Resazurin Reduction Assay ConceptRe

Resazurin Reduction Assay Concept

Resazurin is a cell permeable redox indicator that can be used to monitor viable cell number with protocols similar to those utilizing the tetrazolium compounds (26). Resazurin can be dissolved in physiological buffers (resulting in a deep blue colored solution) and added directly to cells in culture in a homogeneous format. Viable cells with active metabolism can reduce resazurin into the resorufin product which is pink and fluorescent (Figure 7).

Figure 7: . Structure of resazurin substrate and the pink fluorescent resorufin product resulting from reduction in viable cells.
Figure 7:

Structure of resazurin substrate and the pink fluorescent resorufin product resulting from reduction in viable cells.
Addition of an intermediate electron acceptor is not required for cellular resazurin reduction to occur, but it may accelerate signal generation. The quantity of resorufin produced is proportional to the number of viable cells which can be quantified using a microplate fluorometer equipped with a 560 nm excitation / 590 nm emission filter set. Resorufin also can be quantified by measuring a change in absorbance; however, absorbance detection is not often used because it is far less sensitive than measuring fluorescence. The resazurin reduction assay is slightly more sensitive than tetrazolium reduction assays and there are numerous reports using the resazurin reduction assay in a miniaturized format for HTS applications (27).

The incubation period required to generate an adequate fluorescent signal above background is usually 1to 4 hours and is dependent on the metabolic activity of the particular cell type, the cell density per well, and other assay conditions including the type of culture medium. The incubation period should be optimized and kept short enough to avoid reagent toxicity but long enough to provide adequate sensitivity.

The major advantages of the resazurin reduction assay are that it is relatively inexpensive, it uses a homogeneous format, and it is more sensitive that tetrazolium assays. In addition, resazurin assays can be multiplexed with other methods such as measuring caspase activity to gather more information about the mechanism leading to cytotoxicity (28 and Figure 8).

Figure 8: . Panel A shows the steps of the sequential multiplex of a resazurin assay to measure viable cell number and a fluorometric caspase 3-assay to detect a marker of apoptosis.
Figure 8:

Panel A shows the steps of the sequential multiplex of a resazurin assay to measure viable cell number and a fluorometric caspase 3-assay to detect a marker of apoptosis. Panel B shows the results of treating PC3 (human prostate) cells with a range of (more...)
Multiplexing may require a sequential protocol to avoid color quenching by resazurin or direct chemical interference. For the multiplex example shown in Figure 8, resorufin fluorescence must be recorded first, followed by addition of the caspase reagent which contains detergent to lyse cells and reducing compounds to convert remaining resazurin and reduce interference with collecting the second fluorescent signal.

The disadvantages of the resazurin include the possibility of fluorescent interference from compounds being tested and the often overlooked direct toxic effects on the cells (Figure 9).

Figure 9: . Change in NIH3T3 cell morphology after exposure to resazurin.
Figure 9:

Change in NIH3T3 cell morphology after exposure to resazurin. Panel A shows a field of cells photographed immediately after addition of the resazurin solution. Panel B shows the same field of cells photographed after 4 hours of exposure to resazurin. (more...)
Some protocols describe exposing cells to resazurin for several hours or even days; however, in some systems, changes in cell morphology can be observed after only a few hours of exposure suggesting interference with normal cell function (29). It is possible that exposure of cells to resazurin depletes reduced forms of nucleotides resulting in cytotoxic effects. Exposure of cells to resazurin is known to reduce the amount of ATP measured as a marker of cell viability. Figure 10 shows a decrease in ATP content of HepG2 cells exposed to resazurin for 4 and 24 hours.

Figure 10: . Viability (ATP content) of HepG2 cells exposed to resazurin for 0, 4, and 24 hours.
Figure 10:

Viability (ATP content) of HepG2 cells exposed to resazurin for 0, 4, and 24 hours. Control wells did not contain resazurin. Zero hour wells contained resazurin and show quenching of luminescent signal following addition of the deeply blue colored resazurin (more...)
Commercial Availability

Commercial kits containing reagents to measure ATP are available from several vendors. For example:

CellTiter-Blue® Cell Viability Assay. Promega Corporation Cat.# G8081,
In Vitro Toxicology Assay Kit, Resazurin based. Sigma-Aldrich Cat.# TOX8-1KT,
alamarBlue®—Rapid & Accurate Cell Health Indicator. Life Technologies, Inc. Cat.# DAL1100
alamarBlue® AbD Serotech Cat.# BUF012B
Resazurin sodium salt. Sigma-Aldrich Cat.# R7017-1G
Resazurin powder is readily available from chemical vendors; however, the resazurin dye content (% purity) and contamination with resorufin can lead to variability in assay results and the need to perform validation of each lot of reagent powder. Viability assay kits containing performance verified resazurin as the primary ingredient are available from different vendors; but the resazurin concentration and additional ingredients vary. The alamarBlue patent US 5,501,959 describes the use of poising agents to maintain the redox potential of the growth medium and prevent reduction of resazurin resulting in background signal (30). Preferred poising agents described include ferricyanide and ferrocyanide as well as methylene blue which can also serve as a redox indicator. The potential for undesired effects of additional ingredients in the proprietary alamarBlue formulation and the demonstrated performance equivalence of less complex formulations of highly purified resazurin in balanced saline solution should be considered when choosing an assay reagent.

Reagent Preparation

1.
Dissolve high purity resazurin in DPBS (pH 7.4) to 0.15 mg/ml.

2.
Filter-sterilize the resazurin solution through a 0.2 μm filter into a sterile, light protected container.

3.
Store the resazurin solution protected from light at 4°C for frequent use or at -20°C for long term storage.

Resazurin Assay Protocol

1.
Prepare cells and test compounds in opaque-walled 96-well plates containing a final volume of 100 µl/well. An optional set of wells can be prepared with medium only for background subtraction and instrument gain adjustment.

2.
Incubate for desired period of exposure.

3.
Add 20 µl resazurin solution to each well.

4.
Incubate 1 to 4 hours at 37°C.

5.
Record fluorescence using a 560 nm excitation / 590 nm emission filter set.

A general disadvantage of both the tetrazolium and resazurin reduction assay protocols is the requirement to incubate the substrate with viable cells at 37°C for an adequate period of time to generate a signal. Incubation of the tetrazolium or resazurin reagents with viable cells increases the possibility of artifacts resulting from chemical interactions among the assay chemistry, the compounds being tested, and the biochemistry of the cell. Incubation also introduces an extra plate handling step that is not required for the ATP assay protocol described later. Extra plate manipulation steps increase the possibility of errors and are not desirable for automated assays for HTS.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แนวคิดการวิเคราะห์ลด ResazurinResazurin เป็นตัวบ่งชี้เซลล์ permeable redox ที่สามารถใช้เพื่อตรวจสอบหมายเลขเซลล์ทำงานได้กับโพรโทคอคล้ายกับผู้ใช้สาร tetrazolium (26) Resazurin สามารถละลายในบัฟเฟอร์สรีรวิทยา (เกิดปัญหาสีคราม) และเพิ่มโดยตรงกับเซลล์ในวัฒนธรรมในรูปแบบที่เป็นเนื้อเดียวกัน เซลล์ทำงานได้กับการเผาผลาญทำงานอยู่สามารถลด resazurin ในผลิตภัณฑ์ resorufin ซึ่งเป็นสีชมพูและฟลูออเรสเซนต์ (7 รูป)รูปที่ 7: การ โครงสร้างของพื้นผิว resazurin และผลิตภัณฑ์ resorufin สีชมพูเรืองแสงที่เกิดจากเซลล์ทำงานได้ลดลงรูปที่ 7:โครงสร้างของพื้นผิว resazurin และผลิตภัณฑ์ resorufin สีชมพูเรืองแสงที่เกิดจากเซลล์ทำงานได้ลดลงแห่ง acceptor การกลางของอิเล็กตรอนไม่จำเป็นสำหรับลด resazurin โทรศัพท์มือถือให้เกิดขึ้น แต่มันอาจเร่งสร้างสัญญาณ จำนวน resorufin ผลิตเป็นสัดส่วนกับจำนวนของเซลล์ทำงานได้ซึ่งสามารถ quantified fluorometer microplate ที่เพียบพร้อมไปด้วยที่ 560 nm ในการกระตุ้น / 590 ชุดกรองมลพิษ nm Resorufin ยังสามารถสามารถ quantified โดยวัดการเปลี่ยนแปลง absorbance อย่างไรก็ตาม ตรวจ absorbance ไม่มักใช้เนื่องจากมีความสำคัญมากน้อยกว่าวัด fluorescence วิเคราะห์ลด resazurin เป็นเล็กน้อยกว่า assays ลด tetrazolium และมีรายงานมากมายที่ใช้ทดสอบลด resazurin ในรูป miniaturized สำหรับเมอร์ (27)ระยะฟักตัวที่จำเป็นในการสร้างสัญญาณการเรืองแสงเพียงพอด้านบนพื้นหลังโดยปกติ 1 เป็น 4 ชั่วโมง และขึ้นอยู่กับกิจกรรมการเผาผลาญของเซลล์บางชนิด ความหนาแน่นเซลล์ต่อดี และเงื่อนไขการวิเคราะห์อื่น ๆ รวมถึงชนิดของสื่อวัฒนธรรม ระยะฟักตัวควรปรับให้เหมาะสม และเก็บสั้นเพียงพอที่จะหลีกเลี่ยงความเป็นพิษของรีเอเจนต์ แต่นานพอที่จะให้ไวพอประโยชน์หลักของการวิเคราะห์ลด resazurin จะว่า แพง ใช้รูปเหมือน และอ่อนไหวที่ tetrazolium assays เป็น นอกจากนี้ สามารถ multiplexed resazurin assays ด้วยวิธีอื่น ๆ เช่นการวัดกิจกรรม caspase เพื่อรวบรวมข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกที่นำไปสู่ cytotoxicity (28 และรูปที่ 8)รูปที่ 8: การ หมายเลขและ fluorometric caspase 3-ทดสอบเพื่อตรวจหาเครื่องหมายของ apoptosis เซลล์แผง A แสดงขั้นตอนของล็กตามลำดับของ resazurin เป็น assay การวัดได้รูปที่ 8:หมายเลขและ fluorometric caspase 3-ทดสอบเพื่อตรวจหาเครื่องหมายของ apoptosis เซลล์แผง A แสดงขั้นตอนของล็กตามลำดับของ resazurin เป็น assay การวัดได้ แผง B แสดงผลของการรักษาเซลล์ (มนุษย์ต่อมลูกหมาก) PC3 ด้วย (เพิ่มเติม...)มัลติเพล็กซ์แบบอาจต้องใช้โพรโทคอลตามลำดับเพื่อหลีกเลี่ยงสีที่ชุบ resazurin หรือสัญญาณทางเคมีโดยตรง การ multiplex ตัวอย่างแสดงในรูปที่ 8, resorufin fluorescence ต้องบันทึกก่อน ตาม ด้วยรีเอเจนต์ caspase ซึ่งประกอบด้วยผงซักฟอก lyse เซลล์ และลดสารเพื่อแปลง resazurin เหลือ และลดสัญญาณรบกวนกับการรวบรวมสัญญาณฟลูออเรสสอง แห่งข้อเสียของ resazurin รวมของเรืองแสงรบกวนจากสารที่มีการทดสอบและมัก overlooked ผลเป็นพิษโดยตรงในเซลล์ (รูปที่ 9)รูปที่ 9: การ เปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาเซลล์ NIH3T3 หลังจากสัมผัสกับ resazurinรูปที่ 9:เปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาเซลล์ NIH3T3 หลังจากสัมผัสกับ resazurin แผง A แสดงเขตข้อมูลของเซลล์ถ่ายทันทีหลังจากนี้โซลูชัน resazurin แผง B แสดงข้อมูลของเซลล์ที่ถ่ายหลังจาก 4 ชั่วโมงของการสัมผัสกับ resazurin (เพิ่มเติม...)บางโพรโทคออธิบายเปิดเผยเซลล์ resazurin สำหรับหลายชั่วโมง หรือทั้ง วัน อย่างไรก็ตาม ในบางระบบ เปลี่ยนแปลงสัณฐานวิทยาเซลล์จะสังเกตได้จากหลังจากเพียงไม่กี่ชั่วโมงของการสัมผัสที่แนะนำรบกวนเซลล์ปกติฟังก์ชัน (29) เป็นไปได้ว่าสัมผัสของเซลล์ resazurin จ้าแบบฟอร์มที่ลดลงของนิวคลีโอไทด์ในลักษณะ cytotoxic สัมผัสของเซลล์ resazurin มีชื่อเสียงในการลดปริมาณของ ATP ที่วัดเป็นเครื่องหมายของเซลล์ชีวิต รูปที่ 10 แสดงการลดลงของ ATP เนื้อหาของเซลล์ HepG2 resazurin สัมผัส 4 และ 24 ชั่วโมงรูปที่ 10: การ ชีวิต (เนื้อหา ATP) ของเซลล์ HepG2 สัมผัส resazurin 0, 4 และ 24 ชั่วโมงรูปที่ 10:ชีวิต (เนื้อหา ATP) ของเซลล์ HepG2 สัมผัส resazurin 0, 4 และ 24 ชั่วโมง ควบคุมบ่อไม่ประกอบด้วย resazurin ชั่วโมงศูนย์บ่ออยู่ resazurin และชุบดูสัญญาณ luminescent ต่อแห่ง resazurin สีฟ้าลึก (มากกว่า...)ความพร้อมใช้งานเชิงพาณิชย์ชุดพาณิชย์ reagents วัด ATP ที่ประกอบด้วยอยู่จากผู้ขายหลายราย ตัวอย่าง:บลู CellTiter ®เซลล์ชีวิตวิเคราะห์ บริษัท Promega Cat. # G8081ในหลอดพิษวิทยา Assay Kit, Resazurin ขึ้น ซิกมา-Aldrich Cat. # TOX8-1KTalamarBlue ® ซึ่งรวดเร็วและตัวบ่งชี้สุขภาพของเซลล์ที่ถูกต้อง DAL1100 # Cat. ชีวิตเทคโนโลยี incalamarBlue ® AbD Serotech Cat. # BUF012BResazurin เกลือโซเดียม ซิกมา-Aldrich Cat. # R7017 - 1Gผง Resazurin มีพร้อมจากผู้จัดจำหน่ายสารเคมี อย่างไรก็ตาม เนื้อหาสี resazurin (%บริสุทธิ์) และปนเปื้อนกับ resorufin อาจทำให้ความแปรผันในผลการทดสอบและต้องทำการตรวจสอบของแต่ละล็อตของรีเอเจนต์ผง ชุดทดสอบนี้ประกอบด้วยประสิทธิภาพตรวจสอบ resazurin เป็นส่วนผสมหลักจากผู้ขายรายต่าง ๆ แต่ resazurin ความเข้มข้นและส่วนผสมที่เพิ่มเติมแตกต่างกัน AlamarBlue สิทธิบัตรสหรัฐอเมริกา 5,501,959 อธิบายการใช้ poising ตัวแทนเพื่อรักษาศักยภาพ redox กลางการเจริญเติบโต และป้องกันการลดลงของ resazurin ในพื้นหลังสัญญาณ (30) ต้องการตัวแทน poising อธิบายรวม ferricyanide และ ferrocyanide ตลอดจนบลูเมทิลีนไดซึ่งยังสามารถใช้เป็นตัวบ่งชี้การ redox เป็นส่วนผสมเพิ่มเติมในกำหนดกรรมสิทธิ์ alamarBlue ผลไม่และเทียบเท่าแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของสูตรซับซ้อนน้อยของ resazurin ในสมดุลเกลือบริสุทธิ์สูงควรพิจารณาเมื่อเลือกรีเอเจนต์การทดสอบเตรียมรีเอเจนต์1ละลาย resazurin บริสุทธิ์สูงใน DPBS (pH 7.4) 0.15 mg/ml2กรองหมันโซลูชัน resazurin ผ่านตัวกรอง 0.2 μm เป็นคอนเทนเนอร์ป้องกันแสง ใส่3เก็บโซลูชัน resazurin ป้องกันจากแสง ที่ 4° C สำหรับการใช้งานบ่อย หรือ ที่-20 ° C ในระยะยาวโพรโทคอลการทดสอบ Resazurin1เตรียมเซลล์ และทดสอบสารประกอบในกำแพงทึบแสงดี 96 แผ่นประกอบด้วยปริมาตรสุดท้ายดี 100 µl ชุดตัวเลือกของบ่อสามารถเตรียมสื่อเฉพาะสำหรับการลบพื้นหลัง และเครื่องมือได้รับการปรับปรุง2ฟักต้องระยะเวลาเปิดรับแสง3เพิ่ม 20 µl resazurin โซลูชันดีละ4ฟัก 1-4 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส5Fluorescence ระเบียนที่ใช้ในการกระตุ้นเป็น nm 560 / 590 ชุดกรองมลพิษ nmข้อเสียทั่วไปของโพรโทคอวิเคราะห์ลด tetrazolium และ resazurin จะต้องฟักพื้นผิวเซลล์ทำงานได้ที่ 37° C เป็นระยะเวลาในการสร้างสัญญาณเพียงพอ คณะทันตแพทยศาสตร์ของ reagents tetrazolium หรือ resazurin เซลล์ทำงานได้เพิ่มความเป็นไปได้ของสิ่งประดิษฐ์ที่เกิดจากการโต้ตอบระหว่างเคมีวิเคราะห์ เคมีสารประกอบกำลังทดสอบ และชีวเคมีของเซลล์ คณะทันตแพทยศาสตร์ยังแนะนำจานพิเศษการจัดการขั้นตอนที่ไม่จำเป็นสำหรับโพรโทคอวิเคราะห์ ATP ที่อธิบายไว้ในภายหลัง ขั้นตอนการจัดการแผ่นเสริมเพิ่มความเป็นไปได้ของข้อผิดพลาด และไม่เหมาะ assays อัตโนมัติสำหรับ HTS.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Resazurin ลด Assay แนวคิดResazurin เป็นตัวบ่งชี้อกซ์ซึมผ่านมือถือที่สามารถใช้ในการตรวจสอบจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตกับโปรโตคอลที่คล้ายกับที่ใช้สาร tetrazolium นี้ (26) Resazurin สามารถละลายในบัฟเฟอร์สรีรวิทยา (ส่งผลในการแก้ปัญหาสีสีฟ้าเข้ม) และเพิ่มโดยตรงกับเซลล์ในวัฒนธรรมในรูปแบบที่เป็นเนื้อเดียวกัน เซลล์ทำงานได้กับการเผาผลาญอาหารที่ใช้งานสามารถลด resazurin ลงในผลิตภัณฑ์ resorufin ซึ่งเป็นสีชมพูและเรืองแสง (รูปที่ 7). รูปที่ 7: โครงสร้างของพื้นผิว resazurin และผลิตภัณฑ์ resorufin เรืองแสงสีชมพูที่เกิดจากการลดลงของเซลล์ที่มีชีวิต. รูปที่ 7:. โครงสร้างของพื้นผิว resazurin และผลิตภัณฑ์ resorufin เรืองแสงสีชมพูที่เกิดจากการลดลงของเซลล์ทำงานได้นอกจากนี้การรับอิเล็กตรอนกลางไม่จำเป็นต้องใช้สำหรับการลดresazurin โทรศัพท์มือถือ ที่จะเกิดขึ้น แต่มันอาจจะเร่งการสร้างสัญญาณ ปริมาณ resorufin ผลิตเป็นสัดส่วนกับจำนวนของเซลล์ที่มีศักยภาพที่สามารถวัดโดยใช้ fluorometer microplate พร้อมกับ 560 นาโนเมตรกระตุ้น / 590 นาโนเมตรปล่อยก๊าซชุดกรอง Resorufin นอกจากนี้ยังสามารถวัดโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงนั้น แต่การตรวจสอบการดูดกลืนแสงไม่ได้ใช้บ่อยเพราะมันอยู่ไกลน้อยที่มีความสำคัญกว่าการวัดเรืองแสง การทดสอบการลด resazurin เล็กน้อยความสำคัญมากขึ้นกว่าการตรวจลด tetrazolium และมีรายงานจำนวนมากโดยใช้การทดสอบการลด resazurin ในรูปแบบขนาดเล็กสำหรับการใช้งาน HTS (27). ระยะฟักตัวที่จำเป็นต้องใช้ในการสร้างสัญญาณเรืองแสงเพียงพอเหนือพื้นหลังมักจะ 1to 4 ชั่วโมง และขึ้นอยู่กับกิจกรรมการเผาผลาญของเซลล์ชนิดโดยเฉพาะอย่างยิ่งความหนาแน่นของเซลล์ที่ดีต่อการและเงื่อนไขการทดสอบอื่น ๆ รวมทั้งชนิดของอาหารเลี้ยง ระยะฟักตัวควรจะเพิ่มประสิทธิภาพและเก็บไว้สั้นพอที่จะหลีกเลี่ยงความเป็นพิษของสาร แต่นานพอที่จะให้ความไวเพียงพอ. ข้อดีที่สำคัญของการทดสอบการลด resazurin ที่ว่ามันคือราคาไม่แพงนักจะใช้รูปแบบที่เหมือนกันและมันก็เป็นความสำคัญมากขึ้นที่ tetrazolium การตรวจ นอกจากนี้การตรวจ resazurin สามารถ multiplexed ด้วยวิธีการอื่น ๆ เช่นการวัดกิจกรรม caspase เพื่อรวบรวมข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกที่นำไปสู่การเป็นพิษ (ที่ 28 และรูปที่ 8). รูปที่ 8: แผงแสดงให้เห็นขั้นตอนของหลายลำดับของการทดสอบ resazurin การวัดจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตและฟลูออโรเซ่ 3 การทดสอบเพื่อตรวจหาเครื่องหมายของการตายได้. รูปที่ 8: แผงแสดงให้เห็นขั้นตอนของหลายลำดับของการทดสอบ resazurin ในการวัด จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตและฟลูออโรเซ่ 3 การทดสอบเพื่อตรวจหาเครื่องหมายของการตาย แผง B แสดงให้เห็นถึงผลของการรักษา PC3 (มนุษย์ต่อมลูกหมาก) เซลล์ที่มีช่วงของการ (เพิ่มเติม ... ) คำMultiplexing อาจต้องใช้โปรโตคอลตามลำดับเพื่อหลีกเลี่ยงการดับ resazurin สีโดยการแทรกแซงหรือสารเคมีโดยตรง ตัวอย่างเช่นหลายที่แสดงในรูปที่ 8 เรืองแสง resorufin ต้องถูกบันทึกไว้ก่อนตามด้วยการเพิ่มขึ้นของสาร caspase ที่มีผงซักฟอก lyse เซลล์และลดสารการแปลง resazurin ที่เหลืออยู่และลดการรบกวนกับการเก็บรวบรวมสัญญาณเรืองแสงที่สอง. ข้อเสียของ resazurin รวมเป็นไปได้ของการรบกวนจากสารเรืองแสงถูกทดสอบและมักจะมองข้ามความเป็นพิษโดยตรงต่อเซลล์ (รูปที่ 9). รูปที่ 9: การเปลี่ยนแปลงในลักษณะทางสัณฐานวิทยาเซลล์ NIH3T3 หลังจากที่สัมผัสกับ resazurin. รูปที่ 9: การเปลี่ยนแปลงลักษณะทางสัณฐานวิทยาเซลล์ NIH3T3 หลังจากที่สัมผัสกับ resazurin แผงแสดงให้เห็นด้านการถ่ายภาพเซลล์ทันทีหลังจากที่นอกเหนือจากการแก้ปัญหา resazurin แผง B แสดงให้เห็นเขตข้อมูลเดียวกันของเซลล์ถ่ายภาพหลังจาก 4 ชั่วโมงของการสัมผัสกับ resazurin (เพิ่มเติม ... ) โปรโตคอลบางคนอธิบายเปิดเผยเซลล์ resazurin เป็นเวลาหลายชั่วโมงหรือแม้กระทั่งวัน อย่างไรก็ตามในบางระบบการเปลี่ยนแปลงในลักษณะทางสัณฐานวิทยาเซลล์สามารถสังเกตได้หลังจากนั้นเพียงไม่กี่ชั่วโมงของการเปิดรับการรบกวนบอกกับการทำงานของเซลล์ปกติ (29) มันเป็นไปได้ว่าการได้รับของเซลล์ที่จะบั่นทอน resazurin รูปแบบที่ลดลงของนิวคลีโอส่งผลให้ผลกระทบที่เป็นพิษ การเปิดรับข่าวสารของเซลล์ที่จะ resazurin เป็นที่รู้จักกันเพื่อลดปริมาณของเอทีพีวัดเป็นเครื่องหมายของความมีชีวิตเซลล์ รูปที่ 10 แสดงให้เห็นถึงการลดลงของเอทีพีเนื้อหาของเซลล์ HepG2 สัมผัสกับ resazurin 4 และ 24 ชั่วโมง. รูปที่ 10: มีชีวิต (ATP เนื้อหา) ของเซลล์ HepG2 สัมผัสกับ resazurin 0, 4, และ 24 ชั่วโมง. รูปที่ 10: ความแข็งแกร่งทางการเงิน (เอทีพีเนื้อหา) ของเซลล์ HepG2 สัมผัสกับ resazurin 0, 4, และ 24 ชั่วโมง หลุมควบคุมไม่ได้มี resazurin ศูนย์หลุมชั่วโมงมี resazurin ดับและการแสดงของสัญญาณเรืองแสงดังต่อไปนี้การเพิ่มขึ้นของ resazurin สีฟ้าลึก (เพิ่มเติม ... ) การวางจำหน่ายชุดพาณิชย์ที่มีสารเคมีในการวัดเอทีพีที่มีอยู่จากผู้ขายหลาย ตัวอย่างเช่นCellTiter-Blue®เซลล์มีชีวิต Assay Promega คอร์ปอเรชั่นแมว. # G8081, ในหลอดทดลองพิษวิทยา Assay ชุด Resazurin ตาม แมว Sigma-Aldrich. # TOX8-1KT, alamarBlue®-อย่างรวดเร็วและสุขภาพของเซลล์ที่ถูกต้องตัวบ่งชี้ ไลฟ์เทคโนโลยีส์อิงค์แมว. # DAL1100 alamarBlue®อับดุล Serotech แมว. # BUF012B เกลือโซเดียม Resazurin . Sigma-Aldrich แมว # R7017-1G ผง Resazurin สามารถใช้ได้อย่างง่ายดายจากผู้ขายเคมี แต่เนื้อหาที่ย้อม resazurin (ความบริสุทธิ์%) และการปนเปื้อนกับ resorufin สามารถนำไปสู่ความเปลี่ยนแปลงของผลการทดสอบและจำเป็นที่จะต้องดำเนินการตรวจสอบจำนวนมากของผงสารแต่ละ ชุดทดสอบความมีชีวิตที่มีประสิทธิภาพการทำงานที่มีการยืนยัน resazurin เป็นส่วนผสมหลักที่มีอยู่จากผู้ขายที่แตกต่างกัน แต่ความเข้มข้น resazurin และส่วนผสมที่แตกต่างกันเพิ่มเติม 5,501,959 สิทธิบัตร alamarBlue สหรัฐอธิบายการใช้ poising ตัวแทนเพื่อรักษาศักยภาพรีดอกซ์ของกลางการเจริญเติบโตและป้องกันไม่ให้เกิดการลดลงของ resazurin ส่งผลให้สัญญาณพื้นหลัง (30) ตัวแทน poising ที่ต้องการรวมถึงอธิบาย ferricyanide ferrocyanide และเช่นเดียวกับสีฟ้าเมทิลีนซึ่งยังสามารถทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่อกซ์ ที่อาจเกิดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์สำหรับส่วนผสมเพิ่มเติมในการกำหนด alamarBlue ที่เป็นกรรมสิทธิ์และความเท่าเทียมกันแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการทำงานของสูตรที่ซับซ้อนน้อยกว่าของ resazurin บริสุทธิ์สูงในน้ำเกลือที่สมดุลควรพิจารณาเมื่อเลือกน้ำยาทดสอบ. Reagent เตรียม1. ละลายความบริสุทธิ์สูง resazurin ใน DPBS ( ค่า pH 7.4) 0.15 มก. / มล. 2. กรองฆ่าเชื้อแก้ปัญหา resazurin ผ่าน 0.2 ไมครอนกรองเป็นหมันแสงการป้องกันภาชนะ. 3. ร้าน resazurin วิธีการแก้ปัญหาที่มีการป้องกันจากแสงที่ 4 ° C สำหรับการใช้งานบ่อยหรือที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสสำหรับการจัดเก็บระยะยาว. Resazurin Assay พิธีสาร1. เตรียมเซลล์และสารทึบแสงในการทดสอบผนังแผ่น 96 หลุมที่มีปริมาณสุดท้ายของ 100 ไมโครลิตร / ดี ชุดตัวเลือกของหลุมสามารถจัดทำที่มีขนาดกลางเฉพาะสำหรับการลบพื้นหลังและเครื่องมือที่ใช้ในการปรับกำไร. 2. ฟักไข่ในช่วงเวลาที่ต้องการการสัมผัส. 3. เพิ่ม 20 ไมโครลิตรวิธีการแก้ปัญหาให้กับแต่ละ resazurin กัน. 4. ฟัก 1-4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส . 5. บันทึกการเรืองแสงใช้ 560 นาโนเมตรกระตุ้น / 590 นาโนเมตรปล่อยก๊าซชุดกรอง. ข้อเสียทั่วไปของทั้งสอง tetrazolium และโปรโตคอลทดสอบ resazurin ลดความต้องการในการฟักไข่ที่มีพื้นผิวเซลล์ที่ทำงานได้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นระยะเวลาที่เพียงพอของเวลาที่จะ สร้างสัญญาณ บ่มเพาะของสารเคมีหรือ tetrazolium resazurin กับเซลล์ทำงานได้เพิ่มความเป็นไปได้ของสิ่งประดิษฐ์ที่เกิดจากสารเคมีที่มีปฏิสัมพันธ์ในหมู่ทดสอบทางเคมีที่สารที่ถูกทดสอบและชีวเคมีของเซลล์ บ่มเพาะยังแนะนำจานพิเศษจัดการขั้นตอนที่ไม่จำเป็นสำหรับโปรโตคอลการทดสอบเอทีพีอธิบายต่อไป ขั้นตอนการจัดการจานพิเศษที่เพิ่มความเป็นไปได้ของข้อผิดพลาดและไม่พึงประสงค์สำหรับการตรวจอัตโนมัติสำหรับ HTS

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การใช้แนวคิดรีซาซูริน

รีซาซูรินเป็นเซลล์ซึม 1 ตัวบ่งชี้ที่สามารถใช้ในการตรวจสอบได้เบอร์มือถือกับโปรโตคอลที่คล้ายคลึงกับที่ใช้ tetrazolium สารประกอบ ( 26 ) รีซาซูรินสามารถละลายบัฟเฟอร์ทางสรีรวิทยา ( ส่งผลให้ลึกสีฟ้าโซลูชั่น ) และเพิ่มโดยตรงกับเซลล์ในวัฒนธรรมในรูปแบบเป็นเนื้อเดียวกันใช้งานได้กับเซลล์เมแทบอลิซึมสามารถลดรีซาซูรินใน resorufin ผลิตภัณฑ์ซึ่งเป็นสีชมพูและเรืองแสง ( รูปที่ 7 ) .

รูปที่ 7 : . โครงสร้างของรีซาซูริน ( สีชมพูเรืองแสง resorufin ผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการใช้เซลล์


รูปที่ 7 : โครงสร้างของรีซาซูริน ( สีชมพูเรืองแสง resorufin ผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการใช้เซลล์
นอกจากนี้ของพระนาสิกอิเล็กตรอนกลางไม่จําเป็นสําหรับมือถือรีซาซูรินลดที่เกิดขึ้น แต่มันอาจจะเร่งการสร้างสัญญาณ ปริมาณของ resorufin ผลิตเป็นสัดส่วนกับจำนวนเซลล์ได้ ซึ่งสามารถวัดได้โดยใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยฟลู โรมิเตอร์พร้อมกับ 560 nm กระตุ้น / 590 nm การตั้งค่ากรองresorufin ยังสามารถวัดได้โดยการวัดการดูดกลืนแสงเปลี่ยนแปลง อย่างไรก็ตาม การตรวจหาค่าไม่ได้ใช้บ่อยๆ เพราะมันไกลสำคัญน้อยกว่าการวัดการเรืองแสง . การรีซาซูรินลด assay อ่อนไหวเล็กน้อยกว่าวิธีลด tetrazolium และมีรายงานมากมายที่ใช้ในการรีซาซูรินการทดสอบขนาดเล็กรูปแบบ hts งาน

( 27 )4 ระยะเวลาในการสร้างสัญญาณดังกล่าวข้างต้นมักจะเพียงพอเรืองแสงพื้นหลัง 1to 4 ชั่วโมงขึ้นอยู่กับกิจกรรมการเผาผลาญอาหารของชนิดเซลล์โดยเฉพาะเซลล์ที่ความหนาแน่นต่ออย่างดีและเงื่อนไขการทดสอบอื่น ๆรวมถึงชนิดของสื่อวัฒนธรรมระยะเวลาที่ควรจะปรับให้เหมาะสม และเก็บไว้สั้น ๆพอที่จะหลีกเลี่ยงสารเคมีพิษ แต่ยาวพอที่จะให้ความไวเพียงพอ

ข้อดีหลักของการใช้รีซาซูรินว่ามันแพง มันใช้รูปแบบเป็นเนื้อเดียวกัน และมีความอ่อนไหวที่ tetrazolium ) . นอกจากนี้รีซาซูรินสามารถมัลติเพลกซ์หรือด้วยวิธีการอื่นๆ เช่น การวัดกิจกรรมแคสเปสเพื่อรวบรวมข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกที่นำไปสู่ความเป็นพิษ ( 28 รูปที่ 8 ) .

รูปที่ 8 : . แผงแสดงขั้นตอนของระบบมัลติเพล็กซ์ของรีซาซูริน ( วัดเบอร์ที่ทำงานและ 3-assay แคสเปส fluorometric ตรวจสอบเครื่องหมายของปกติ


รูปที่ 8 :แผงแสดงขั้นตอนของระบบมัลติเพล็กซ์ของรีซาซูริน ( วัดเบอร์ที่ทำงานและ 3-assay แคสเปส fluorometric ตรวจสอบเครื่องหมายของการตาย . แผง B จะแสดงผลของการรักษาด้วยเซลล์ ( ต่อมลูกหมากของมนุษย์ ) กับช่วงของ ( . . . )
อาจต้องใช้โปรโตคอลแบบมัลติเพื่อหลีกเลี่ยงสีชุบด้วยรีซาซูรินหรือการรบกวนสารเคมีโดยตรงตัวอย่างเช่นระบบมัลติเพล็กซ์ แสดงในรูปที่ 8 , resorufin เรืองแสงต้องบันทึกไว้ก่อน ตามด้วยการเพิ่มของแคสเปสต์ซึ่งมีผงซักฟอกเพื่อทำให้เซลล์และลดสารประกอบเพื่อแปลงที่เหลือรีซาซูรินและลดการรบกวนกับการเก็บรวบรวมสัญญาณฟลูออเรสเซนต์สอง

ข้อเสียของรีซาซูริน รวมถึงความเป็นไปได้ของการแทรกแซงจากสารเรืองแสงที่ถูกทดสอบ และมักจะมองข้ามผลเป็นพิษโดยตรงต่อเซลล์ ( รูปที่ 9 ) .

รูปที่ 9 : . การเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างเซลล์ nih3t3 หลังจากการเปิดรับรีซาซูริน .

รูปที่ 9 : การเปลี่ยนแปลงใน nih3t3 รูปร่างของเซลล์หลังการรีซาซูริน .แผงแสดงข้อมูลของเซลล์ถ่ายภาพทันทีหลังจากเพิ่มของโซลูชั่นรีซาซูริน . แผง B แสดงเขตข้อมูลเดียวกันของเซลล์ถ่ายภาพหลังจากสี่ชั่วโมงของการเปิดรับรีซาซูริน . ( . . . )
บางโปรโตคอลอธิบายเปิดเผยเซลล์รีซาซูรินเป็นเวลาหลายชั่วโมงหรือแม้กระทั่งวัน อย่างไรก็ตาม ในบางระบบการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์สามารถสังเกตได้หลังจากเพียงไม่กี่ชั่วโมงของแสงจะรบกวนกับหน้าที่ของเซลล์ปกติ ( 29 ) มันเป็นไปได้ที่การเซลล์ รีซาซูริน depletes ลดลงรูปแบบขนาดผลในผลที่เป็นพิษ . การเปิดรับของเซลล์ รีซาซูรินเป็นที่รู้จักกันเพื่อลดปริมาณ ATP วัดเป็นเครื่องหมายของเซลล์ .รูปที่ 10 แสดงการลดลงของเอทีพี เนื้อหาของเซลล์มะเร็งตับเปิดรับรีซาซูรินได้ 4 ชั่วโมงและ 24 ชั่วโมง

รูปที่ 10 : . ความมีชีวิต ( ATP เนื้อหา ) ของเซลล์มะเร็งตับเปิดรับรีซาซูริน 0 , 4 และ 24 ชม.


รูปที่ 10 : 1 ( ATP เนื้อหา ) ของเซลล์มะเร็งตับเปิดรับรีซาซูริน 0 , 4 และ 24 ชั่วโมง บ่อควบคุมไม่ได้มีรีซาซูริน .เวลส์ศูนย์ชั่วโมงมีรีซาซูรินและแสดงดับสัญญาณต่อไปนี้ซึ่งเรืองแสงสีฟ้าลึกรีซาซูริน ( . . . )

พาณิชย์พาณิชย์พร้อมชุดประกอบด้วยสารเคมีในการวัด ATP ที่มีอยู่จากหลายผู้ขาย ตัวอย่าง :

celltiter สีฟ้า®เซลล์แบคทีเรีย บริษัท promega แมว # g8081
, ในชุดการทดสอบพิษวิทยาการรีซาซูรินตามAldrich ซิกม่า แมว # tox8-1kt
alamarblue , ® - อย่างรวดเร็ว&ถูกต้องเซลล์สุขภาพตัวบ่งชี้ เทคโนโลยีไลฟ์ แมว # dal1100
alamarblue ®อับดุล serotech แมว # buf012b
รีซาซูรินโซเดียม เกลือ Aldrich ซิกม่า แมว # r7017-1g
รีซาซูริน ผง จะพร้อมใช้งานจากผู้ขายสารเคมี อย่างไรก็ตามการรีซาซูรินย้อมเนื้อหา ( % ความบริสุทธิ์ ) และการปนเปื้อนกับ resorufin สามารถนำไปสู่ความผันแปรในผลการทดสอบ และต้องดำเนินการตรวจสอบในแต่ละมากของสารเคมีชนิดผง วิธีที่มีประสิทธิภาพของชุดตรวจสอบ รีซาซูรินเป็นส่วนผสมหลักได้จากผู้ขายที่แตกต่างกัน แต่รีซาซูรินเข้มข้นและส่วนผสมเพิ่มเติมแตกต่างกันไป การ alamarblue เราสิทธิบัตร 5501959 อธิบายการใช้ poising ตัวแทนเพื่อรักษาศักยภาพรีดอกซ์ของอาหารเลี้ยงเชื้อและป้องกันการรีซาซูรินที่เกิดขึ้นในสัญญาณพื้นหลัง ( 30 ) ต้องการ poising ตัวแทนอธิบายรวมเฟอร์ริกไซนาไนด์ และเฟอร์โรไซยาเนทเป็นสีฟ้าซึ่งสามารถใช้เป็น 1 ตัวบ่งชี้ที่มีศักยภาพสำหรับผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ของการเพิ่มส่วนผสมในสูตร และแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่เป็นกรรมสิทธิ์ alamarblue การซับซ้อนน้อยกว่าการรีซาซูรินบริสุทธิ์สูงในเกลือที่สมดุลควรพิจารณาเมื่อเลือกใช้สารเคมีทำปฏิกิริยาการเตรียม



1
ละลายความบริสุทธิ์สูงรีซาซูรินใน dpbs ( pH 7.4 ) 0.15 มก. / มล.


2กรองฆ่าเชื้อโรค โซลูชั่น รีซาซูรินผ่านμ 0.2 M กรองลงในภาชนะปลอดเชื้อ ป้องกันแสง

3
เก็บรีซาซูรินโซลูชั่นป้องกันแสง 4 ° C ใช้บ่อยหรือที่ - 20 ° C สำหรับการจัดเก็บระยะยาว รีซาซูริน (
3

1 .
เตรียมเซลล์และสารทดสอบ ในผนังทึบ 96 ดีจานที่มีปริมาตรสุดท้ายของ 100 µ L / ดีการตั้งค่าตัวเลือกของบ่อน้ำสามารถเตรียมขนาดกลางเท่านั้นสำหรับการลบพื้นหลังและการปรับเพิ่มอุปกรณ์ .

2
ฟักไข่สำหรับระยะเวลาที่ต้องการของแสง

3
เพิ่ม 20 µผมรีซาซูริน โซลูชั่น กัน

4
ฟักไข่ 1 ถึง 4 ชั่วโมง 37 ° C .

5
การบันทึกโดยใช้ 560 nm กระตุ้น / 590 nm การตั้งค่ากรอง .

ข้อจำกัดทั่วไปของทั้ง tetrazolium รีซาซูรินการทดสอบโปรโตคอลและการเป็นสิ่งจำเป็นที่จะบ่มเพาะกับเซลล์ตั้งต้นที่ 37 ° C ได้มีระยะเวลาในการสร้างสัญญาณ การบ่มเพาะของ tetrazolium หรือรีซาซูรินสารเคมีกับเซลล์ได้เพิ่มความเป็นไปได้ของสิ่งประดิษฐ์ที่เกิดจากปฏิกิริยาทางเคมีระหว่างการทดสอบทางเคมีสารประกอบที่ถูกทดสอบ และชีวเคมีในเซลล์ บ่มเพาะยังแนะนำเสริมแผ่นการจัดการขั้นตอนที่ไม่จําเป็นสําหรับเอทีพีการทดสอบโปรโตคอลที่อธิบายไว้ในภายหลัง ขั้นตอนการจัดการจานพิเศษเพิ่มความเป็นไปได้ของข้อผิดพลาดและไม่พึงประสงค์แบบอัตโนมัติใช้สำหรับ hts .