Cell cultureHuman alveolar adenocar

Cell culture
Human alveolar adenocarcinoma cells (A549) from passages four to six were used for the experiments. This cell line was used due to the constitutively expression of bradykinin receptors. Cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10 % of fetal bovine serum at 37 °C. Cells were grown to confluence in 6-well plates and incubated in 2 ml of serum-free medium for 24 h. Cells were treated with vehicle, bradykinin (20 nM), bradykinin + the B2 receptor antagonist HOE-140 (1 μM), or bradykinin + the B1 receptor antagonist Lys (Des-Arg9-Leu8) bradykinin (1 μM). At the end of the treatment, culture medium was collected, centrifuged at 2500 g for 10 min, and stored at −80 °C. Cells were washed three times with PBS, scraped into PBS, and centrifuged for 5 min at 600xg. Cells were re-suspended in 250 μl of ice-cold sodium phosphate (100 mM, pH 6.5) and sonicated on ice. Cell lysate (220 μl) was mixed with 220 μl of perchloric acid (1.2 M), centrifuged at 2000 g for 10 min at 4 °C, and the supernatant collected and stored at −80 °C until further processing. Data was normalized by total protein content in the cells lysate and measured with the Pierce® BCA kit (Thermo Scientific, Rockford IL) according the manufacturer protocol.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพาะเลี้ยงเซลล์เซลล์มะเร็งชนิดต่อมเสียงมนุษย์ (A549) จากทางเดินสี่ถึงหกถูกใช้สำหรับการทดลอง ใช้บรรทัดนี้เซลล์เนื่องการ constitutively ค่าของ bradykinin receptors เซลล์มีอ่างใน DMEM เสริม ด้วย 10% ของซีรั่มวัวครรภ์ที่ 37 องศาเซลเซียส เซลล์โตบรรจบในดี 6 แผ่น และ incubated ใน 2 ml ของกลางฟรีเซรั่มสำหรับเซลล์ 24 h. ได้รับยานพาหนะ bradykinin (20 nM), bradykinin + ที่ B2 นิสต์จอบ-140 (1 μM), หรือ bradykinin + B1 ตัวรับปฏิปักษ์ Lys (Des Arg9 Leu8) bradykinin (1 μM) เมื่อสิ้นสุดการรักษา สื่อวัฒนธรรมรวบรวม centrifuged ที่ 2500 g สำหรับ 10 นาที และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส เซลล์ถูกล้างสามครั้ง ด้วย PBS ขูดใน PBS และ centrifuged ใน 5 นาทีที่ 600xg เซลล์ถูกหยุดชั่วคราวอีกครั้งใน μl 250 ของฟอสเฟตโซเดียมฉ่ำ (100 มม. pH 6.5) และ sonicated บนน้ำแข็ง เซลล์ lysate (220 μl) ที่ผสมกับ μl 220 ของกรด perchloric (1.2 เมตร), centrifuged ที่ g 2000 สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C และ supernatant รวบรวม และเก็บไว้ที่ −80 ° C จนประมวลผลต่อไป ข้อมูลได้ตามปกติ โดยโปรตีนรวมเนื้อหาในเซลล์ lysate และวัดกับชุด BCA ®เพียร์ซ (วิทยาศาสตร์เทอร์โม IL ร็อคฟอร์ด) ตามโพรโทคอลผู้ผลิต

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเพาะเลี้ยงเซลล์ของมนุษย์เซลล์มะเร็งของต่อมถุง (A549) จากทางเดิน 4-6 ถูกนำมาใช้สำหรับการทดลอง
สายพันธุ์ของเซลล์นี้ถูกใช้เนื่องจากการแสดงออกของตัวรับ constitutively bradykinin เซลล์ที่ถูกเพาะเลี้ยงในระดับปานกลาง DMEM เสริมด้วย 10% ของซีรั่มของทารกในครรภ์วัวที่ 37 ° C เซลล์ที่ถูกปลูกไปบรรจบในแผ่น 6 ดีและบ่มใน 2 มิลลิลิตรของกลางซีรั่มฟรีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการรักษากับยานพาหนะ, bradykinin (20 นาโนเมตร) bradykinin + ศัตรูรับ B2 HOE-140 (1 ไมครอน) หรือ bradykinin + ตัวรับ B1 ศัตรูลิซ (เด-Arg9-Leu8) bradykinin (1 ไมครอน) ในตอนท้ายของการรักษากลางวัฒนธรรมได้รับการเก็บรวบรวมหมุนเหวี่ยงที่ 2,500 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส เซลล์ที่ถูกล้างสามครั้งกับพีบีเอสที่คัดลอกมาลงในพีบีเอสและปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 600xg เซลล์ที่ถูกระงับอีกครั้งใน 250 ไมโครลิตรของโซเดียมฟอสเฟตเย็น (100 มิลลิค่า pH 6.5) และ sonicated บนน้ำแข็ง lysate เซลล์ (220 ไมโครลิตร) ผสมกับ 220 ไมโครลิตรของกรดเปอร์คลอริก (1.2 ล้าน), หมุนเหวี่ยงที่ 2,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและใสที่เก็บรวบรวมและจัดเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนกว่าจะประมวลผลต่อไป ข้อมูลปกติโดยรวมปริมาณโปรตีนในเซลล์ lysate และวัดที่มีชุดPierce® BCA (เทอร์โมวิทยาศาสตร์, ฟอร์ด IL) ตามโปรโตคอลผู้ผลิต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์วัฒนธรรม
มนุษย์เบ้า adenocarcinoma เซลล์ ( a549 ) จากหัวข้อสี่ถึงหกที่ใช้สำหรับการทดลอง เซลล์นี้ถูกใช้เนื่องจากการ constitutively : การแสดงออกของตัวรับ . เซลล์เพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย dmem 10% ของทารกในครรภ์และเซรั่มที่ 37 องศา เซลล์ปลูก 6-well บรรจบในจานและบ่มใน 2 มิลลิลิตร serum-free ปานกลางเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเซลล์จะถูกกับรถ แบรดีไคนิน ( 20 nm ) :   ที่ B2 receptor antagonist hoe-140 ( 1 μ M ) หรือ  :  ที่ B1 receptor antagonist . ( des-arg9-leu8 ) แบรดีไคนิน ( 1 μ M ) ในตอนท้ายของการรักษา , อาหารเลี้ยงเชื้อก็เก็บระดับที่ 2500 กรัม เป็นเวลา 10 นาที และอุณหภูมิ− 80 องศา เซลล์มีซักครั้งที่สามกับพีบีเอส ขูดออกเป็นพีบีเอสไฟฟ้าสำหรับ 5 นาทีที่ 600xg . เซลล์ก็จะหยุดชั่วคราวใน 250 ลิตรโซเดียมฟอสเฟตμน้ำแข็งเย็น ( 100 มม. , pH 6.5 ) และ sonicated บนน้ำแข็ง เซลล์ lysate ( 220 μลิตร ) ผสมกับ 220 μลิตรเปอร์คลอริกแอซิด ( 1.2 เมตร ) ระดับที่ 2000 G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C และนำข้อมูลที่เก็บไว้ที่ 80 °− C จนกระทั่งการประมวลผลต่อไปข้อมูลมาตรฐาน โดยปริมาณโปรตีนทั้งหมดในเซลล์ lysate และวัดกับแทง® BCA Kit ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Rockford IL ) ตามที่ผู้ผลิตโปรโตคอล