(e). Cross-competition of non-label

(e). Cross-competition of non-labeled mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 with PE-conjugated commercial mouse แอนติ-CD134
antibodies on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T ลิมโฟไซต์
PHA (at 10 gg/mL หรือ at 20 gg/mL for 4 days หรือ for 1 day, ตามลำดับ; see above) stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3
supplemented with 10% HPS (blocking Fcy รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were 5 incubated with 20 i.tg/mL non-labeled mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 12H3 หรือ with 10 [ig/mL non-labeled clone 20E5 for 30 minutes at
4°C. Cells were subsequently incubated with 1:20 diluted PE-conjugated
commercially available mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35 (BD
Biosciences) หรือ clone L106 (BD Biosciences; see also Godfrey patent) for 30 minutes 10 at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2%
formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of PE-conjugated commercial available แอนติ-CD134 antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
As shown in รูป 5, pre-incubation with non-labeled mouse แอนติ-ฮิวเมน 15 CD134 antibody clone 12H3 partially blocked the binding of commercial PE-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody. clone L106 against ฮิวเมน CD134
On PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์. Pre incubation with non-labelled mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 slightly blocked the binding of commercial PE-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone L106 against ฮิวเมน CD134 20 on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์. Pre-incubation with non labelled mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 showed no effect on the binding
of commercial PE-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35
against ฮิวเมน CD134 on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์.
These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 25 12H3 specifically recognized ฮิวเมน CD134 (partial blocking of clone L106 binding)
on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, and bound (ii) to a non-identical เอพิโทป on
ฮิวเมน CD134, which was recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone L106. These results also demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 (i) specifically recognized ฮิวเมน CD134 (slight
30 blocking of clone L106 binding) on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, and (ii) bound
to a non-identical เอพิโทป, which was recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone L106. Moreover, these results demonstrated that mouse
แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 seemed to recognize
ฮิวเมน CD134 เอพิโทป on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, which were different to
the เอพิโทป recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
ACT35. In addition, these results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3 and clone 20E5 seemed to recognize dissimilar ฮิวเมน CD134 5 เอพิโทป (evidenced by partial blocking vs slight blocking of L106 binding,
ตามลำดับ) on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์.


(0 . Simultaneous binding of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์ and mouse
แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน
10 CD134 expressing T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 gg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 10% HPS (blocking Fcy
รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were incubated with 10.0 gg/mL polyhistidine-
15 tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์ (OX40L; R&D Systems) in combination
with 50.0 gg/mL แอนติ-polyhistidine antibody (mouse IgG 1, clone AD1.1.10; R&D
Systems) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells
were subsequently incubated with 1:100 diluted FITC-conjugated goat แอนติ-mouse
IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive 20 washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 10.0 gg/mL biotinylated
(using N-hydroxysuccinimido-biotin from Pierce) mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After
extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 1:100 diluted PE-
conjugated สเตร็ปทาวิดิน (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After 25 extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in
PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of ฮิวเมน OX4OL and แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD
Biosciences).
As shown in รูป 6, both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody 30 clone 12H3 and mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 bound
simultaneously with ฮิวเมน OX4OL on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing
T ลิมโฟไซต์. This indicated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 12H3 and clone 20E5 do not interact with เอพิโทป within the OX4OL binding
region on ฮิวเมน CD134 รีเซปเตอร์. This finding คือ in contrast with commercially available mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone L106 (Stanford University/Godfrey patent EP 0 726 952 Bl), which recognized an เอพิโทป within
the ฮิวเมน OX4OL binding region of ฮิวเมน CD134 รีเซปเตอร์ (Taylor and Schwarz. 5 J Immunol Methods 2001; 255: 67-72; Kirin & La Jolla Institute/Croft patent WO
2007/062235 A2).
(g). CD134 expression on ฮิวเมน เอฟเฟคเตอร์ and regulatory T ลิมโฟไซต์ after stimulation with แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads
10 ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์ were purified from PBMCs by โพซิทีฟ selection
using microbeads-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibodies (Miltenyi Biotec) and VarioMACSTm Magnet/LS columns (Miltenyi Biotec). Subsequently, these CD4 T ลิมโฟไซต์ were stained with FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4
antibodies (Dako) and PE conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD25 antibodies (BD
15 Biosciences). CD4โพซิทีฟ /CD25negative conventional เอฟเฟคเตอร์ T ลิมโฟไซต์ (Teffs) and
CD4P°sitive/CD25high regulatory T ลิมโฟไซต์ (Tregs) were sorted using an Altra flow cytometric cell sorter (Beckman Coulter). This resulted in enrichments of >95% Teffs and of >95% Tregs. Teffs and Tregs were put on 2.5x105 cells/mL in
RPMI-1640/glutamax culture medium (Gibco) supplemented with 0.02 mM
20 pyruvate (Gibco), 100 U/mL penicillin (Gibco), 100 Rg/mL streptomycin (Gibco), and
10% heat inactivated HPS (HPSi; from LMI). Then, cells were seeded at 2.5x104 cells/200 µL/well in 96-well round-bottom plates (Greiner), and stimulated with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3/mouse แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads
(CD3/CD28 beads; Invitrogen) at 1 bead/2 cells in the presence of 25 U/mL
25 รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน interleukin-2 (Proleukin® from Novartis Pharmaceuticals UK
Ltd) at 37°C/5% CO2 for 2-8 days. After culture, cells were harvested and put at 1-
2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/0.2% BSA, and were simultaneously stained with 1:50 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (Dako), 1:10
diluted PE-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD25 antibody (BD Biosciences), 1:50 30 diluted ECDTm-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3 antibody (Beckman-Coulter),
1:10 diluted PE-CyTm5-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody (clone ATC35; BD Biosciences), and 1:10 diluted PE-CyTm7-conjugated mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD127 antibody (eBiosciences). Binding of antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
As shown in รูป 7 (n=1 from each donor), peripheral blood-purified non-
stimulated/resting (day 0) ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน Tregs did not express any
5 CD134, however, CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน Tregs
expressed surface CD134. CD134 expression on activated ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน
Tregs peaked after 2 days in culture, and attenuated after 5 and 8 days in culture.


Example 3. Biological characterization of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
10 antibodies clones 12H3 and 20E5

(a). Proliferation of PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T ลิมโฟไซต์ after
treatment with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5
PHA-stimulated (at 0 and 10 gg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
15 expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at
2x106 cells/mL in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum
(Bodinco) and 50 lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106 cells/100
pL/well (i.e., 1x106 cells/mL) in 96-wells flat-bottom plates (Corning), and were
exposed to 0, 0.025, 0.25, 2.5, หรือ 25.0 ttg/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 20 antibody clone 12H3 หรือ mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(จ) การแข่งขันข้ามของเมาส์ที่ป้ายไม่ใช่แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 กับเมาส์ PE กลวงค้าแอนติ-CD134 แอนตี้ในถูกกระตุ้นผาฮิวเมน CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์ผา (ที่ 10 หรือ gg/mL ที่ gg 20 mL สำหรับ 4 วันหรือ 1 วัน ตามลำดับ โปรดดูข้างต้น) ฮิวเมนขาวกระตุ้น CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์สร้างขึ้น เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์เสริม ด้วย 10% HPS (บล็อก Fcy รีเซปเตอร์ BioWhittaker) เซลล์มี 5 incubated กับ i.tg/mL 20 ป้ายไม่ใช่เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอล ออกเป็น 12H 3 โคลนแอนติบอดี ด้วย 10 [ig/mL ไม่ใช่ป้ายโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เซลล์มีต่อ incubated กับ 1:20 ทำให้ PE กลวง เมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน ACT35 (BD เวลาออก) หรือโคลน L106 (เวลาออก BD ดูสิทธิบัตร Godfrey) 30 นาที 10 ที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรใน 2%ฟอร์มาลดีไฮด์ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ PE กลวงพาณิชย์มีแอนติ-CD134 ถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur BD เวลาออก)As shown in รูป 5, pre-incubation with non-labeled mouse แอนติ-ฮิวเมน 15 CD134 antibody clone 12H3 partially blocked the binding of commercial PE- conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody. clone L106 against ฮิวเมน CD134 On PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์. Pre incubation with non-labelled mouse แอนติ- ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 slightly blocked the binding of commercial PE- conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone L106 against ฮิวเมน CD134 20 on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์. Pre-incubation with non labelled mouse แอนติ- ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 showed no effect on the binding of commercial PE-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35 against ฮิวเมน CD134 on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์.These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 25 12H3 specifically recognized ฮิวเมน CD134 (partial blocking of clone L106 binding) on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, and bound (ii) to a non-identical เอพิโทป on ฮิวเมน CD134, which was recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone L106. These results also demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 (i) specifically recognized ฮิวเมน CD134 (slight 30 blocking of clone L106 binding) on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, and (ii) bound to a non-identical เอพิโทป, which was recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone L106. Moreover, these results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 seemed to recognizeฮิวเมน CD134 เอพิโทป on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์, which were different to the เอพิโทป recognized by commercial mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone ACT35. In addition, these results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 seemed to recognize dissimilar ฮิวเมน CD134 5 เอพิโทป (evidenced by partial blocking vs slight blocking of L106 binding, ตามลำดับ) on PHA-stimulated T ลิมโฟไซต์.(0 . Simultaneous binding of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์ and mouseแอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน10 CD134 expressing T ลิมโฟไซต์PHA-stimulated (at 10 gg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 10% HPS (blocking Fcy
รีเซปเตอร์; BioWhittaker). Cells were incubated with 10.0 gg/mL polyhistidine-
15 tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์ (OX40L; R&D Systems) in combination
with 50.0 gg/mL แอนติ-polyhistidine antibody (mouse IgG 1, clone AD1.1.10; R&D
Systems) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells
were subsequently incubated with 1:100 diluted FITC-conjugated goat แอนติ-mouse
IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive 20 washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 10.0 gg/mL biotinylated
(using N-hydroxysuccinimido-biotin from Pierce) mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After
extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 1:100 diluted PE-
conjugated สเตร็ปทาวิดิน (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After 25 extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2% formaldehyde in
PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of ฮิวเมน OX4OL and แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD
Biosciences).
As shown in รูป 6, both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody 30 clone 12H3 and mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 bound
simultaneously with ฮิวเมน OX4OL on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing
T ลิมโฟไซต์. This indicated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 12H3 and clone 20E5 do not interact with เอพิโทป within the OX4OL binding
region on ฮิวเมน CD134 รีเซปเตอร์. This finding คือ in contrast with commercially available mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone L106 (Stanford University/Godfrey patent EP 0 726 952 Bl), which recognized an เอพิโทป within
the ฮิวเมน OX4OL binding region of ฮิวเมน CD134 รีเซปเตอร์ (Taylor and Schwarz. 5 J Immunol Methods 2001; 255: 67-72; Kirin & La Jolla Institute/Croft patent WO
2007/062235 A2).
(g). CD134 expression on ฮิวเมน เอฟเฟคเตอร์ and regulatory T ลิมโฟไซต์ after stimulation with แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads
10 ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์ were purified from PBMCs by โพซิทีฟ selection
using microbeads-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibodies (Miltenyi Biotec) and VarioMACSTm Magnet/LS columns (Miltenyi Biotec). Subsequently, these CD4 T ลิมโฟไซต์ were stained with FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4
antibodies (Dako) and PE conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD25 antibodies (BD
15 Biosciences). CD4โพซิทีฟ /CD25negative conventional เอฟเฟคเตอร์ T ลิมโฟไซต์ (Teffs) and
CD4P°sitive/CD25high regulatory T ลิมโฟไซต์ (Tregs) were sorted using an Altra flow cytometric cell sorter (Beckman Coulter). This resulted in enrichments of >95% Teffs and of >95% Tregs. Teffs and Tregs were put on 2.5x105 cells/mL in
RPMI-1640/glutamax culture medium (Gibco) supplemented with 0.02 mM
20 pyruvate (Gibco), 100 U/mL penicillin (Gibco), 100 Rg/mL streptomycin (Gibco), and
10% heat inactivated HPS (HPSi; from LMI). Then, cells were seeded at 2.5x104 cells/200 µL/well in 96-well round-bottom plates (Greiner), and stimulated with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3/mouse แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads
(CD3/CD28 beads; Invitrogen) at 1 bead/2 cells in the presence of 25 U/mL
25 รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน interleukin-2 (Proleukin® from Novartis Pharmaceuticals UK
Ltd) at 37°C/5% CO2 for 2-8 days. After culture, cells were harvested and put at 1-
2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/0.2% BSA, and were simultaneously stained with 1:50 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (Dako), 1:10
diluted PE-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD25 antibody (BD Biosciences), 1:50 30 diluted ECDTm-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3 antibody (Beckman-Coulter),
1:10 diluted PE-CyTm5-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody (clone ATC35; BD Biosciences), and 1:10 diluted PE-CyTm7-conjugated mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD127 antibody (eBiosciences). Binding of antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
As shown in รูป 7 (n=1 from each donor), peripheral blood-purified non-
stimulated/resting (day 0) ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน Tregs did not express any
5 CD134, however, CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน Tregs
expressed surface CD134. CD134 expression on activated ฮิวเมน Teffs and ฮิวเมน
Tregs peaked after 2 days in culture, and attenuated after 5 and 8 days in culture.


Example 3. Biological characterization of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
10 antibodies clones 12H3 and 20E5

(a). Proliferation of PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T ลิมโฟไซต์ after
treatment with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5
PHA-stimulated (at 0 and 10 gg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
15 expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at
2x106 cells/mL in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum
(Bodinco) and 50 lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106 cells/100
pL/well (i.e., 1x106 cells/mL) in 96-wells flat-bottom plates (Corning), and were
exposed to 0, 0.025, 0.25, 2.5, หรือ 25.0 ttg/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 20 antibody clone 12H3 หรือ mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5,

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(จ) การแข่งขันครอสของเมาส์ที่ไม่ติดป้ายแอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ด้วยเมาส์พาณิชย์ PE-ผันแอนติ -CD134
แอนติบอดีใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์
PHA (อย่าง GG 10 มิลลิลิตร / หรือที่ 20 GG / มิลลิลิตรเป็นเวลา 4 วันหรือ 1 วันตามลำดับ; ดูด้านบน) กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3
เสริมด้วย HPS 10% (การปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 5 20 i.tg/mL เมาส์ที่ไม่ติดป้ายแอนติ - ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน12H3 หรือ 10 [ig / mL ที่ไม่ติดป้าย 20E5 โคลนเป็นเวลา 30 นาทีที่
4 ° C เซลล์ที่ถูกบ่มต่อมาเจือจาง 1:20
PE-ผันเมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 ACT35 (BD
ชีววิทยาศาสตร์) หรือโคลน L106 (BD ชีววิทยาศาสตร์; ดูสิทธิบัตรก็อดฟรีย์) เป็นเวลา 30 นาที 10 ที่ 4 ° C . หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขใน 2%
ดีไฮด์ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของ PE-ผันเชิงพาณิชย์แอนติ -CD134 แอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์)
ดังแสดงในรูปที่ 5 ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ที่ไม่ติดป้ายแอนติ - ฮิวเมน 15 CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 บล็อกบางส่วนผูกพันของการค้า PE-
เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน L106 กับฮิวเมน CD134
ใน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ที่ไม่ติดป้ายแอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 เล็กน้อยบล็อกผูกพันของการค้า PE-
ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน L106 กับฮิวเมน CD134 20 PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ที่มีข้อความที่ไม่แอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และโคลน 20E5
พบว่าไม่มีผลกระทบต่อผลผูกพันเมาส์พาณิชย์PE-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 ACT35
กับฮิวเมน CD134 บน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์.
เหล่านี้ส่งผลแสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมนได้รับการยอมรับแอนติบอดีโคลน CD134 25 12H3 เฉพาะฮิวเมน CD134 (บางส่วนปิดกั้นของโคลน L106 ผูกพัน)
ใน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์, และผูกพัน (ii)
ไม่เหมือนกันเอพิโทปในฮิวเมนCD134 ซึ่งเป็นที่ยอมรับโดยเมาส์ในเชิงพาณิชย์แอนติ - ฮิวเมน CD134
แอนติบอดีโคลน L106 ผลเหล่านี้ยังแสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 (i) การได้รับการยอมรับโดยเฉพาะฮิวเมน CD134 (เล็กน้อย
30 ปิดกั้นของโคลน L106 ผูกพัน) บน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์และ (ii) ที่ถูกผูกไว้
ที่ไม่ใช่เหมือนเอพิโทปซึ่งเป็นที่ยอมรับโดยเมาส์ในเชิงพาณิชย์แอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 L106 นอกจากนี้ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และโคลน 20E5 ดูเหมือนจะรู้จักฮิวเมนCD134 เอพิโทปใน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ซึ่งแตกต่างกันไปเอพิโทปได้รับการยอมรับในเชิงพาณิชย์โดยใช้เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลนACT35 นอกจากนี้ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และโคลน 20E5 ดูเหมือนจะรับรู้ที่แตกต่างกันฮิวเมน CD134 5 เอพิโทป (เห็นได้จากการปิดกั้นบางส่วนเทียบกับการปิดกั้นเล็กน้อย L106 ผูกพันตามลำดับ) ใน PHA กระตุ้น T ลิมโฟไซต์. (0 พร้อมกันผูกพันของรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์และเมาส์. แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ใน PHA กระตุ้นฮิว เมน10 CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์PHA กระตุ้น (10 GG / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134. แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตร ในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วย HPS 10% (การปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์; BioWhittaker). เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 10.0 GG / mL polyhistidine- 15 ติดแท็กรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX40 ลิแกนด์ (OX40L; R & D ระบบ) ร่วมกับ50.0 GG / mL แอนติ -polyhistidine แอนติบอดี (IgG เมาส์ 1, โคลน AD1.1.10; R & D Systems). เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสหลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3, เซลล์ถูกบ่มต่อมา1: 100 ปรับลดแพะ FITC-ผันแอนติ -mouse แอนติบอดี IgG (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวาง 20 ซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ 10.0 GG / mL ไบโอติน(ใช้ N-hydroxysuccinimido-ไบโอตินจากเพียร์ซ) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือโคลน 20E5 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่ม 1: 100 ปรับลด PE- ผันสเตร็ปทาวิดิน (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก 25 กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส/ บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของฮิวเมน OX4OL และแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีCD134 ถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD. ชีววิทยาศาสตร์) ดังแสดงในรูปที่ 6 ทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลน อลแอนติบอดีที่ 30 โคลน 12H3 และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 ผูกพันพร้อมกันกับฮิวเมนOX4OL ใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและโคลน12H3 20E5 ไม่โต้ตอบกับเอพิโทปภายใน OX4OL ผูกพันภูมิภาคในฮิวเมนCD134 รีเซปเตอร์ การค้นพบคือในทางตรงกันข้ามกับเมาส์ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอแอนติบอดีลโคลน L106 (Stanford University / ก็อดฟรีย์สิทธิบัตร EP 0 726 952 Bl) ซึ่งได้รับการยอมรับเอพิโทปภายในฮิวเมนOX4OL ภูมิภาคที่มีผลผูกพันของฮิวเมน CD134 รีเซปเตอร์ (เทย์เลอร์และ Schwarz 5 J Immunol วิธี 2001; 255:. 67-72; จี๋หลินและ La Jolla สถาบัน / Croft สิทธิบัตร WO 2007/062235 A2). (ช) การแสดงออกของ CD134 ในฮิวเมนเอฟเฟคเตอร์และกฎระเบียบทีลิมโฟไซต์หลังจากการกระตุ้นด้วยแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ - ฮิวเมน CD28 ลูกปัดกระตุ้นแอนติบอดี10 ฮิวเมน CD4 ทีลิมโฟ ไซต์ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs โดยโพซิทีฟเลือกใช้Microbeads-ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนภูมิคุ้มกัน CD4 (Miltenyi Biotec) และ VarioMACSTm คอลัมน์แม่เหล็ก / LS (Miltenyi Biotec) ต่อมาเหล่านี้ CD4 ทีลิมโฟไซต์มีการย้อมด้วยเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี (Dako) และ PE ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD25 (BD 15 ชีววิทยาศาสตร์) CD4 โพซิทีฟ / CD25negative เดิมเอฟเฟคเตอร์ทีลิมโฟไซต์ (Teffs) และCD4P ° sitive / CD25high กฎระเบียบทีลิมโฟไซต์ (Tregs) ถูกจัดเรียงโดยใช้เซลล์ cytometric ไหล Altra เรียงลำดับ (Beckman Coulter) ส่งผลให้ enrichments ของ> 95% Teffs และ> 95% Tregs Teffs Tregs และวางอยู่บน 2.5x105 เซลล์ / มิลลิลิตรในRPMI-1640 / glutamax กลางวัฒนธรรม (Gibco) เสริมด้วย 0.02 มิลลิ20 ไพรู (Gibco) 100 penicillin U / มิลลิลิตร (Gibco) 100 streptomycin Rg / มิลลิลิตร (Gibco) และความร้อน10% ใช้งาน HPS (HPSI จากการ LMI) จากนั้นเซลล์เมล็ดที่ 2.5x104 เซลล์ / 200 ไมโครลิตร / ดีใน 96 หลุมรอบแผ่นล่าง (เกรนเนอร์) และการกระตุ้นด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD3 / เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD28 กระตุ้นแอนติบอดี ลูกปัด(CD3 / CD28 ลูกปัด; Invitrogen) ณ วันที่ 1 ลูกปัด / 2 เซลล์ในการปรากฏตัวของ 25 U / มิลลิลิตร25 รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน interleukin-2 (Proleukin®ติยาจากสหราชอาณาจักรจำกัด ) ที่ 37 ° C / CO2 5% สำหรับ 2-8 วัน หลังจากวัฒนธรรมเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1- 2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / 0.2% บีเอสเอและมีการย้อมพร้อมกันกับการปรับลด 01:50 เมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (Dako) , 1:10 เจือจางเมาส์ PE-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD25 (BD ชีววิทยาศาสตร์) 01:50 30 ปรับลด ECDTm-ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD3 (Beckman-โคลเตอร์) 1:10 เจือจาง PE-CyTm5-ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดี (โคลน ATC35; BD ชีววิทยาศาสตร์) และ 1:10 เจือจาง PE-CyTm7-ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD127 (eBiosciences) ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์) ดังแสดงในรูปที่ 7 (n = 1 จากกันบริจาค) อุปกรณ์ต่อพ่วงเลือดบริสุทธิ์ที่ไม่ใช่การกระตุ้น/ พักผ่อน (วันที่ 0) ฮิวเมน Teffs และฮิวเมน Tregs ไม่ได้แสดงใด ๆ5 CD134 แต่ CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน Teffs และฮิวเมน Tregs แสดงพื้นผิว CD134 การแสดงออกของ CD134 ในการเปิดใช้งานฮิวเมน Teffs และฮิวเมนTregs แหลมหลังจาก 2 วันในวัฒนธรรมและจางหลังจาก 5 และ 8 วันในวัฒนธรรม. ตัวอย่าง 3. ลักษณะทางชีวภาพของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล10 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 (ก) การแพร่กระจายของ PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์หลังจากการรักษาด้วยเมาส์แอนติ- ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 PHA กระตุ้น (ที่ 0 และ 10 GG / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 15 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและระงับที่2x106 cells / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว(Bodinco) และ 50 lig / mL เจนทาไมซิน (Gibco) เซลล์ที่ถูกเมล็ดที่ 0.1x106 cells / 100 PL / ดี (เช่น 1x106 cells / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานแบนด้านล่าง (Corning) และได้รับการสัมผัสกับ0, 0.025, 0.25, 2.5, 25.0 หรือ TTG / เมาส์มิลลิลิตร แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20 12H3 เมาส์หรือแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( E ) การแข่งขันข้ามไม่ติดป้ายว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 20e5 กับ PE และพาณิชย์เมาส์แอนติ - cd134
แอนติบอดีบนผากระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ผา ( 10 มิลลิลิตรที่อุณหภูมิ 20 GG GG ค็อคเป็นเวลา 4 วัน ค็อคเป็นเวลา 1 วัน ตามลำดับ ;ดูด้านบน ) กระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง T ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ใน 1-2x106 เซลล์ / มล. ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3
เสริม 10% HPS ( บล็อก FCY รีเซปเตอร์ ; biowhittaker ) เซลล์มี 5 แยก 20 i.tg/ml ไม่ติดป้ายว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
แอนติบอดีโคลน 12h3 ค็อค 10 [ IG / ml ไม่ป้ายโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่
4 องศา เซลล์ จัดการแยก 1 เจือจาง PE conjugated
อาดเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน act35 ( BD
Biosciences ) ค็อคโคลน l106 ( BD BIOSCIENCES ; ดูยังก็อดฟรีย์สิทธิบัตร ) สำหรับ 30 นาทีที่ 10 ที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / / nan3 BSA ,เซลล์มีการแก้ไขในฟอร์ม 2 %
ใน PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา ผูกพันของ PE และแอนติพาณิชย์ - บริการ cd134 แอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES ) .
ดังแสดงในรูป 5 ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ไม่ติดป้ายแอนติ - ฮิวเมน 15 cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 บางส่วน ปิดกั้นผูกพันของ PE - พาณิชย์
และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดี โคลน l106 กับฮิวเมน cd134
บนผากระตุ้น T ลิมโฟไซต์ . ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ไม่ติดป้ายแอนติ -
ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 เล็กน้อยปิดกั้นผูกพันของ PE -
พาณิชย์และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน l106 กับฮิวเมน cd134 20 บนผากระตุ้น T ลิมโฟไซต์ . ก่อนการบ่มด้วยเมาส์ไม่ติดป้ายแอนติ -
ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและโคลน 12h3 20e5 ไม่มีผลผูกพัน
พาณิชย์ PE และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน act35
กับฮิวเมน cd134 บนผากระตุ้น T ลิมโฟไซต์ .
พบว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 25 12h3 โดยเฉพาะได้รับการยอมรับฮิวเมน cd134 ( บางส่วนบังโคลน l106 ผูกพัน ) บนผากระตุ้น T
ลิมโฟไซต์ และผูก ( 2 ) ไม่เหมือนเอพิโทปบน
cd134 ฮิวเมน ,ซึ่งได้รับการยอมรับโดยเมาส์แอนติ - พาณิชย์ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน l106 . ผลลัพธ์เหล่านี้ยังแสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ( ฉัน ) โดยเฉพาะการฮิวเมน cd134 ( เล็กน้อย
30 บังโคลน l106 ผูกพัน ) บนผากระตุ้น T ลิมโฟไซต์และ ( 2 ) ผูกพัน
จะไม่เอพิโทปเหมือนกัน ,ซึ่งได้รับการยอมรับโดยเมาส์แอนติ - พาณิชย์ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน l106 . นอกจากนี้พบว่าเมาส์
แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและโคลน 12h3 20e5 ดูจะจำ
ฮิวเมน cd134 เอพิโทปบนผากระตุ้น T ลิมโฟไซต์ซึ่งแตกต่าง

การเอพิโทปรู้จักเมาส์แอนติ - พาณิชย์ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน
act35 . นอกจากนี้ พบว่าแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลนและโคลน 12h3 20e5 ดูเหมือนจะรับรู้ไม่เหมือนกัน ฮิวเมน cd134 5 เอพิโทป ( เห็นได้จากบางส่วนปิดกั้น vs เล็กน้อยบล็อก
l106 ผูก