Development of an enzyme-linked imm

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the monitoring and surveillance of antibodies to porcine epidemic diarrhea virus based on a recombinant membrane protein

Jing-Hui Fan, Yu-Zhu Zuo, , Xiao-Qiang Shen, Wen-Yuan Gu, Jing-Mei Di
Show more
doi:10.1016/j.jviromet.2015.07.021
Get rights and content
Highlights
•
Expressed membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus in Escherichia coli.
•
An indirect ELISA was developed using purified recombinant M protein as detection antigen.
•
Assessing fit for immunologic surveillance and sero-diagnosis of PEDV.
•
The developed iELISA is specific, sensitive and does not require PEDV cultivation.
•
This iELISA could be used for large-scale serological testing.
Abstract
The recent dramatic increase in reported cases of porcine epidemic diarrhea (PED) in pig farms is a potential threat to the global swine industry. Therefore, the accurate diagnosis, serological monitoring, and surveillance of specific antibodies in pigs resulting from porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection or vaccination would be essential in helping to control the spread of PED. We developed and validated an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on the recombinant membrane (M) protein of PEDV. To detect PEDV antibodies in eight herds, 382 serum samples were collected from sows that had been immunized with a PED vaccine, and screened using the developed ELISA in parallel with a serum neutralization (SN) assay. Of the tested samples, 276 were positive for the presence of PEDV antibodies according to both assays, while 98 were negative. An excellent agreement between the ELISA and the SN assay was observed (kappa = 0.947; 95% confidence interval = 0.910–0.984; McNemar's test, P = 0.727). No cross-reaction was detected for the developed ELISA with other coronaviruses or other common pig pathogens. The developed ELISA could be used for serological evaluation and indirect diagnosis of PED infection.

Keywords
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV); M protein; ELISA; Serum antibodies
1. Introduction
Porcine epidemic diarrhea (PED) is a devastating swine disease and its etiological agent is PED virus (PEDV). Porcine epidemic diarrhea is characterized by watery diarrhea, dehydration, and a high death rate among suckling pigs (Pensaert and DeBouck, 1978). The disease was first documented in the United Kingdom in 1971 as a swine disease that resembled transmissible gastroenteritis (Oldham, 1972). Outbreaks of PED have since been reported in Europe, Asia, and North America (Nagy et al., 1996, Takahashi et al., 1983, Sun et al., 2011, Fan et al., 2012 and Stevenson et al., 2013). Porcine epidemic diarrhea virus has spread rapidly across the United States, resulting in the high mortality of piglets, and substantial economic losses (Cima, 2013). Its recent emergence in North America suggests that this virus is a threat to the swine industry worldwide. Accurate diagnosis and serological detection of specific antibodies in pigs as a result of PEDV infection or vaccination are required to control the spread of PED.

Porcine epidemic diarrhea virus is a coronavirus within the Coronaviridae family. The genome of PEDV contains genes encoding spike (S), membrane (M), small membrane (sM), open reading frame 3, and nucleocapsid (N) proteins ( Park et al., 2011). The M protein is a structural membrane glycoprotein, and the most abundant of all the envelope proteins. It has a short amino-terminal domain that exists outside of the virion, with the long carboxy-terminal domain of the protein present inside the virion ( Utiger et al., 1995). Immune reactions to the M protein of coronaviruses play an important role in the induction of protection, and in mediating the course of the disease ( Fleming et al., 1989 and Vennema et al., 1991). The nucleotide sequence of the PEDV M gene exhibits low homology (around 50%) with the M gene of other coronaviruses; however, its sequence is highly conserved among different PEDV strains ( Kim and Chae, 2000 and Arndt et al., 2010). Therefore, the M protein could be a suitable candidate for the detection of PEDV-specific antibodies and in diagnosing PEDV infections.

Many enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have been developed for the detection of antibodies against PEDV. However, the preparation of an appropriate antigen for most of these methods requires cultivation of PEDV, which is time consuming and expensive. In the current study, we expressed and purified the M protein of PEDV. The purified form of the recombinant M protein was used as a coating antigen in an indirect ELISA that we developed. We then screened serum samples from pigs to determine the presence of antibodies specific for the PEDV M protein.

2. Materials and methods
2.1. Serum samples

We collected 36 blood samples from healthy unvaccinated PEDV-free pigs of various ages. The sera derived from these samples were negative for the presence of antibodies against PEDV according to serum neutralization (SN) assays (SN titers

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พัฒนาการวิเคราะห์เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent สำหรับตรวจสอบและเฝ้าระวังของการใช้โปรตีนเมมเบรน recombinant ไวรัสโรคท้องร่วงเรื้อรังช่วงที่แอนตี้แฟนจิงฮุย ยูซูซูยูเก ธีม,, เกวียงเสี่ยวเฉิน กูหยวนเหวิน เหมยจิงดิ ดูเพิ่มเติมdoi:10.1016/j.jviromet.2015.07.021ได้รับสิทธิและเนื้อหาไฮไลท์•แสดงเยื่อโปรตีนของไวรัสในช่วงโรคท้องร่วงเรื้อรังใน Escherichia coli•การ ELISA อ้อมถูกพัฒนาโดยใช้โปรตีนบริสุทธิ์วททช M เป็นตรวจตรวจหา•ประเมินได้พอดีกับการเฝ้าระวัง immunologic sero การวินิจฉัยของ PEDV•IELISA พัฒนาโดยเฉพาะ มีความสำคัญ และจำเป็นต้องเพาะปลูก PEDV•IELISA นี้สามารถใช้สำหรับการทดสอบสภาวะขนาดใหญ่บทคัดย่อเพิ่มรายงานกรณีช่วงเรื้อรังท้องเสีย (PED) ในฟาร์มสุกรอย่างล่าสุดเป็นศักยภาพอุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก ดังนั้น การวินิจฉัย ชุกตรวจสอบ การเฝ้าระวังของแอนตี้เฉพาะในสุกรที่เกิดจากเชื้อไวรัส (PEDV) ช่วงโรคท้องร่วงเรื้อรังหรือวัคซีนจะได้จำเป็นในการช่วยควบคุมการแพร่กระจายของ PED เราพัฒนา และตรวจสอบการทดสอบ immunosorbent เอนไซม์ลิงค์ทางอ้อม (ELISA) ตามโปรตีนเมมเบรน recombinant (M) ของ PEDV การตรวจหาแอนตี้ PEDV ในฝูงแปด เซรั่ม 382 ตัวอย่างถูกเก็บรวบรวมจาก sows ที่มีถูก immunized กับ PED เป็น วัคซีน และสกรีนโดยใช้ ELISA ที่พัฒนาควบคู่กับเซรั่มที่เป็นกลาง (SN) assay ตัวอย่างทดสอบ 276 ได้ค่าบวกสำหรับสถานะของแอนตี้ PEDV ตามทั้ง assays ขณะที่ 98 ลบ แห่งข้อตกลงระหว่าง ELISA การทดสอบ SN ถูกสังเกต (กัปปะ = 0.947 ช่วงความเชื่อมั่น 95% = 0.910-0.984 การทดสอบของ McNemar, P = 0.727) Cross-reaction ไม่พบสำหรับ ELISA ที่พัฒนากับ coronaviruses อื่น ๆ หรือโรคอื่น ๆ หมูทั่วไป สามารถใช้ ELISA ที่พัฒนาสำหรับการประเมินสภาวะและการวินิจฉัยทางอ้อมติดเป็ดคำสำคัญโรคท้องร่วงเรื้อรังช่วงไวรัส (PEDV); โปรตีน M ELISA เซรั่มแอนตี้1. บทนำช่วงท้องเสียเรื้อรัง (PED) เป็นเรื่องโรคสุกร และเป็ดไวรัส (PEDV) เป็นตัวแทนของ etiological โรคท้องร่วงเรื้อรังช่วงเป็นลักษณะท้องเสียแฉะ คายน้ำ และอัตราการตายสูงระหว่างหันสุกร (Pensaert และ DeBouck, 1978) โรคถูกต้องเอกสารในสหราชอาณาจักรในปี 1971 เป็นโรคสุกรที่คล้ายกับโรคกระเพาะอักเสบ transmissible (Oldham, 1972) ตั้งแต่มีการรายงานของ PED ระบาด ในยุโรป เอเชีย อเมริกาเหนือ (Nagy et al., 1996 ทะกะฮะชิ et al., 1983, al. ร้อยเอ็ดอาทิตย์ 2011 พัดลมสตีเวนสันและ al. และ et al., 2012 2013) โรคท้องร่วงเรื้อรังช่วงไวรัสมีแพร่กระจายอย่างรวดเร็วทั่วสหรัฐอเมริกา ในการตายสูงทรูด และสูญเสียทางเศรษฐกิจพบ (ซีม่า 2013) ที่เกิดขึ้นในอเมริกาแนะนำว่า ไวรัสนี้เป็นภัยคุกคามต่ออุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก การวินิจฉัยและตรวจสอบสภาวะของแอนตี้เฉพาะในสุกรจากการติดเชื้อ PEDV หรือวัคซีนจำเป็นต้องควบคุมการแพร่กระจายของ PEDไวรัสโรคท้องร่วงเรื้อรังช่วงเป็น coronavirus ภายในครอบครัว Coronaviridae กลุ่มของ PEDV ประกอบด้วยยีนเข้าสไปค์ (S), เมมเบรน (M), เมมเบรนขนาดเล็ก (sM), เปิดอ่านเฟรมที่ 3 และโปรตีนดโปรตีน (N) (สวนร้อยเอ็ด al., 2011) โปรตีน M เป็นไกลโคโปรตีนมีโครงสร้างเมมเบรน และอุดมสมบูรณ์มากสุดโปรตีนซองจดหมายทั้งหมด มีโดเมนสั้น ๆ อะมิโนเทอร์มินัลที่มีอยู่ภายนอก virion กับโดนัล carboxy ยาวของโปรตีนที่อยู่ภายใน virion (Utiger และ al., 1995) ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันกับโปรตีน M coronaviruses ของเล่นมีบทบาทสำคัญ ในการเหนี่ยวนำการป้องกัน และเป็นสื่อกลางของโรค (al. et เฟลมิง 1989 และ Vennema et al., 1991) ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน PEDV M จัดแสดง homology ต่ำ (ประมาณ 50%) กับยีน M ของ coronaviruses อื่น ๆ อย่างไรก็ตาม ลำดับความเป็นสูงอยู่ระหว่างสายพันธุ์ PEDV ต่าง ๆ (คิม และ แจ้ 2000 และ Arndt et al., 2010) ดังนั้น โปรตีน M อาจเป็นผู้สมัครที่เหมาะสมสำหรับการตรวจหาแอนตี้ PEDV เฉพาะ และ ในการวินิจฉัยการติดเชื้อ PEDVหลายลิงค์เอนไซม์ immunosorbent assays (ELISAs) ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจพบแอนตี้กับ PEDV อย่างไรก็ตาม การเตรียมการตรวจหาความเหมาะสมของวิธีการเหล่านี้ต้องเพาะปลูกของ PEDV ซึ่งเป็นเวลานาน และมีราคาแพง ในการศึกษาปัจจุบัน เราแสดง และบริสุทธิ์โปรตีน M ของ PEDV วททชโปรตีน M แบบบริสุทธิ์ถูกใช้เป็นการตรวจหาเคลือบในการ ELISA อ้อมที่เราพัฒนา เราแล้วฉายตัวอย่างซีรั่มจากสุกรเพื่อกำหนดสถานะของแอนตี้เฉพาะสำหรับโปรตีน PEDV M2. วัสดุและวิธีการ2.1. ตัวอย่างเซรั่มเราเก็บตัวอย่างเลือด 36 จากสุขภาพ unvaccinated PEDV ฟรีสุกรของวัยต่าง ๆ จะมาจากตัวอย่างเหล่านี้ถูกลบสำหรับสถานะของแอนตี้กับ PEDV ตาม assays เป็นกลาง (SN) เซรั่ม (SN titers < 1:2) จะจากตัวอย่างเลือด 20 มาจากสุกรติดเชื้อ PEDV ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงจะเป็นบวก (SN titers ≥1:16) สถานะการติดเชื้อ PEDV ของสุกรได้รับการยืนยัน โดยยีน PEDV M การกำหนดเป้าหมายกับอาร์เอ็นเอไวรัสที่สกัดจากตัวอย่าง fecal assays ปฏิกิริยาลูกโซ่ (RT-PCR) ของพอลิเมอเรส transcription ย้อน ช่วงจะประกอบด้วยแอนตี้กับโรคกระเพาะอักเสบ transmissible ไวรัส (TGEV SN titer 1:413), rotavirus ช่วง (PRV; 1:305), ช่วงสืบพันธุ์ และทางเดินหายใจกลุ่มอาการไวรัส (PRRSV; 1:376) circovirus ช่วง 2 (PCV-2, 1:317), และไวรัสไข้สุกรคลาสสิก (CSFV; 1:289) ได้รับมาจากมณฑลเหอเป่ย์ (ฉือเจียจวง สาธารณรัฐประชาชนจีน) การควบคุมและป้องกันโรค จำนวน 382 ซีรั่มตัวอย่างถูกเก็บรวบรวมจากฝูงหมู 8 ที่สัตว์เคยดูแลวัคซีน PEDV ตัวอย่างทั้งหมดได้ทดสอบ โดย ELISA อ้อมพัฒนา2.2. ไวรัสต้องใช้ไวรัสโรคท้องร่วงเรื้อรังช่วง BD HB (GenBank ทะเบียนเลข JF690777.1) ที่แยกได้จากอุจจาระของหมูจากมณฑลเหอเป่ย์จังหวัด ประเทศจีน และปรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ในทางเดินที่ 32 ในเซลล์ Vero2.3 การโคลน และลำดับเบสในยีน PEDV MViral RNA was extracted from PEDV using Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), following the manufacturer's instructions. The sequence corresponding to the M gene was amplified from viral RNA by RT-PCR using oligonucleotide primers MP1 (5′-GGA TCC ATG TCT AAC GGT-3′) and MP2 (5′-AAG CTT TCT GTT TAG ACT AAA T-3′). The resulting PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and purified using a Gel Extraction Mini Kit (Tiangen Biotech Co. Ltd., Beijing, China) according to the manufacturer's recommendations. Purified amplicons were cloned into the pMD18-T vector (Takara Biotech Co. Ltd., Dalian, China) to yield the recombinant plasmid pMD-M, which was then transformed into competent Escherichia coli JM109. Positive clones were selected according to their lacZ phenotype, and verified by restriction enzyme digestion, PCR screening, and DNA sequencing.2.4. Expression and purification of the PEDV M proteinThe M gene contained within pMD-M was subcloned into the prokaryotic expression vector pGEX-6P-1 (Sunbiotech Inc., Beijing, China) to yield pGEX-6P-M. The pGEX-6P-1 vector also contained a sequence for a GST tag, which was designed so as to be added at the amino terminal of the expressed protein. The pGEX-6P-M vector was verified by DNA sequencing. The recombinant M protein was transformed into E. coli BL21 (Tiangen Biotech Co. Ltd., Beijing, China). E. coli BL21 cells were cultured and transformed with pGEX-6P-M, in Luria-Bertani broth supplemented with 100 μg/mL ampicillin until the optical density at 600 nm (OD600) was 0.6–1.0, at which point protein expression was induced via the addition of 1.0 mM isopropyl-β-d-thio-galactopyranoside. At 5 h post-induction, bacterial cells were collected by centrifugation. The recombinant protein was purified from the bacterial lysate using a GST Fusion Protein Purification Kit (TransGen Biotech Co. Ltd., Beijing, China), according to the manufacturer's recommendations. Fractions of purified recombinant M protein were analyzed using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), with polyacrylamide gels stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. Expression of the recombinant M protein was confirmed by immunoblotting, using porcine PEDV antisera. The prokaryotic expression vector pGEX-6P-1 was also transformed into E. coli BL21 as a negative control.2.5. Western blottingFractions of purified recombinant proteins were separated by SDS-PAGE and electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). To prevent non-specific reactions, membranes were blocked with 5% (w/v) non-fat milk powder in Tris-buffered saline containing 0.05% (v/v) Tween 20 (TBST) at 37 °C for 2 h. Membranes were incubated with pig PEDV antisera (diluted 1:200) at 37 °C for 1 h. After three washes with TBST, membranes were incubated with an anti-pig IgG conjugated to horseradish peroxidase (HRP; Sigma–Aldrich, St Louis, MO, USA) at 37 °C for 1 h. We used 3,3′-diaminobenzidine (Sigma–Aldrich) for the development of color reactions to visualize protein bands.2.6. Indirect ELISAA checkerboard titration involving each combination of antigen (purified recombinant PEDV M protein) and sera was used to determine optimal dilutions for use in the indirect ELISA we developed. The antigen and serum were diluted from 30 to 0.938 μg/ml and 1:10 to 1:320 (two-fold dilution), respectively. Ninety six well plates (Nunc MaxiSorp, Denmark) were coated with the recombinant M protein, which was diluted in phosphate-buffered saline (PBS), and allowed the plates to incubate at 4 °C overnight. PBS was used as a blank control. Wells were blocked with 5% fetal bovine serum in PBS (pH 7.4) for 1 h at 37 °C. Wells were then washed

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การพัฒนาเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโนสำหรับการตรวจสอบและเฝ้าระวังของแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสโรคอุจจาระร่วงโรคระบาดหมูอยู่บนพื้นฐานของเยื่อหุ้มเซลล์โปรตีนรีคอมบิแนจิงฮุยพัดลม, Yu-Zhu Zuo, เสี่ยวเกวียงเฉินเหวินหยวน Gu, Jing-Mei Di แสดงมากขึ้นดอย: 10.1016 / j.jviromet.2015.07.021 รับสิทธิและเนื้อหาไฮไลท์•. แสดงโปรตีนเมมเบรนของเชื้อไวรัสโรคอุจจาระร่วงโรคระบาดในสุกรเชื้อ Escherichia coli •. ELISA ทางอ้อมได้รับการพัฒนาโดยใช้โปรตีน M recombinant บริสุทธิ์เป็นแอนติเจนการตรวจสอบ•การประเมินพอดีสำหรับการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกันและ Sero วินิจฉัยของ PEDV. •พัฒนา iELISA เป็นเฉพาะที่สำคัญและไม่จำเป็นต้องมีการเพาะปลูก PEDV. • iELISA นี้สามารถนำมาใช้สำหรับการทดสอบขนาดใหญ่ทางภูมิคุ้มกัน. บทคัดย่อเพิ่มขึ้นอย่างมากเมื่อเร็ว ๆ นี้ในรายงานกรณีของโรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกร (PED) ในฟาร์มสุกรเป็นภัยคุกคามที่อาจเกิดขึ้นกับอุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก ดังนั้นการวินิจฉัยที่ถูกต้อง, การตรวจสอบทางภูมิคุ้มกันและการเฝ้าระวังของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในสุกรที่เกิดจากเชื้อไวรัสโรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกร (PEDV) การติดเชื้อหรือการฉีดวัคซีนจะมีความสำคัญในการช่วยในการควบคุมการแพร่กระจายของ PED เราได้พัฒนาและตรวจสอบเอนไซม์ที่เชื่อมโยงทางอ้อมทดสอบอิมมูโน (ELISA) ตามเยื่อ recombinant (M) โปรตีน PEDV เพื่อตรวจหาแอนติบอดี PEDV แปดฝูง 382 ตัวอย่างซีรั่มที่ถูกเก็บรวบรวมจากแม่สุกรที่ได้รับวัคซีนวัคซีน PED และการคัดเลือกโดยใช้วิธี ELISA พัฒนาควบคู่ไปกับการวางตัวเป็นกลางเซรั่ม (SN) ทดสอบ ของตัวอย่างทดสอบ 276 เป็นบวกการปรากฏตัวของแอนติบอดี PEDV ตามการวิเคราะห์ทั้งในขณะที่ 98 เป็นลบ ข้อตกลงที่ดีระหว่างวิธี ELISA และทดสอบ SN ได้สังเกต (คัปปา = 0.947; 95% ช่วงความเชื่อมั่น = 0.910-0.984; McNemar ทดสอบของ, P = 0.727) ไม่มีปฏิกิริยาข้ามพบสำหรับวิธี ELISA ที่พัฒนาแล้วกับ coronaviruses อื่น ๆ หรืออื่น ๆ เชื้อโรคหมูที่พบบ่อย พัฒนาวิธี ELISA สามารถนำมาใช้สำหรับการประเมินผลทางภูมิคุ้มกันและการวินิจฉัยทางอ้อมของการติดเชื้อ PED. คำไวรัสโรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกร (PEDV); โปรตีน M; วิธี ELISA; เซรั่มแอนติบอดี1 บทนำโรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกร (PED) เป็นโรคที่ทำลายล้างหมูและตัวแทนสาเหตุของมันคือไวรัส PED (PEDV) โรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกรเป็นลักษณะอาการท้องเสียน้ำคายน้ำและอัตราการตายสูงในหมู่หมูดูดนม (Pensaert และ DeBouck, 1978) โรคที่ได้รับการบันทึกไว้เป็นครั้งแรกในสหราชอาณาจักรในปี 1971 เป็นโรคสุกรที่คล้ายกับกระเพาะและลำไส้อักเสบถ่ายทอด (โอลด์, 1972) การระบาดของโรค PED มีตั้งแต่การรายงานในยุโรปเอเชียและอเมริกาเหนือ (Nagy et al., 1996, ทากาฮาชิ et al., 1983 อาทิตย์ et al., 2011, พัดลม et al., 2012 และสตีเวนสัน et al., 2013 ) ไวรัสโรคอุจจาระร่วงโรคระบาดหมูได้แพร่กระจายอย่างรวดเร็วทั่วประเทศสหรัฐอเมริกาส่งผลให้อัตราการตายสูงของลูกสุกรและความเสียหายทางเศรษฐกิจอย่างมีนัยสำคัญ (Cima 2013) เกิดขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้ในทวีปอเมริกาเหนือแสดงให้เห็นว่าไวรัสนี้เป็นภัยคุกคามต่ออุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก วินิจฉัยที่ถูกต้องและการตรวจสอบทางภูมิคุ้มกันของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในสุกรเป็นผลมาจากการติดเชื้อหรือการฉีดวัคซีน PEDV จะต้องควบคุมการแพร่กระจายของ PED ได้. การแพร่ระบาดของไวรัสสุกรท้องเสียเป็น coronavirus ภายในครอบครัว Coronaviridae จีโนมของ PEDV ที่มียีนที่ควบคุมการขัดขวาง (S), เมมเบรน (M), เมมเบรนขนาดเล็ก (เอสเอ็ม) เปิดอ่านกรอบ 3 และนิวคลีโอ (N) โปรตีน (พาร์ et al., 2011) โปรตีน M เป็นไกลโคโปรตีนเมมเบรนที่มีโครงสร้างและความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดของทั้งหมดโปรตีนซองจดหมาย แต่ก็มีโดเมนอะมิโนขั้วสั้น ๆ ที่อยู่ด้านนอกของ virion กับโดเมน Carboxy ขั้วยาวในปัจจุบันโปรตีนภายใน virion นี้ (Utiger et al., 1995) ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันโปรตีน M ของ coronaviruses มีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำของการป้องกันและการไกล่เกลี่ยในการเรียนการสอนของโรค (เฟลมมิ่ง et al., 1989 และ Vennema et al., 1991) ลำดับเบสของยีน PEDV M การจัดแสดงนิทรรศการที่คล้ายคลึงกันในระดับต่ำ (ประมาณ 50%) ที่มียีน M ของ coronaviruses อื่น ๆ แต่ลำดับของมันคือการอนุรักษ์อย่างมากในหมู่สายพันธุ์ที่แตกต่างกัน PEDV (คิมและแจ้, 2000 และ Arndt et al., 2010) ดังนั้นโปรตีนเอ็มอาจจะเป็นผู้สมัครที่เหมาะสมสำหรับการตรวจหาแอนติบอดี PEDV เฉพาะและในการวินิจฉัยการติดเชื้อ PEDV. เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการตรวจหลายอิมมูโน (ELISAs) ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อ PEDV อย่างไรก็ตามการเตรียมความพร้อมของแอนติเจนที่เหมาะสมสำหรับส่วนมากของวิธีการเหล่านี้ต้องมีการเพาะปลูกของ PEDV ซึ่งเป็นเวลานานและมีราคาแพง ในการศึกษาในปัจจุบันที่เราแสดงความบริสุทธิ์และโปรตีน M ของ PEDV รูปแบบที่บริสุทธิ์ของโปรตีน M ใช้เป็นแอนติเจนเคลือบในอ้อม ELISA ที่เราพัฒนา จากนั้นเราจะคัดกรองตัวอย่างซีรั่มจากหมูที่จะตรวจสอบสถานะของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ PEDV M โปรตีน. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 ตัวอย่างซีรั่มเราเก็บรวบรวม 36 ตัวอย่างเลือดจากหมู PEDV ฟรีวัคซีนที่ดีต่อสุขภาพของวัยต่างๆ ซีรั่มที่ได้มาจากกลุ่มตัวอย่างเหล่านี้เป็นเชิงลบสำหรับการปรากฏตัวของแอนติบอดีต่อ PEDV ตามการวางตัวเป็นกลางในซีรั่ม (SN) การวิเคราะห์ (SN titers <1: 2) ซีรั่มจาก 20 ตัวอย่างเลือดที่นำมาจากสุกรที่ติดเชื้อ PEDV ถูกนำมาใช้เป็นซีรั่มบวกอ้างอิง (SN titers ≥1: 16) สถานะการติดเชื้อ PEDV ของสุกรได้รับการยืนยันโดยการถอดรหัสย้อนกลับวิธี polymerase chain reaction (RT-PCR) กำหนดเป้าหมายการตรวจยีน PEDV เอ็มอาร์เอ็นเอของไวรัสที่มีสารสกัดจากตัวอย่างอุจจาระ ซีรั่มสุกรที่มีภูมิคุ้มกันต่อไวรัสกระเพาะและลำไส้อักเสบถ่ายทอด (TGEV; titer SN 1: 413) โรตาไวรัสสุกร (PRV; 1: 305) ไวรัสโรคทางระบบสืบพันธุ์และระบบทางเดินหายใจสุกร (ไวรัสที่พบใน 1: 376) circovirus สุกร 2 (PCV-2; 1: 317) และไวรัสไข้หวัดหมูคลาสสิก (CSFV; 1: 289) ที่ได้รับจากศูนย์เหอเป่ย์เพื่อการป้องกันโรคและการควบคุม (ฉือเจียจวง, สาธารณรัฐประชาชนจีน) ทั้งหมด 382 ตัวอย่างซีรั่มที่ถูกเก็บรวบรวมจากแปดฝูงหมูซึ่งในสัตว์ที่ได้รับการบริหารจัดการวัคซีน PEDV ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการทดสอบโดยการพัฒนาวิธี ELISA อ้อม. 2.2 ไวรัสไวรัสโรคท้องร่วงระบาดของโรคสุกรสายพันธุ์ HB / BD (GenBank เลข JF690777.1) ที่แยกได้จากอุจจาระของหมูจากเหอเป่ยประเทศจีนและปรับให้เข้ากับการเพาะเลี้ยงเซลล์ 32 ทางเดินในเซลล์เวโร. 2.3 การโคลนและลำดับ PEDV M ยีนไวรัสRNA ถูกสกัดจาก PEDV ใช้น้ำยา Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับที่สอดคล้องกับยีน M ถูกขยายจากอาร์เอ็นเอไวรัสโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์ oligonucleotide MP1 (5'-GGA ทีซีซี ATG TCT GGT AAC-3) และ MP2 (5'-AAG CTT TCT GTT TAG ACT AAA T-3 ') ส่งผลให้ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกออกจากข่าวคราว agarose บริสุทธิ์และใช้การสกัดเจลมินิ Kit (Tiangen ไบโอเทค จำกัด , ปักกิ่ง, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต amplicons บริสุทธิ์ถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ pMD18-T (Takara ไบโอเทค จำกัด , ต้าเหลียน, จีน) ที่จะให้ผลผลิตพลาสมิด recombinant PMD-M ซึ่งถูกเปลี่ยนแล้วเป็นอำนาจอีโค JM109 โคลนบวกได้รับการคัดเลือกตาม lacZ ฟีโนไทป์ของพวกเขาและการตรวจสอบโดยการย่อยอาหารเอนไซม์ จำกัด คัดกรอง PCR และลำดับดีเอ็นเอ. 2.4 การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ PEDV M โปรตีนยีนM ที่มีอยู่ภายใน PMD-M ถูก subcloned ลงในการแสดงออกโปรคาริโอเวกเตอร์ pGEX-6P-1 (Sunbiotech อิงค์, ปักกิ่ง, จีน) ที่จะให้ผลผลิต pGEX-6P-M pGEX-6P-1 เวกเตอร์ยังมีลำดับสำหรับแท็กจีเอสทีซึ่งได้รับการออกแบบเพื่อที่จะเพิ่มที่สถานีอะมิโนโปรตีนแสดง เวกเตอร์ pGEX-6P-M ได้รับการตรวจสอบโดยลำดับดีเอ็นเอ โปรตีนรีคอมบิแน M ก็กลายเป็นเชื้อ E. coli BL21 (Tiangen ไบโอเทค จำกัด , ปักกิ่ง, จีน) E. coli BL21 เซลล์เพาะเลี้ยงและเปลี่ยนกับ pGEX-6P-M ใน Luria-Bertani เสริมด้วยน้ำซุปที่ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ampicillin จนความหนาแน่นของแสงที่ 600 นาโนเมตร (OD600) เป็น 0.6-1.0 ที่ซึ่งการแสดงออกของโปรตีนจุดถูกชักนำ ผ่านการเพิ่มขึ้นของ 1.0 มิลลิ isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside 5 ชั่วโมงหลังการเหนี่ยวนำเซลล์แบคทีเรียที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง โปรตีน recombinant บริสุทธิ์จาก lysate แบคทีเรียใช้ฟิวชั่นจีเอสทีโปรตีนบริสุทธิ์ Kit (TransGen ไบโอเทค จำกัด , ปักกิ่ง, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เศษส่วนของโปรตีน M บริสุทธิ์ recombinant ถูกวิเคราะห์โดยใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide ข่าวคราว (SDS-PAGE) กับเจลอะคริเลตย้อมด้วยสีฟ้าสดใส Coomassie R-250 การแสดงออกของโปรตีนเอ็มได้รับการยืนยันโดย immunoblotting ใช้ antisera PEDV สุกร การแสดงออกโปรคาริโอเวกเตอร์ pGEX-6P-1 ยังก็กลายเป็นอีโคไล BL21 เป็นตัวควบคุมเชิงลบ. 2.5 ซับตะวันตกเศษส่วนของโปรตีนบริสุทธิ์ถูกแยกออกจากระบบ SDS-PAGE และโอน electrophoretically ที่แผ่นเยื่อ nitrocellulose (BRL Gibco, วอชิงตัน ดี.ซี. สหรัฐอเมริกา) เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดปฏิกิริยาที่ไม่เฉพาะเจาะจงเยื่อถูกบล็อก 5% (w / v) ที่ไม่มีไขมันนมผงในน้ำเกลือ Tris บัฟเฟอร์ที่มี 0.05% (v / v) Tween 20 (TBST) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง เยื่อถูกบ่มกับ antisera PEDV หมู (ปรับลด 1: 200) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากสามล้างด้วย TBST เยื่อถูกบ่มกับ IgG ต่อต้านหมูผันไปมะรุม peroxidase (HRP; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เราใช้ 3,3'-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich) สำหรับการพัฒนาในการเกิดปฏิกิริยาสีที่จะเห็นภาพแถบโปรตีน. 2.6 อ้อม ELISA ไตเตรทกระดานหมากรุกที่เกี่ยวข้องกับการรวมกันของแต่ละแอนติเจน (บริสุทธิ์ PEDV recombinant โปรตีน M) และซีรั่มที่ถูกใช้ในการกำหนดเจือจางที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานในทางอ้อม ELISA เราพัฒนา แอนติเจนและซีรั่มที่ถูกปรับลด 30-.938 ไมโครกรัม / มล. และ 1:10 ถึง 1: 320 (เจือจางสองเท่า) ตามลำดับ เก้าสิบหกแผ่นเดียว (Nunc MaxiSorp, เดนมาร์ก) ถูกเคลือบด้วย recombinant โปรตีน M ซึ่งถูกเจือจางในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) และได้รับอนุญาตให้แผ่นเปลือกโลกในการฟักไข่ที่ 4 ° C ในชั่วข้ามคืน พีบีเอสถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมว่างเปล่า เวลส์ถูกบล็อก 5% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ในพีบีเอส (pH 7.4) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เวลส์ถูกล้างแล้ว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การพัฒนาวิธี enzyme-linked immunosorbent assay เพื่อติดตามและเฝ้าระวังการแพร่ระบาดของโรคอุจจาระร่วงจากแอนติบอดีต่อไวรัสตามรีคอมบิแนนท์โปรตีนเยื่อบุ

จิงแฟนฮี ยูจู จั่ว เสี่ยวเฉียงเฉิน เหวินหยวน กู จิงเหม่ยตี้

ดอย : แสดงเพิ่มเติม 10.1016 / j.jviromet . 2015.07.021

เน้นเนื้อหาและได้รับสิทธิ
-
แสดงโปรตีนเมมเบรนของสุกรท้องเสียระบาดไวรัสในแบคทีเรีย Escherichia coli .
-
เป็นวิธี indirect ELISA ในการตรวจหาแอนติเจน recombinant โปรตีนบริสุทธิ์เป็น M .
-
* เหมาะสำหรับการเฝ้าระวังและการตรวจวินิจฉัยทางภูมิคุ้มกันวิทยา SERO pedv .
-
พัฒนา ielisa เฉพาะเจาะจงที่อ่อนไหวและไม่ต้องปลูก pedv
-
.ielisa นี้สามารถใช้สำหรับการทดสอบระบบขนาดใหญ่ .

ล่าสุดละครเพิ่มบทคัดย่อรายงานกรณีของโรคระบาดในสุกรในฟาร์มสุกรท้องเสีย ( PED ) เป็นภัยคุกคามที่อาจเกิดขึ้นกับอุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก ดังนั้น การวินิจฉัยที่ถูกต้อง , ระบบตรวจสอบ ,และการเฝ้าระวังของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในสุกรที่เกิดจากการระบาดโรคอุจจาระร่วงจากไวรัส ( pedv ) การติดเชื้อหรือการฉีดวัคซีนจะสำคัญในการช่วยควบคุมการแพร่กระจายของเป็ด . เราพัฒนาและตรวจสอบทางอ้อม ( enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) โดยใช้เมมเบรนโปรตีนรีคอมบิแนนท์ ( M ) pedv . การตรวจหาแอนติบอดีใน pedv แปดวัว