ) แวนอัลเลน ,คาร์ลสแบด , แคนาดาใช้
hexanucleotides และใช้เป็นแม่แบบสำหรับเวลาจริงซึ่ง
เซลล์ของ il6 และ TNF - αโดยเวลาจริงและเวลาจริง :
) แสดงโดยวิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Zhang et al . , 2008 ) การเพิ่มปริมาณ cDNA และ
มีการปฏิบัติใน Applied Biosystems 7300 เวลา PCR จริง , 18S rRNA
ในฐานะที่เป็นระบบควบคุมภายในสำหรับการฟื้นฟู . "แต่ละตัวอย่างถูกเรียกทั้งสามใบและหมายถึงค่า
รายงาน ปกติยีนค่าได้โดยใช้วงจรแสงเทียบปริมาณ
ซอฟต์แวร์ จำนวนสำเนาของยีนญาติได้โดยใช้สูตร 2 Δ CT ที่Δ CT คือความแตกต่างใน
( รอบต้องตรวจสอบผลิตภัณฑ์ ( เท่ากับเริ่มจากความเข้มข้นของ RNA ตับ

ปลาเพื่อเปรียบเทียบความถูกต้องของประสิทธิภาพการแก้ไขปริมาณสัมพัทธ์ ประสิทธิภาพ ( คือ
ได้มาจากเส้นโค้งมาตรฐาน เส้นโค้งมาตรฐานสำหรับ il6 TNF - α 18srna , และเป็นเชิงเส้นมากกว่า ห้า หรือ หก
อันดับของขนาดกับเชิงเส้นสหสัมพันธ์สูงกว่า 0.99 . ประสิทธิภาพ ( สำหรับ il6
,และ TNF - α 18srna อายุ 98 และ 104% และความแตกต่างระหว่างเป้าหมายและยีนที่ควบคุม
ภายในเป็น 5% การ 18srna ยีนถูกใช้เป็นยีนควบคุมภายใน