Human aromatase (CYP19) converts C1

Human aromatase (CYP19) converts C19 androgens
to aromatic C18 estrogenic steroids (1) and also metabolizes
some xenobiotics (2). Inhibitors of this enzyme
are currently in use to treat postmenopausal breast
cancer and other estrogen-dependent diseases (3).
More recently, aromatase inhibitors have been identified as potential environmental toxins (so-called “endocrine disruptors”) (4). The standard method to detect
aromatase inhibitors specifies use of human placental
tissue as a source of aromatase enzyme and radiolabeled
C19 androgens as substrates (5). To eliminate
potential hazards of using human tissues or radiolabeled
materials, methods describing the use of recombinant
sources of enzyme (4, 6) and HPLC separation
with UV detection (7, 8) have been developed. However,
these methods may lack sensitivity, necessitate
use of cell culture, and are relatively laborious.
We have developed a semiautomated high-throughput
screening method utilizing recombinant human
aromatase and the fluorometric substrate O-benzylfluorescein
benzyl ester (DBF).2 The methodology is
similar to that developed previously for detecting drug
candidates with metabolism-based drug-drug interaction
potential (9). All components of the assay are
commercially available. When the assay is performed
manually, a fluorometric plate reader is the only required
instrumentation. Assays were conducted in 96-well microtiter plates
(Catalog No. 3915, Corning Costar, Cambridge, MA) in
a 200-ml volume. The substrate DBF was obtained from
Gentest Corporation (Woburn, MA). Furafylline, sulfaphenazole,
and ketoconazole were obtained from Ultrafine Chemicals limited (Manchester, UK). Quinidine,
tranylcypromine, testosterone, androstenedione, estradiol,
estrone, 4-OHA, AG, quercetin, (6)-naringenin,
chrysin, and ANF were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) and Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) were a kind gift of Dr. Willem Schoonen of N. V. Organon, the Netherlands. Aromatase enzyme (baculovirus/insect cell-expressed) was obtained from Gentest
Corporation. Characterization of the enzyme, including
steroidal aromatase activity and role in the
metabolism of xenobiotics, was as described (10). A
50% inhibitory concentration (IC50) was determined
utilizing 12 wells in each test. A cofactor/serial dilution
(C/SD) buffer was prepared in 50 mM potassium phosphate,
pH 7.4. This buffer contained 2.6 mM NADP1,
6.6 mM glucose 6-phosphate, 0.8 U/ml glucose-6-phosphate
dehydrogenase, and 0.1 mg/mL microsomal protein
prepared from insect cells infected with wild-type
virus (“control protein”). To the first well in each row,
150 ml of the test compound (dissolved in acetonitrile)
and C/SD buffer were added in a ratio of 6:144. In all
remaining wells, 100 ml of C/SD buffer containing 4%
acetonitrile was added. The final concentration of the
test substances in the first well was 0.1 to 100 mM.
Fifty microliters of the mixed solution from the first
well in each row was dispensed into the second well
and diluted serially 1:3 through the eighth well. Wells
9 and 10 contained no inhibitor and wells 11 and 12
were used as controls for background fluorescence (enzyme
and substrate were added after the reaction was
terminated). Addition of the test compounds and C/SD
buffer and serial dilutions were performed using a
Multiprobe II liquid handling station (Packard Instruments,
Downers Grove, IL). The plate was then preincubated
at 37°C for 10 min, and the reaction initiated
by the addition of 100 ml of prewarmed enzyme/substrate
(E/S) mix. The E/S mix contained buffer, cDNAexpressed
P450 (4 pmol/mL, 2 pmol/mL final), control
protein (0.4 mg/mL, 0.25 mg/mL final), substrate (0.4
mM, 0.2 mM final), and 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4. The final concentration of DBF was
chosen to be approximately the K m (Table 1). Fluorescein
metabolite production was linear with time and
enzyme concentration up to 30 min and 2 pmol/mL,
respectively, and these parameters were used to determine
IC50 values. Reactions were terminated by addition
of 75 ml 2 N NaOH. To develop adequate signal to
background ratio, the plate (with lid) was then incu

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มนุษย์ aromatase (CYP19) แปลง C19 androgensการหอม C18 estrogenic อยด์ (1) และยัง metabolizesxenobiotics ที่บาง (2) Inhibitors ของเอนไซม์นี้มีการใช้การรักษาเต้านม postmenopausalโรคมะเร็งและโรคอื่น ๆ ขึ้นอยู่กับฮอร์โมนหญิง (3)เมื่อเร็ว ๆ นี้ การระบุ aromatase inhibitors เป็นสารพิษสิ่งแวดล้อมอาจเกิดขึ้น (เรียกว่า "ต่อมไร้ท่อ disruptors") (4) วิธีการตรวจสอบaromatase inhibitors ระบุการใช้มนุษย์รกลอกเนื้อเยื่อที่เป็นแหล่งของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeledAndrogens C19 เป็นพื้นผิว (5) เพื่อกำจัดอันตรายอาจเกิดขึ้นของการใช้เนื้อเยื่อมนุษย์ หรือ radiolabeledวัสดุ วิธีการอธิบายการใช้วททชแหล่งที่มาของเอนไซม์ (4, 6) และแยก HPLCมี UV ตรวจ (7, 8) มีการพัฒนา อย่างไรก็ตามวิธีการเหล่านี้อาจขาดการไว รบกวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ และจะค่อนข้างลำบากเราได้พัฒนา semiautomated สูงสูงวิธีคัดกรองที่ใช้มนุษย์วททชaromatase และพื้นผิว fluorometric O benzylfluoresceinbenzyl เอส (DBF) 2 วิธีคือที่พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจสอบยาเสพติดมีโต้ตอบตามเผาผลาญยายาเสพติดศักยภาพ (9) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ เมื่อทำการทดสอบด้วยตนเอง ตัวอ่านแผ่น fluorometric ได้เฉพาะจำเป็นใช้เครื่องมือ Assays ได้ดำเนินการใน microtiter ดี 96 แผ่น(แค็ตตาล็อกหมายเลข 3915 คอร์นทำ Costar เคมบริดจ์ MA) ในปริมาณ 200 ml พื้นผิวได้รับจาก DBFบริษัท Gentest (เบิร์น MA) Furafylline ซัลฟาเฟนาโซลและ ketoconazole ได้รับมาจาก Ultrafine เคมีภัณฑ์จำกัด (แมนเชสเตอร์ สหราชอาณาจักร) Quinidinetranylcypromine ฮอร์โมน androstenedione, estradiolestrone, 4-OHA, AG, quercetin (6) -naringeninchrysin และ ANF ได้รับมาจากซิกมา-Aldrich (St. Louis, MO) องค์กร 30958 (19-ethylthio-4-ene - 3,17 -dione) และองค์กร-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) ของขวัญประเภทของดร.วิลเล่ม Schoonen ของ N. V. Organon เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ Aromatase (baculovirus/แมลง แสดงเซลล์) ได้รับจาก Gentestบริษัท คุณสมบัติของเอนไซม์ รวมทั้งsteroidal aromatase กิจกรรมและบทบาทในการเผาผลาญ xenobiotics ถูกอธิบายไว้ (10) A50% (IC50) ลิปกลอสไขความเข้มข้นที่กำหนดใช้ 12 บ่อในแต่ละการทดสอบ เจือจาง cofactor/ชุดบัฟเฟอร์ (C/SD) ถูกเตรียมใน 50 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตpH 7.4 บัฟเฟอร์นี้อยู่ 2.6 มม. NADP16.6 มม.กลูโคส 6-ฟอสเฟต 0.8 U/ml กลูโคส-6-ฟอสเฟตdehydrogenase และโปรตีน microsomal 0.1 mg/mLเตรียมจากเซลล์แมลงที่ติดกับป่าชนิดไวรัส ("ควบคุมโปรตีน") การดีแรกในแต่ละแถวml 150 ของการทดสอบที่ซับซ้อน (ละลายใน acetonitrile)และเพิ่มอัตราส่วนของ 6:144 C/SD บัฟเฟอร์ ในทั้งหมดเหลือบ่อ 100 ml ของบัฟเฟอร์ C/SD ประกอบด้วย 4%acetonitrile ถูกเพิ่ม ความเข้มข้นสุดท้ายของการสารทดสอบในบ่อแรก 0.1-100 มม.Microliters 50 ของโซลูชันการผสมจากครั้งแรกในแต่ละแถวมีคำเป็นที่สองด้วยและผสม serially 1:3 ถึงวันที่แปดดี บ่อ9 และ 10 อยู่ไม่มีสารยับยั้งและบ่อ 11 และ 12ใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับพื้น fluorescence (เอนไซม์และมีเพิ่มพื้นผิวหลังจากการปฏิกิริยายกเลิก) นอกจากนี้สารทดสอบและ C/SDบัฟเฟอร์และ dilutions ประจำที่ดำเนินการโดยใช้การของเหลว II multiprobe จัดการสถานี (เครื่องมือ PackardDowners โกรฟ IL) จานที่แล้ว preincubatedที่ 37° C 10 นาที และปฏิกิริยาเริ่มต้น100 ml ของเอนไซม์ prewarmed/พื้น ผิวด้านนอก(E/S) ผสมกัน บัฟเฟอร์ E/S ผสมอยู่ cDNAexpressedP450 (pmol 4 mL, 2 pmol/mL ขั้นสุดท้าย), การควบคุมโปรตีน (0.4 mg/mL สุดท้าย 0.25 mg/mL), พื้นผิว (0.4มม. 0.2 mM ที่สุดท้าย), และ 50 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟต บัฟเฟอร์ ค่า pH 7.4 การ มีความเข้มข้นสุดท้ายของ DBFเลือกที่จะ ประมาณการ K m (ตาราง 1) Fluoresceinผลิต metabolite เป็นเส้นตรงกับเวลา และความเข้มข้นเอนไซม์ถึง 30 นาทีและ 2 pmol/mLตามลำดับ และพารามิเตอร์เหล่านี้ถูกใช้เพื่อกำหนดค่า IC50 ปฏิกิริยาถูกเลิกจ้าง โดยเพิ่มของ 75 ml 2 N NaOH สัญญาณที่เพียงพอเพื่อการพัฒนาอัตราส่วนพื้นหลัง จาน (มีฝา) ถูกแล้ว incu

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

aromatase มนุษย์ (CYP19) แปลง C19 แอนโดรเจน
ที่จะเตียรอยด์ estrogenic หอม C18 (1) และยัง metabolizes
สารแปลกปลอมบาง (2) ยับยั้งเอนไซม์นี้
กำลังอยู่ในการใช้ในการรักษามะเร็งเต้านมในวัยหมดประจำเดือน
โรคมะเร็งและโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนอื่น ๆ (3).
เมื่อเร็ว ๆ นี้ยับยั้ง aromatase ได้รับการระบุว่าเป็นสารพิษสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น (ที่เรียกว่า "สารทำลายต่อมไร้ท่อ") (4) วิธีการมาตรฐานในการตรวจสอบ
สารยับยั้ง aromatase ระบุการใช้รกของมนุษย์
เนื้อเยื่อเป็นแหล่งที่มาของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
C19 แอนโดรเจนเป็นพื้นผิว (5) เพื่อขจัด
อันตรายที่อาจเกิดจากการใช้เนื้อเยื่อของมนุษย์หรือ radiolabeled
วัสดุอุปกรณ์วิธีการอธิบายการใช้ recombinant
แหล่งที่มาของเอนไซม์ (4, 6) และการแยกสารด้วยเทคนิค HPLC
มีการตรวจสอบรังสียูวี (7, 8) ได้รับการพัฒนา แต่
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดความไวเลี่ยง
การใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์และมีความลำบากค่อนข้าง.
เรามีการพัฒนาสูงผ่าน semiautomated
วิธีการตรวจคัดกรองที่ใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และสารตั้งต้นฟลูออโร O-benzylfluorescein
เอสเตอร์เบนซิล (DBF) 0.2 วิธีการคือ
แบบเดียวกับที่ก่อนหน้านี้ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจหายาเสพติด
ผู้ที่มีการเผาผลาญอาหารที่ใช้ปฏิสัมพันธ์ยาเสพติดยาเสพติด
ที่มีศักยภาพ (9) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบที่มีการ
ใช้ในเชิงพาณิชย์ เมื่อการทดสอบจะดำเนินการ
ด้วยตนเองอ่านแผ่นฟลูออโรเป็นที่จำเป็นเพียง
เครื่องมือ การตรวจได้ดำเนินการใน 96 หลุมแผ่นไมโคร
(แคตตาล็อกฉบับที่ 3915, Corning Costar, เคมบริดจ์) ใน
ปริมาณ 200 มิลลิลิตร พื้นผิว DBF ที่ได้รับจาก
GenTest คอร์ปอเรชั่น (เคมบริดจ์) Furafylline, ซัลฟาเฟนาโซล,
และ ketoconazole ที่ได้รับจาก Ultrafine เคมีภัณฑ์ จำกัด (แมนเชสเตอร์สหราชอาณาจักร) quinidine,
tranylcypromine ฮอร์โมน androstenedione, estradiol,
estrone 4 OHA, AG, quercetin, (6) -naringenin,
Chrysin และ ANF ที่ได้รับจาก บริษัท Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์) Org-30958 (19-ethylthio-4-ene-3,17-
dione) และ Org-30365 (19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione) เป็นของที่ระลึกชนิดของดร. วิลเล็ม Schoonen ของ NV ออร์กา เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ aromatase (ไวรัส / แมลงเซลล์แสดง) ที่ได้รับจาก GenTest
คอร์ปอเรชั่น คุณสมบัติของเอนไซม์รวมทั้ง
กิจกรรม aromatase เตียรอยด์และบทบาทใน
การเผาผลาญสารแปลกปลอมได้ตามที่อธิบายไว้ (10)
50% ความเข้มข้น (IC50) ถูกกำหนด
ใช้หลุม 12 ในการทดสอบแต่ละ ปัจจัย / เจือจางอนุกรม
(C / SD) กันชนได้รับการจัดทำขึ้นฟอสเฟตโพแทสเซียม 50 มิลลิเมตร,
พีเอช 7.4 บัฟเฟอร์นี้มีอยู่ 2.6 มิลลิ NADP1,
6.6 มิลลิกลูโคส 6 ฟอสเฟต 0.8 U / ml กลูโคส -6- ฟอสเฟต
dehydrogenase และ 0.1 mg / ml โปรตีนไมโคร
จัดทำขึ้นจากเซลล์แมลงที่ติดเชื้อชนิดป่า
ไวรัส ("โปรตีนควบคุม") ในการเป็นอยู่ที่ดีครั้งแรกในแต่ละแถว
150 มลสารทดสอบ (ละลายใน acetonitrile)
และบัฟเฟอร์ C / SD ถูกเพิ่มในอัตราส่วน 6: 144 ในทุก
หลุมที่เหลือ 100 มลของบัฟเฟอร์ C / SD ที่มี 4%
acetonitrile ถูกเพิ่มเข้ามา ความเข้มข้นสุดท้ายของ
สารทดสอบที่ดีเป็นครั้งแรกที่ 0.1-100 มม.
ห้าสิบ microliters ของการแก้ปัญหาการชื่นชมจากคนแรกที่
ดีในแต่ละแถวได้รับการจ่ายเป็นอย่างดีที่สอง
และปรับลดเป็นลำดับที่ 1: 3 ถึงทั้งแปด เวลส์
9 และ 10 ที่มีอยู่ไม่ยับยั้งและบ่อ 11 และ 12
ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับการเรืองแสงพื้นหลัง (เอนไซม์
และสารตั้งต้นที่ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากปฏิกิริยาถูก
ยกเลิก) การเติมสารทดสอบและ C / SD
บัฟเฟอร์และเจือจางอนุกรมถูกดำเนินการโดยใช้
สอง MultiProbe สถานีการจัดการสภาพคล่อง (เครื่องดนตรี Packard,
ดาวเนอร์สโกรฟ, IL) แผ่นถูก preincubated แล้ว
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและปฏิกิริยาที่ริเริ่ม
โดยนอกเหนือจาก 100 มล. ของเอนไซม์ prewarmed / สารตั้งต้น
(E / S) ผสม E / S ผสมบัฟเฟอร์บรรจุ cDNAexpressed
P450 (4 pmol / ml 2 pmol / mL สุดท้าย), การควบคุม
โปรตีน (0.4 mg / ml, 0.25 mg / ml สุดท้าย) สารตั้งต้น (0.4
มิลลิ, 0.2 มิลลิสุดท้าย), และ 50 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ความเข้มข้นสุดท้ายของ DBF ได้รับการ
เลือกให้เป็นประมาณ K เมตร (ตารางที่ 1) Fluorescein
ผลิต metabolite เป็นเชิงเส้นที่มีเวลาและ
ความเข้มข้นของเอนไซม์ได้ถึง 30 นาทีและ 2 pmol / ml
ตามลำดับและพารามิเตอร์เหล่านี้ถูกใช้ในการกำหนด
ค่า IC50 ปฏิกิริยาถูกยกเลิกโดยนอกเหนือ
จาก 75 มล. 2 ไม่มี NaOH เพื่อพัฒนาสัญญาณเพียงพอที่จะ
อัตราส่วนพื้นหลังแผ่น (ที่มีฝาปิด) จากนั้นก็ incu

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

aromatase มนุษย์ ( cyp19 ) แปลง c19 androgens
จะหอม c18 estrogenic สเตียรอยด์ ( 1 ) และยัง เผาผลาญ
บาง xenobiotics ( 2 ) สารยับยั้งเอนไซม์นี้
มีใช้อยู่ในปัจจุบันเพื่อรักษามะเร็งเต้านม
วัยทองและอื่น ๆโรคขึ้นอยู่กับฮอร์โมนเอสโตรเจน ( 3 ) .
เมื่อเร็ว ๆ นี้ aromatase inhibitors ได้รับการระบุเป็นพิษต่อสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้น ( เรียกว่า " disruptors " ต่อมไร้ท่อ ) ( 4 )วิธีมาตรฐานเพื่อตรวจหา

คนไทยใช้ aromatase inhibitors ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อมนุษย์เป็นแหล่งของเอนไซม์ aromatase และ radiolabeled
c19 androgens เช่นพื้นผิว ( 5 ) เพื่อขจัดอันตรายที่อาจเกิดขึ้นจากการใช้อวัยวะมนุษย์

หรือ radiolabeled วัสดุ วิธีการ การใช้แหล่งโปรตีนของเอนไซม์
( 4 , 6 ) และ HPLC แยก
ตรวจจับยูวี ( 7 , 8 ) ได้รับการพัฒนา อย่างไรก็ตาม
วิธีการเหล่านี้อาจจะขาดไว , necessitate
ใช้เซลล์เพาะเลี้ยง และค่อนข้างลําบาก เราได้พัฒนา semiautomated

ช่วยคัดกรองวิธีใช้ recombinant มนุษย์
aromatase และ fluorometric พื้นผิว o-benzylfluorescein
เบนซิลเอสเทอร์ ( DBF ) 2 โดย
คล้ายกับที่พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจหายาเสพติด
ผู้สมัครที่มีศักยภาพการปฏิสัมพันธ์ยาเสพติดการเผาผลาญ
ตาม ( 9 ) ส่วนประกอบทั้งหมดของการทดสอบเป็น
ในเชิงพาณิชย์ เมื่อทดสอบปฏิบัติ
ด้วยตนเอง อ่านแผ่น fluorometric เป็นเพียงต้องการ
เครื่องมือ วิธีทดสอบใน 96 ดีไมโครจาน
( รายการไม่ 3915 , Corning costar Cambridge , MA ) ในปริมาตร 200 ml
. พื้นผิว DBF ที่ได้รับจาก
gentest Corporation ( Woburn , MA ) furafylline ซัลฟาเฟนาโซล
, , และ คีโตโคนาโซลที่ได้รับจากสารเคมีสด จำกัด ( แมนเชสเตอร์ , UK ) ควินิดีนทรานิลไซโพรมีน
, , ฮอร์โมนเพศชาย , ถอย , ก่อน
estrone 4-oha AG , quercetin , ( 6 ) - naringenin
, คริสติน , และได้รับจากซิกม่า Aldrich ( St . Louis , MO ) org-30958 ( 19-ethylthio-4-ene-3,17 -
ดิออน ) และ org-30365 ( 19-mercaptoandro-4-ene-3,17-dione ) เป็นประเภทของขวัญของ ดร. วิลเลี่ยม schoonen ( V organon , เนเธอร์แลนด์ เอนไซม์ aromatase ( ไวรัสโรค / แมลงเซลล์แสดง ) ได้จาก gentest
Corporation การศึกษาคุณลักษณะของเอนไซม์ รวมทั้งกิจกรรม aromatase การผลิตและบทบาทใน

) ของ xenobiotics , ตามที่อธิบายไว้ ( 10 )
เป็นพบว่า ความเข้มข้น 50% ( ic50 ) ตั้งใจ
ใช้ 12 บ่อ ในแต่ละแบบ เป็นโคแฟคเตอร์ / อุทิศถวาย
( C / SD ) เตรียมในโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 50 mm
. บัฟเฟอร์นี้ประกอบด้วย nadp1 2.6 มม. ,
6-phosphate กลูโคส 6.6 มม. 0.8 U / ml glucose-6-phosphate
dehydrogenase และ 0.1 มก. / มล. เพิ่มโปรตีนที่เตรียมจากเซลล์แมลงติด

ของไวรัส ( " โปรตีน " ควบคุม )ที่จะแรกในแต่ละแถว
150 มิลลิลิตรทดสอบสารประกอบที่ละลายในไน )
c / SD และบัฟเฟอร์ที่ถูกเพิ่มในสัดส่วน 6:144 . ใน
เหลือบ่อ 100 ml c / SD บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 4 %
ไนถูกเพิ่มเข้ามา สุดท้าย ความเข้มข้นของสารทดสอบใน
แรก 0.1 ถึง 100 มม.
50 ตัวเลขของสารละลายผสมครั้งแรก
ในแต่ละแถวคือจ่ายเป็น
ดีที่สองและเจือจางเป็น 1 : 3 จาก 8 ดี บ่อ
9 และ 10 ที่มีอยู่ไม่ยับยั้ง และบ่อ 11 และ 12
ใช้การควบคุมสำหรับเรืองแสงพื้นหลัง ( เอนไซม์
พื้นผิวและเพิ่มหลังจากปฏิกิริยา
ยกเลิก ) เพิ่มของสารทดสอบ และ C / SD
บัฟเฟอร์ และซีเรียลเจือจางได้โดยใช้
สถานีขนถ่ายของเหลว multiprobe II ( Packard เครื่องมือ
Downers Grove , อิลลินอยส์ ) จานแล้ว preincubated
37 ° C เป็นเวลา 10 นาทีและปฏิกิริยาเริ่มต้น
โดยนอกเหนือจาก 100 มิลลิลิตรเอนไซม์ตั้งต้น prewarmed /
( E / S ) ผสม E / S ผสมมีบัฟเฟอร์ cdnaexpressed
พี ( 4 pmol / ml 2 pmol / ml สุดท้าย ) , โปรตีนควบคุม
( 0.4 mg / ml , 0.25 มก. / มล. ( สุดท้าย ) ( 0
- 0.2 มม. สุดท้าย )และ 50 มม. โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.4 . ความเข้มข้นสุดท้ายของ DBF คือ
เลือกที่จะอยู่ที่ประมาณ K M ( ตารางที่ 1 ) การผลิตอาหารเป็นเชิงเส้นกับเวลาี่

และความเข้มข้นของเอนไซม์ได้ถึง 30 นาที และ 2 pmol / ml
ตามลำดับและตัวแปรเหล่านี้จะถูกใช้เพื่อกำหนด
ic50 ค่า ปฏิกิริยาที่ถูกยกเลิก โดยนอกจาก
75 ml 2 N NaOH พัฒนาสัญญาณเพียงพอ

ส่วนพื้นหลังแผ่น ( พร้อมฝา ) ก็ incu